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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Curso: FISIOLOGÍA GENERAL 2010
Laboratorio No. 1
Canales activados por voltaje
Introducción.
Los canales de iones son las estructuras responsables del transporte de carga eléctrica a
través de las membranas biológicas. Las características centrales de los canales de iones son
su selectividad y su excitabilidad.
Las selectividad es la propiedad que permite a los canales conducir en forma preferencial
una especie iónica particular. Por ejemplo existen canales selectivos al sodio, al potasio, al
calcio, al cloruro, etc.
La excitabilidad es la propiedad que permite a los canales cambiar su permeabilidad en
respuesta a factores externos tales como cambios de concentraciones de iones, hormonas,
odorantes, deformaciones de la membrana, cambios en el potencial eléctrico, fosforilación,
etc.
En este trabajo práctico estudiaremos la excitabilidad usando un modelo de un canal
activado por diferencias de potencial eléctrico. El simulador es un programa computacional
en una hoja de cálculo Excel y calcula la corriente llevada a través de una membrana que
contiene un solo canal. El canal tiene dos estados, abierto y cerrado. Sólo conduce corriente
en el estado abierto. Esta propiedad es la responsable de que la corriente medida a un
potencial eléctrico constante tome sólo dos valores discretos: si el canal está abierto hay
una corriente, i,( medida en amper) que es igual a la conductancia del canal, g,(medida en
siemens) multiplicada por la diferencia entre el potencial eléctrico aplicado, V;(medido en
volt) y el potencial de inversión de la corriente, Vi, ;(medidos en volt). Si el canal está
cerrado, la corriente es cero. Los canales están constantemente abriéndose y cerrándose. La
figura muestra un ejemplo del curso temporal de la corriente medida a V constante en una
membrana con un solo canal.
Corriente, pA
80
60
40
20
0
-20
1
101
201
301
401
501
601
701
801
901
Tiempo, mili segundos
La corriente promedio que pasa la membrana es:
i  gP(V  Vi )
Donde P es la probabilidad de encontrar el canal abierto.
(1)
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
2
El curso temporal de la corriente está determinado por la probabilidad por unidad de tiempo
que un canal cerrado se abra, , (medida en s-1) y la probabilidad por unidad de tiempo que
un canal abierto se cierre, (medida en s-1). Partiendo de una probabilidad inicial arbitraria
P(0) la probabilidad de encontrar el canal abierto evolucionará en el tiempo según esta
ecuación diferencial:
dP(t )
  P(t )   (1  P(t ))
dt
(2)
Sacando P(t) como factor común nos queda:
dP(t )
      P(t )
dt
(3)
En estado estacionario la probabilidad no cambia en el tiempo, y la podemos encontrar
haciendo cero la derivada. La probabilidad en estado estacionario, P() es :
P() 

 
(4)
Factorizando el lado derecho de la ecuación 3 por ( + e introduciendo la ecuación 4
queda así:
dP(t )
    P()  P(t ) 
dt
(5)
Separando las variables para tratar de integrar la ecuación tenemos :
dP(t )
    dt
P(t )  P()
O lo que es lo mismo:
d P(t )  P() 
    dt
P(t )  P()
(6)
(7)
La probabilidad para un momento t la podemos encontrar haciendo la integración entre
tiempo 0 y tiempo t, con una probabilidad inicial P(0).

P(t )  P() 
ln
    t
P(0)  P()
Que podemos escribir como:
(8)
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
P(t )  P()  P(0)  P()e    t
3
(9)
Definiendo una constante de tiempo  como
1

