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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Curso: FISIOLOGÍA GENERAL 2007
Laboratorio No. 3
Canales de sodio
Introducción.
En este trabajo práctico trabajaremos con la simulación de canales activados por voltaje y
que presentan inactivación, como modelo de los canales de sodio de los nervios. Estos
canales tienen simetría cuádruple, como los canales tetraméricos de potasio, pero están
constituidos por una sola molécula de proteína con cuatro dominios similares. Los canales
de sodio son dependientes del voltaje y se comportan como si tuvieran tres sensores de
potencial, más una compuerta de inactivación. Cuando la célula está en reposo el potencial
intracelular es negativo y los tres sensores de potencial están en estado de reposo y la
compuerta de inactivación está abierta. Si la célula se despolariza, es decir el potencial
intracelular se hace menos negativo, cero o positivo, los sensores de potencial cambian al
estado activo. Si los tres sensores están en estado activo el canal se abre y conduce iones
sodio. Basta que uno de los tres sensores pase al estado de reposo para que el canal se
cierre. Si la compuerta de inactivación se cierra el canal deja de conducir y entra en el
estado inactivado.
Para la cinética de los sensores de potencial y de la compuerta de inactivación usaremos la
formulación clásical de Hodgkin y Huxley. 1952. Hodgkin, A. L. y A.F. Huxley 1952. A
quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.
J.Physiol. 55:119-113
La cinética de los sensores de potencial es similar a la cinética de apertura y cierre de los
canales activados por voltaje que vimos en el primer trabajo práctico. La probabilidad por
unidad de tiempo que un sensor en reposo pase al estado activo es , y la probabilidad por
unidad de tiempo que un sensor activo pase al estado de reposo es . Ambas constantes son
funciones del potencial eléctrico intracelular. La probabilidad de encontrar un sensor en
estado activo la llamaremos m. La ecuación diferencial que relaciona esta la probabilidad
m con las constantes m y  m es:
dm
   m m   m (1  m)
dt
(1)
En estado estacionario, la probabilidad m es constante y la llamaremos m.
m 
m
m  m
(2)
Fisiología General 2007. Trabajo Práctico No. 3
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Las constantes m y  m son funciones del potencial eléctrico de modo que m es cercano a
cero para el potencial de reposo y crece hasta 1 al despolarizar la membrana.
m 
1
1  e  ( z m F / RT )(V V0 m )
(5)
La probabilidad de encontrar abierta la compuerta de inactivación, h, sigue una ley similar
a la de las compuertas m:
dh
   h h   h (1  h)
dt
(6)
En estado estacionario, la probabilidad h es constante y la llamaremos h.
h 
h
h  h
(7)
Las constantes h y  h son funciones del potencial eléctrico de modo que h es cercano a 1
para el potencial de reposo y decrece hasta hacerse cero al despolarizar la membrana.
h 
1
1  e ( z h F / RT )(V V0 h )
(8)
La probabilidad de encontrar el canal abierto, Po, es la probabilidad de encontrar los tres
sensores en estado activo y la compuerta de inactivación abierta:
P0  m 3 h
(9)
Al potencial de reposo, PO es cercana a cero porque m es cercano a cero. Al despolarizar
la membrana m aumenta rápidamente y los canales se abren. Luego la compuerta de
inactivación se cierra, (h se hace cero) y los canales se inactivan. En consecuencia, los
canales de sodio se abren sólo durante un corto tiempo.
El proceso de inactivación juega un papel muy importante en la propagación del impulso
nervioso. Cuando los canales de sodio se abren permiten la entrada de sodio a la célula y
esta corriente de entrada despolarizan la célula. Una vez que la célula se despolariza, los
canales se inactivan, la corriente de sodio se termina y se abren los canles de potasio que
permiten la salida de potasio. Esta corriente de salida repolariza la membrana y el potencial
de acción se termina. El Dr. Mario Luxoro, Premio Nacional de Ciencias, Profesor del
Departamento de Biología y el Dr. Eduardo Rojas, demostraron en el Laboratorio de
Fisiología Celular de Montemar, que la compuerta de inactivación se puede eliminar si se
tratan los axones gigantes de jibia con una enzima proteolítica. (Rojas, E y M. Luxoro
(1963) Microinjection of trypsin into axons of squid. Nature 199:78-79) Esta fue la primera
Fisiología General 2007. Trabajo Práctico No. 3
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demostración de que las corrientes de sodio eran llevadas por proteínas de la membrana, lo
que hoy conocemos como los canales de iones. En los canales de sodio tratados con la
enzima proteolítica Pronasa se puede estudiar el proceso de activación de los canales sin la
interferencia de la inactivación.
Membranas con un solo canal.
