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L ABORATORIO I
MICROBIOLOGIA
ESCUELA TÉCNICA ORT
4º QUÍMICA – 2011
Profesora: Analía Álvarez
MICROSCOPIA
La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles
demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. El microscopio (de micro,
pequeño, y scopio, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son
demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se
inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o
varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto.
El microscopio óptico tiene los siguientes Sistemas o partes:
1.- SISTEMA MECÁNICO:
a) Soporte
- Brazo
- Base ó pie
b) Tubo del ocular
c) Cabezal
d) Revolver
e) Platina
f) Tornillos de enfoque:
- Tornillo macrométrico
- Tornillo micrométrico
2.- SISTEMA ÓPTICO:
a) Ocular
b) Objetivo
3.- SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
a) Condensador
b) Diafragma
c) Fuente de Luz
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Esterilización
Generalidades

Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un
objeto o sustancia.

Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es
seguro para la salud de la población.

Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies
inanimadas.

Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos
potencialmente patógenos sobre la piel (sólo pueden aplicarse externamente sobre
seres vivos).
Agentes antibacterianos esterilizantes y/o desinfectantes
1. 1.
Provocan pérdida de la viabilidad en los microorganismos

Físicos (calor, radiaciones)

Químicos (óxido de etileno, formaldehído, agentes oxidantes,
soluciones antisépticas.)
2. 2.
Provocan una separación de los microorganismos de la sustancia
líquida
 
Filtración (se eliminan los microorganismos presentes en un fluido).


Agentes Físicos
Calor
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El
calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas
y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos.
La efectividad del calor como método de esterilización depende de:


Temperatura
Tiempo de exposición
Calor Húmedo
El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas.

El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para
esterilizar medios de cultivos y soluciones. Una temperatura de 121 °C (una
atmósfera de presión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para
destruir organismos formadores de esporas.
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Calor Seco
El calor seco produce desecación de la célula, efectos y fusión de membranas. Estos efectos
se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están
en contacto con éstos. El aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en
materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor
temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.
La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por
calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que el autoclave. La
temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A
140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren
al menos 2 horas de exposición.
Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a
más de 160°C.
Radiaciones
Su acción depende de:



Tipo de radiación
Tiempo de exposición
Dosis
Ionizantes
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras
proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles
(termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por
sus costos.
No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones
de los componentes.
Ultravioletas
Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de
pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la
viabilidad de las células.
Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.
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Agentes Químicos
Dentro de los compuestos
desinfectantes y antisépticos.
químicos
podemos
encontrar
agentes
esterilizantes,
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan.

Concentración: varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma
concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos
microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma,
por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