 
(10)
La ecuación de la probabilidad en función del tiempo queda finalmente asÍ.
P(t )  P()  P(0)  P()e t /
(11)
Las probabilidades  y  se pueden calcular de la duración de los períodos en que el canal
está cerrado y la duración de los períodos en que el canal está abierto.
La probabilidad p(t) que un canal que se abrió a t = 0 siga sin cerrarse después de un tiempo
t la podemos sacar de la ecuación 9 haciendo P(0) = 1 y  = 0. Es decir el canal está abierto
a t = 0 y una vez que se cierra ya no se abre más, por lo tanto P() = 0. La ecuación 9 nos
queda entonces así:
p(t )  e  t
(12)
Usando las propiedades de la función exponencial se puede demostrar que la duración
promedio de un canal abierto es  unidades de tiempo.
Los canales activados por voltaje tienen un sensor de potencial que es una parte de su
estructura que lleva una carga eléctrica positiva que se mueve en el espesor de la
membrana, impulsada por la diferencia de potencial establecida a través de la membrana.
En reposo el potencial eléctrico intracelular es negativo por los que el sensor está en el lado
citoplamático de la membrana, estado de reposo, canal cerrado. Cuando la membrana se
despolariza, el sensor se mueve hacia la cara extracelular de la membrana, estado activo,
canal abierto.
Cuando el sensor de potencial se mueve desde el lado extracelular hasta el lado
citoplasmático de la membrana, se produce un cambio de energía libre, G ( joule mol-1)
del sistema. Este cambio de energía libre tiene dos partes, una independiente del potencial
eléctrico, G0, la otra parte es el trabajo eléctrico del transporte de las cargas del sensor de
potencial desde un potencial cero en el lado extracelular hasta un potencial V en el lado
citoplasmático de la membrana.
G  G0  zFV
(13)
Donde z es la cantidad de cargas elementales trasportadas, F es el número de Faraday
(96500 coulomb mol-1), y V la diferencia de potencial eléctrico, (volt, joule coulomb-1)
entre el lado citoplasmático de la membrana y su lado extracelular. La probabilidad por
unidad de tiempo que un canal abierto se cierre es proporcional a una función exponencial
de la energía de activación de la transición de abierto a cerrado, G*.
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
 e
4
 G* / RT
(14)
-1
-1
Donde R es la constante universal de los gases (8.314472 J K mol ) y T la temperatura
(kelvin). Esta energía de activación tiene una parte independiente del potencial eléctrico y
otra dependiente del potencial eléctrico.
G*  G* ,0  xzFV
(15)
G*
Donde
 . Es la energía de activación en ausencia de diferencia de potencial y xV es la
diferencia de potencial eléctrico entre el lugar donde está el sensor de potencial en el estado
de transición y el potencial del lado extracelular, que es cero. (x es un número entre 0 y 1).
La energía de activación del paso del sensor de potencial desde el lado citoplasmático al
extracelular de la membrana, G*, que determina la probabilidad alfa es:
G*  G* ,0  x  1zFV
(16)
Donde (x-1)V es la diferencia de potencial eléctrico entre el lugar donde está el sensor de
potencial en el estado de transición, xV, y el potencial del lado intracelular, que es V. Con
las ecuaciones 15 y 16 podemos escribir expresiones para las constantes alfa y beta en
función del voltaje.
 e
 e


 G* , 0   x 1 zFV / RT


 G* , 0  xzFV / RT
(17)
(18)
Para un cierto voltaje, V0, ambas constantes son iguales, 0 = 0
0  e
0  e


 G* , 0   x 1 zFV0 / RT


(19)
 G* , 0  xzFV0 / RT
(20)
Dividiendo cada una de las ecuaciones 14 por la correspondiente ecuación 15 eliminamos
el factor de proporcionalidad y las energías de activación en ausencia de potencial eléctrico
:
   0e   x 1z (V V ) F / RT
(21)
   0 e  xz (V V ) F / RT
(22)
0
0
Dividiendo por alfa el numerador y el denominador de la ecuación 4 tenemos una nueva
expresión para P()
P  
1
1  /
(23)
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
5
Usando las ecuaciones 21 y 22 para las constantes alfa y beta la probabilidad de encontrar
el canal abierto en estado estacionario queda así:
P  
1
1  e  zF (V V0 ) / RT
(24)
Ésta es la llamada función de Boltzmann para la probabilidad de encontrar el canal abierto..
Debido a la naturaleza aleatoria del comportamiento del canal, la conductancia instantánea
de la membrana es un valor que fluctúa en el tiempo. El análisis de las fluctuaciones nos
puede ayudar a calcular la conductancia unitaria y el número de canales presentes en una
membrana con muchos canales, en la que no se puede observar directamente los eventos
unitarios. La intensidad de corriente promedio <i> de una membrana con un solo canal es :
i  0(1  P)  iP  iP
Y su varianza es:
 i2  (0  iP ) 2 (1  P)  (i  iP )2 P  i 2 ( P  P 2 )
 i2  i i  i
2
(25)
Para una membrana con N canales, la conductancia promedio y la varianza de la
conductancia son: I  NiP y  2  Ni 2 P  P 2 . Por lo tanto


2
i
2
i  i i 
N
(26)
La conductancia unitaria y en número de canales se puede calcular midiendo la
conductancia promedio y su varianza en diferentes condiciones tales de cubrir un intervalo
de P entre 0 y 1. La varianza en función de la corriente promedio es una parábola cuya
forma depende de la corriente unitaria y el número de canales presentes en la membrana.
Los valores de i y N se obtienen de los parámetros de la mejor parábola encontrada usando
un método de mínimos cuadrados. Esto se puede hacer en los canales activados por una
agonista variando la concentración de la agonista y tomando muestras de la corriente
manteniendo a un voltaje constante. Para cada concentración de agonista se calcula el
promedio y la varianza de las muestras de la corriente.
Para canales activados por voltaje se puede recorrer el intervalo de P entre 0 y 1 variando el
voltaje. En este caso la corriente es función de la probabilidad P y de la diferencia de
potencial V – Vi. . Para este caso es más conveniente dividir ambos miembros de la
ecuación por el voltaje al cuadrado.
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1