pH: la mayoría de los microorganismos son susceptibles a un cambio considerable
de pH en su medio.
Filtración
Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro
dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Hay que tener en cuenta que los
filtros que se utilizan generalmente en los laboratorios no retienen virus, están en el límite
de separación según el diámetro de poro que se utilice.
La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para
esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones
intravenosas, drogas diagnósticas, medios para cultivos celulares, y soluciones de
antibióticos y vitaminas.
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Crecimiento Microbiano
Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos.
Dentro de los requisitos físicos encontramos dos factores muy importantes: La temperatura
y el pH.
Temperatura
El patrón de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la temperatura. La
temperatura de crecimiento óptimo permite el crecimiento más rápido de las bacterias
durante un período de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mínima
de crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer. La
Temperatura de crecimiento máximo es la temperatura mayor en la cual el crecimiento
es posible. Los microorganismos se dividen en 3 grandes grupos en base a su preferencia
de rango de temperatura.
Los Psicrófilos, que son capaces de crecer entre -5° y 30°C, pero tienen una temperatura
óptima entre 10°C y 20°C. Los psicrófilos estrictos mueren si se exponen a temperatura
ambiente. Un ejemplo de psicrófilos estrictos son las bacterias que crecen en la Antártida.
Aún a una temperatura óptima estas bacterias tardan en crecer de 2 a 3 semanas.
Mesófilos, crecen entre 10 y 45°C, siendo la óptima entre 20 y 40°C. Aquí encontramos
los patógenos de humanos y de animales de sangre caliente, éstos crecen mejor a 37°C.
Termófilos, se desarrollan entre 25 y 80°C, siendo la óptima 50 y60°C. Los Termófilos
extremos crecen a una temperatura mayor de 80°C.
pH
Se clasifican en:
Acidófilos: Se desarrollan a pH entre 1.0 y 5.4
Neutrófilos: Se desarrollan a pH entre 5.5 y 8.5
Basófilos: Se desarrollan pH entre 8.6 y 10.0
El pH óptimo es aquel que permite el mayor crecimiento microbiano en menor tiempo.
Requisitos Químicos
Carbono, todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares. Las
bacterias pueden obtener C de gran parte de los compuestos orgánicos presentes en el
medio en el que se encuentran.
Nitrógeno, azufre y fósforo. Estos elementos se requieren para la síntesis de DNA, RNA,
proteínas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrógeno (N) ya sea fijándolo directamente
de la atmósfera, o de compuestos inorgánicos que contengan N como nitritos, nitratos,
sales de amonio o amino ácidos. Las bacterias pueden obtener azufre de iones sulfato,
sulfito y amino ácidos con azufre. El fósforo, que es esencial para la síntesis de ácidos
nucleicos y membranas celulares, puede obtenerse de compuestos inorgánicos que
contengan P.
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Oxígeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida
requieren oxígeno para llevar a cabo la respiración aeróbica. Los microorganismos que
utilizan oxígeno molecular son llamados aeróbios estrictos ya que requieren
indispensablemente de oxígeno para vivir. En cambio, los aeróbios facultativos utilizan
el oxígeno molecular cuando está presente, pero en su ausencia continúan su crecimiento
por la vía de fermentación o respiración anaeróbica. Los microaerófilos sólo pueden
crecer en concentraciones de oxígeno molecular menor a las encontradas en el aire. Los
Anaerobios estrictos se desarrollan en ausencia total de O2. Los
Anaerobios Facultativos pueden desarrollarse en presencia o ausencia de O2, aunque
predominan en medios anaeróbicos.
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Medios de Cultivo
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El
material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como
son: la temperatura, la humedad y presión de oxígeno, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Según
qué microorganismo se quiera cultivar, el medio requerirá determinadas condiciones.
Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser
preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido o líquido. En este último
caso utilizamos, generalmente, la denominación de caldo de cultivo.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licua completamente a partir de los 80 grados y se solidifica al enfriarse a 40
grados o menos.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, peptonas, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y
para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar,
por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de un grupo de
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido. El Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoría de bacterias Gram-positivas).
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por
una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como
mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de
estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar
peptona que, además, representa una fuente de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de
los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen
capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno
presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos
medios sustancias como suero, sangre, bilis, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio
y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
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2- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos
como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o
sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero
hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el
laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los
microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una
atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión
de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible
para un buen desarrollo de las células microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia
de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos
fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.
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7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 20 y 40ºC,
los psicrófilos entre 10 y 20 C° y los termófilos entre 50 y 60 ºC.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo deben estar perfectamente estériles para evitar la aparición de
formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios.
Tipos de medios de cultivo
Según su uso, los podemos clasificar en:

Generales: permiten el crecimiento de una amplia variedad de organismos.
Ej: Agar Nutritivo, Agar PCA.

Selectivos: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupo
determinado. Se añaden sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos grupos de
bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias
añadidas, se puede variar el tipo y grado de selectividad.
Ej: Agar Mc Conkey, Agar SS, Agar Cetrimida, Agar Levine, Agar Manitol Salado, Agar
Verde Brillante.

Diferenciales: permiten diferenciar una especie o grupo por su crecimiento
diferencial en este medio.
Ej: Agar CLDE, Agar Levine, Agar Manitol Salado

De enriquecimiento: son medios diseñados para permitir el crecimiento del máximo
número de especies posible. Pueden usarse, por ejemplo, para estudiar todos los
microorganismos presentes en una muestra.
Ej: Agar sangre, Agar chocolate.

De transporte: está preparado para servir de almacenamiento temporal
especimenes transportados, manteniendo su viabilidad y su concentración.
Ej: Stuart.
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a
Técnicas de Tinción
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea, la forma más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por calor es lo más corriente, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes.
Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han
sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos
ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales
lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o
depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son
suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre las células rápidamente y que no produce un color tan
intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tiñe.
Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya
que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones
precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras
se denominan artefactos, y deben tomarse precauciones para tener la seguridad de que no
nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
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Preparación de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota de la muestra que se
desea teñir. En caso de ser sólida, se frota el hisopo o el ansa con la que se tomó la
muestra sobre una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el
portaobjetos. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire luego de haber
sido pasado varias veces (3) por la zona azul de la llama del mechero.
Examen de muestras al microscopio
Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes
que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.
Examen microscópico directo de las muestras
Sin Tinción
No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco:
las muestras se extienden sobre la superficie de un portaobjetos para su observación.
Luego de colocar una gota de muestra sobre el portaobjetos se deposita suavemente un
cubreobjetos sobre la superficie del material. Las muestras que sean demasiado espesas
pueden diluirse con igual volumen de solución fisiológica estéril para permitir la
diferenciación de sus elementos.
Examen microscópico de las muestras levemente modificadas
Tinción Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la
misma tonalidad (Tinta china, Azul de Metileno, Azul de lactofenol).
Examen microscópico de las muestras muy modificadas
Tinción Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las células se diferencian en función de los
diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.
Los ejemplos clásicos son la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
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Tinción de GRAM
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. En el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.)
se basan justamente en la tinción de GRAM
Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tiñe 1 min con Violeta de Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada
durante 2 min y se lava nuevamente con agua. Luego se decolora con una mezcla alcohol
etílico/acetona y se cubre con Safranina (color de contraste) durante 1 min. Se Lava y deja
secar.
Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas se
tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares.
La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas
de peptidoglicano y ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula grampositiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, contiene una capa mucho
más delgada únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared
de la célula gram-negativa es peptidoglicano.
Bacteria Gram Positiva
Bacteria Gram Negativa
Tiene una capa gruesa de peptidoglicano
(mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido
Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado
en la capa de peptidoglicano y unido a la
membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la
pared que está en la superficie y se une sólo a la
capa de peptidoglicano.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano
(mureina) unida a una membrana exterior por
lipoproteínas. La membrana exterior está hecha
de proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos.
Entre la membrana citoplásmica y la pared celular
hay un espacio periplásmico.
También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas
especies.
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Morfología Bacteriana
La tinción de GRAM permite clasificar a las bacterias de acuerdo a: el color que adquieren
tras la tinción y la forma que presentan las células.
En lo relativo a la coloración, hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando
aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color
rojo-rosado.
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, en ocasiones de gran tamaño
forma
esférica:
se llama
Coco
2 cocos juntos:
Diplococos
4 - 20 en cadenas:
Estreptococos
En racimos:
Estafilococos
Bacilos
Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.
Forma de vara:
se llaman Bacilos
Dos bacilos juntos:
Diplobacilos
Cadenas de bacilos:
Estreptobacilos
Espirales
Forma espiral rígida se
llama: Espirilo
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Si el espiral es flexible y ondulado
se llama: Espiroqueta
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Fundamento
Las células fijadas con calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de
cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado,
todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de
azul/violeta.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente
activo es aquí el I2
; el KI simplemente hace soluble el I2
en agua. El I2
entra en las
células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. Las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias
en las que es soluble el complejo I2
-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos)
no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre
esos dos tipos de células está por lo tanto en su resistencia a la decoloración; esta
resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas,
la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la
pared de la célula. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo
cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus
paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípidos), no son
permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal
violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son violetas, pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante rosa intenso, como la safranina o la fucsina básica. Después
de la coloración de contraste las células gramnegativas son rosas, mientras que las
grampositivas permanecen violetas.
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TÉCNICA
1.
Preparar el frotis.
2.
Teñir con violeta de cristal. Dejar
actuar 1 min.
3.
Lavar con agua el exceso de
colorante.
4.
Colocar lugol. Dejar actuar 2 min.
5.
Lavar con agua.
6.
Decolorar con solución de
alcohol/acetona.
7.
Teñir con Safranina. Dejar actuar 1
min.
8.
Lavar con agua.
9.
Dejar secar.
10. Observar al microscopio
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ESQUEMA
GRAM NEGATIVO
GRAM POSITIVO
FIJACION
VIOLETA DE CRISTAL
LUGOL
DECOLORANTE
SAFRANINA
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