2
i
V  Vi 
2

ii
V  Vi 
2
6

i
2
N V  Vi 
2
El primer miembro es la varianza de la conductancia  g2 y la división de la corriente por el
voltaje es la conductancia, según la ecuación 1.
g
2
g  g g 
N
2
(27)
¿Como funciona el simulador?
El simulador emula un experimento hecho en una membrana con un solo canal que es
dependiente del potencial eléctrico establecido a través de la membrana. La convención de
los electrofisiólogos es medir el potencial eléctrico en el medio intracelular con respecto al
extracelular que es tierra. Esta diferencia de potencial eléctrico la llamaremos “voltaje” y la
expresaremos en milivolt. El experimentador fija el potencial eléctrico y el simulador
computa el curso temporal de la corriente medida a intervalos regulares de 1 milisegundo,
durante 5 segundos, y muestra gráficamente una época de 1 segundo. (Ver figura de más
arriba) El programa simulador está en el archivo Excel CanalesV6.xls. Para ejecutarlo haga
clic-clic sobre el icono con ese nombre que está en el escritorio de Windows. El libro de
cálculos tiene tres hojas llamadas Simulador, Resultados y Ajustes.
Cálculo del curso temporal del estado del canal. Columna A (A/C)
La simulación comienza cuando se cambia el valor de la celda A2, que es el voltaje. (Ver
sección de recolección de datos), Al cambiar el valor de esta celda se actualizan todos los
valores que dependen del voltaje: las constantes  y en milisegundosCon estas
constantes se calcula el estado inicial del canal. Se supone que la membrana ha estado un
tiempo largo al potencial de la celda A2 por lo tanto el valor esperado para la probabilidad
de encontrar el canal abierto es P()=+
NB. Los valores de  , y = +) se anotan en las celdas D2, D3 y D4 respectivamente. Estos valores no
son visibles hasta que no haya completado los ejercicios. Para verlos seleccione las celdas C1 a D4 tiene que
desproteger la hoja ( clic en Herramientas / Proteger / Desproteger hoja) y cambiar el color de las letras.
El programa genera un número al azar comprendido entre 0 y 1. Si el número al azar está
comprendido entre 0 y P() entonces se declara el canal abierto, si no se cumple esta
condición se declara el canal cerrado. El resultado de esta operación se anota en la celda
A11. A11 =1 para canal abierto y A11 = 0 para canal cerrado. Este es el primer punto de la
simulación.
El estado del canal para el próximo intervalo de tiempo ( 1 milisegundo en este caso) se
calcula así:
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
7
El programa genera un número al azar comprendido entre 0 y 1.
Si el canal estaba abierto en t = t-1 entonces: si el número al azar está comprendido entre
0 y t el canal se declara cerrado, si no se cumple la condición el canal sigue abierto.
Si el canal estaba cerrado en t = t-1 entonces: si el número al azar está comprendido entre 0
y t el canal se declara abierto, si no se cumple la condición el canal sigue cerrado. El
Procedimiento se repite hasta completar 5000 puntos y los resultados quedan en la columna
A, a partir de A12.
Recolección de datos.
El programa simulador está en el archivo
Excel CanalesV6.xls que lo puede
descargar desde sitio
http://einstein.ciencias.uchile.cl. Copie el
archivo en su computador . Para
ejecutarlo haga clic-clic sobre el ícono
con ese nombre.
Nota. Este archivo contiene macros por lo que debe habilitar macros al iniciar el programa. Si no ve esta
“Advertencia de seguridad”, continúe. Ahora cambie en nivel de seguridad de los macros asi: Clic en
Herramientas / Opciones / Seguridad de macros / Medio / Aceptar /Aceptar. Cierre Excel y empiece de nuevo.
Nota. Use la tecla F9 para actualizar la hoja de cálculos cada vez que cambie el
contenido de una celda..
Algunas celdas importantes para el funcionamiento del programa están protegidas y
ocultas para evitar que sean cambiadas. Para verlas es necesario desproteger la hoja de
cálculo y cambiar el color de los caracteres de las celdas ocultas. hoja ( clic en
Herramientas / Proteger / Desproteger hoja)
CanalesV6.exe contiene tres hojas de cálculo: Simulador, Resultados y Ajustes.
Para hacer una simulación seleccione la hoja Simulador toque la tecla F9. y verá el curso
temporal de la corriente en el gráfico y los resultados en las celdas B8 a la G8.
Escriba un voltaje (milivolt) en la celda A2 y toque la tecla Enter y luego F9 para
actualizar la hoja de cálculos. El contenido del resto de las celdas de la hoja depende del
valor de la celda A2.
Resultados de la simulación:
Cuenta del número de transiciones de cerrado a abierto. Columna B (Ev).
Una celda cualquiera (j) de la columna B, B(j), toma los siguientes valores,: si A(j) =0 y
A(j+1)= 1 entonces B(j) = 1 si no se cumple la condición, B(j) =0. La suma de las celdas
B11 hasta la B5010 es el número de veces que el canal se abrió. Esta sumatoria se imprime
en la celda G8.
Cuenta del tiempo que el canal permanece abierto. Columna C ( t(ab))
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
8
La cuenta se acumula en la columna C. Por definición C11 =0. Para cada celda sucesiva: si
A(j) = 1, entonces C(j)=C(j-1)+1; si no se cumple esta condición, C(j) = C(j-1). La celda
C5010 contiene el tiempo total durante el cual el canal ha estado abierto. Se copia en la
celda E8.
Cálculo de la corriente. Columna D (i,pA)
La columna D contiene la corriente, en picoamper, para cada instante de la simulación. Se
calcula a partir de la conductancia unitaria del canal, g, el potencial de la membrana V, y el
potencial de inversión de la corriente, Vi. D(j) = A(j)g(V-Vi) A esta cantidad se suma una
fluctuación al azar para simular el ruido instrumental.
El valor promedio de la corriente para todos los puntos está en la celda B8 y la varianza de
la corriente en la celda C8.
El valor promedio de la corriente para los puntos en que el canal se encontró abierto está en
la celda D8.
En la hoja de cálculo Resultados hay una tabla preparada para acumular los resultados
obtenidos de la simulación. y en las columnas sucesivas hay espacio para copiar los
resultados de las celdas A8 a la G8 de la hoja Simulador. Para guardar las representaciones
gráficas es necesario abrir el programa MSPAINT.
Copie el gráfico y péguelo en la ventana MSPAINT. Para ilustrar su informe, guarde la
imagen en una disquete o pendrive, como un archivo de mapa de bits monocromo. (21KB).
El nombre del archivo debe llevar el voltaje al cual se tomó el registro.
Copie los valores de las celdas A8 a la G8 de la hoja Simulador a las celdas A a G de filas
sucesivas en la hoja Resultados. Tocando F9 puede repetir la simulación para mejorar su
estadística.
NOTA: Para copiar los valores: seleccione las celdas arrastrando la mouse sobre las celdas B8 a G8 de la
hoja Simulador; clic sobre Edición y copiar. Cambie a la página Resultados y clic sobre la celda B de la
columna correspondiente. Copie los valores haciendo clic sobre Edición, pegado especial, valores y aceptar.
Estas operaciones las puede hacer más fácil usando el macro Ctrl. t que copia los valores de las celdas A6 a
G8 de la hoja Simulador a la hoja Resultados, a partir de la celda A2.
Análisis de los resultados.
1) Corriente promedio y corriente del canal abierto.
Construya un gráfico de la corriente promedio en función del voltaje y de la corriente
promedio del canal abierto en función del voltaje. En su informe describa en forma verbal
la relación entre la corriente y el voltaje para ambos gráficos.
Para hacer el gráfico de V vs <i>
1. Seleccione el bloque de celdas que contiene los datos. Por ejemplo desde a4 hasta b18 de la hoja
Resultados.
2. Clic en el icono señalado con la flecha
3.
4.
Clic en XY (Dispersión)
Clic en Finalizar.
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
9
Busque la ecuación de la recta que describe la corriente del canal abierto en función del
voltaje. Excel lo hace si le pide trazar una línea de tendencia. Con los datos de la recta
calcule el potencial de inversión Vi y la conductancia unitaria g del canal usando la
ecuación (1) para P = 1.
¿Qué relación hay entre la corriente promedio y la corriente del canal abierto?
2) La probabilidad P().
Usando la ecuación (1) puede ver que la razón entre el promedio de todos los puntos y el
promedio de los puntos para el canal abierto es la probabilidad de encontrar el canal
abierto, P().
Construya un gráfico de <i>todos/<i>abierto en función de V.
Busque los valores de z y Vo que describen mejor P() vs. V según la ecuación (24). En la
hoja de cálculo Ajustes hay un ejemplo de ajuste de mínimos cuadrados para la función de
Boltzmann. Para hacer el ajuste copie los valores de V y P de la hoja Resultados en las
celdas correspondientes de las columnas A yB de la hoja Ajustes. La columna C es una
función de Boltzmann calculada con los valores de z y Vo presentes en las celdas C1 y C2.
La columna D contiene las diferencias entre los valores experimentales y los calculados,
elevada al cuadrado. La celda C3 contiene la suma de los cuadrados. La tarea es cambiar
los valores de las celdas C1 y C2 hasta encontrar el mínimo de la suma de cuadrados: C3.
Esto lo hace Excel con la Herramienta Solver.
Para usar Solver:
1. Clic en Herramientas / Solver. Aparece
esta ventana:
2. Escriba C3 en la Celda objetivo
3. Escriba C1:C2 en Cambiando celdas
4. Clic en Resolver.
5. Una vez que termine el procedimiento.
Clic en Aceptar
Solver actualiza los valores de las celdas C1 y C2 que ahora contienen los mejores valores
encontrados para z y Vo.
Para controlar la calidad del ajuste haga un gráficos de P y Boltzmann vs V. De formato de
puntos a la serie P y línea continua a la serie Boltzmann.
El factor z es una medida del número de cargas eléctricas que se mueven a través de la
membrana cuando el canal cambia de forma para pasar del estado cerrado al abierto. zFVo
es una medida de la energía que se necesita agregar desde el exterior para igualar las
energías libres del estado abierto y el cerrado. Con este dato se puede calcular la diferencia
de energía libre de los canales abiertos y cerrados en ausencia de potencial eléctrico usando
la ecuación (13). Calcule G para V = 0 y la probabilidad de encontrar el canal abierto a V
= 0.
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
10
3) Conductancia.
Calcule la conductancia promedio de la membrana para cada voltaje, usando los datos de
corriente promedio, el voltaje y el potencial de inversión de la
corriente.  g  i  /(V  Vi) . Exprese la conductancia en pico siemens, pS, 10-12
amper/volt.. Compruebe que el resultado sea el esperado del producto gp.
4) Determinación de g N usando la varianza y el promedio de i.
La ecuación 8 relaciona la varianza de la corriente debida a la fluctuación de los canales
entre el estado abierto y el estado cerrado con la corriente promedio. Para calcular la
varianza de la corriente debida a la fluctuación de los canales es necesario restarle la
varianza de la corriente que no está relacionada con el cierre y apertura de los canales. Esta
varianza es 02 que es una medida del el ruido instrumental que lo suponemos igual para
todos los valores de V.. En la figura se puede ver estos dos componentes.
Corriente, pA
80
60
40
20
0
-20
1
101
201
301
401
501
601
701
801
901
Tiempo, mili segundos
Para calcular la varianza 20 haga una simulación para V = Vi donde no verá fluctuaciones
de los canales.
Corriente, pA
80
60
V = Vi
40
20
0
-20
1
101
201
301
401
501
601
701
801
901
Tiempo, mili segundos
La varianza de la ecuación 9 es entonces:
 g2 
 i2   02
V  Vi 2
(28)
A partir de la varianza de la corriente promedio calcule la varianza de la conductancia
promedio, expresada en pS2. Construya un gráfico de la varianza en función de la
conductancia promedio. Busque los parámetros de la parábola usando Solver. (En la hoja
Ajustes hay un ejemplo). Compruebe que la conductancia unitaria calculada de la pendiente
de la parábola en el límite de conductancias muy bajas sea igual a la determinada por otros
métodos.
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 1
11
5) Análisis de los eventos abiertos y cerrados
Calcule para cada voltaje la probabilidad de encontrar el canal abierto, P.a partir del
número de unidades de tiempo que el canal estuvo abierto dividido por el tiempo total de la
simulación. Haga un gráfico de P en función del voltaje. En su informe describa en forma
verbal la relación entre P y el voltaje.
Compare los valores de P con los de correspondientes valores de <i>todos/<i>abierto para
cada voltaje..
6) Determinación de las constantes  y .
La probabilidad por unidad de tiempo que un canal abierto se cierre, , es igual al valor
recíproco de la duración promedio de los eventos abiertos. Calcule la duración promedio de
los eventos abiertos a partir del tiempo acumulado por el canal en estado abierto y el
número de veces que se cerró.
La probabilidad por unidad de tiempo que un canal cerrado se abra, , es igual al valor
recíproco de la duración promedio de los eventos cerrados. Calcule la duración promedio
de los eventos cerrados a partir del tiempo acumulado por el canal en estado cerrado y el
número de veces que se abrió.
Haga una representación gráfica de los valores recíprocos de los tiempos promedio para los
eventos cerrados y abiertos en función del voltaje. Pida a Excel buscar una línea de
tendencia exponencial, como se espera de las ecuaciones 21 y 22. Calcule (1-x)z, xz y V0 de
las líneas de tendencia exponencial de los gráficos de los promedios de duración en función
del voltaje. Compare estos valores con los esperados.