El esquema cinético que representa el funcionamiento de los canales de sodio explicado
más arriba es el siguiente:
0m1h  1m1h  2m1h  3m1h
(Esquema 1)
0m0h 1m0h  2m0h  3m0h
Donde xm representa el numero de compuertas m en estado activo, 1h representa la
compuerta de inactivación abierta y 0h la compuerta de inactivación cerrada.
Las probabilidades por unidad de tiempo de cada uno de los pasos de izquierda a derecha
son respectivamente 3m 2m y m. Para los pasos de derecha a izquierda las
probabilidades por unidad de tiempo son respectivamente 3 m, 2 m y  m. La probabilidad
por unidad de tiempo para los pasos de arriba abajo es h y para los pasos de abajo a arriba
es h. El único estado abierto de este esquema es el 3m1h. Al potencial de reposo el estado
más probable es el 0m1h y al despolarizar la membrana se hace más probable el estado
3m0h. Inmediatamente después de la despolarización el canal transita por los diferentes
estados y visita brevemente el estado abierto 3m1h.
Eliminando la inactivación.
El esquema cinético para los canales tratados con Pronasa es el siguiente:
0m1h  1m1h  2m1h  3m1h
(Esquema 2)
En estas condiciones se puede estudiar los canales en estado estacionario, como se hizo
para los canales de potasio. El valor recíproco de la duración de los eventos abiertos 3 m. Si
el canal se cierra, tardará un tiempo igual a 1/m si retorna directamente desde el estado
2m1h , pero el canal puede visitar todos los estados cerrados por lo que existe una variedad
de estados cerrados. Como la población de duraciones de los estados cerrados no es
homogénea, no se puede tomar una duración promedio.
Determinando  de la duración promedio de los estados abiertos y Po de la fracción de
tiempo que el canal permanece abierto se puede calcular  usando las ecuaciones 2 y 9, con
h = 1.
Membranas con muchos canales.
Experimentos de relajación de la corriente.
Los experimentos en membrana con muchos canales destinados a estudiar la cinética de los
canales de sodio se hacen provocando cambios bruscos de voltaje, lo que cambia las
constantes  y  y estudiando el curso temporal de la corriente llevada por la membrana
i(t):
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i(t )  NgP(t )(V  Vi )
4
(10)
m3h
donde P(t) es
que es función del tiempo y del estado inicial. Para cada compuerta m
se cumple la ecuación 1, Combinando las ecuaciones 1 y 2:
dm
 ( m   m )( m  m )
dt
(11)
Con la condición inicial m a tiempo cero igual a m0 y considerando m como una constante
se puede integrar para obtener el curso temporal de m.
m(t )  m  (m0  m )e  ( m   m )t
(12)
La constante de tiempo de la relajación es:
1
m 
m  m
(13)
Para compuerta de inactivación se puede escribir las ecuaciones:
dh
 ( h   h )( h  h )
dt
h(t )  h  (h0  h )e  ( h   h )t
1
h 
h  h
(14)
(15)
(16)
Funcionamiento de los programas simuladores.
En este trabajo usaremos dos programas de simulación que funcionan bajo Excel.
CanalesNa2.xls y CanalesNaG3.xls.
Experimentos de promediación de los estados transitorios.
CanalesNa2.xls es similar al programa usado en el trabajo práctico de los canales de
potasio.
Como los canales de sodio se abren solamente en respuesta a una despolarización, es
necesario hacer los experimentos cambiando el potencial eléctrico. Esto se hace
estableciendo un potencial previo durante un período llamado prepulso. Finalizado el
prepulso, se empieza el período llamado pulso.
El programa calcula dos juegos de constantes, las constantes  y  a partir de los voltajes
presentes en las celdas B2 y B3, usando las ecuaciones clásicas de Hodgkin y Huxley El
potencial del pulso es B2 y el del prepulso es B3.
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Los valores de m y  m para el pulso quedan anotados en las celdas E2 y E3. Los valores
de m y  m para el prepulso quedan anotados en las celdas K2 y K3. El estado inicial
de las tres compuertas m: m1, m2, y m3 y n4 se calculan de acuerdo a m y el valor
presente en la celda K4.
Los valores de h y  h para el pulso quedan anotados en las celdas G2 y G3. Los valores
de h y  h para el prepulso quedan anotados en las celdas M2 y M3. El estado inicial de
la h se calcula de acuerdo a h y el valor presente en la celda M4. Sin embargo se puede
forzar h = 1 para simular la presencia de pronasa. Si la celda B4 es 1, entonces h = 1 . Si
B4 = 0 entonces el valor inicial de h es M4.
El estado sucesivo de las compuertas se determina mediante números al azar usando el
mismo procedimiento empleado en el trabajo práctico anterior. Si la compuerta está en
reposo y el número al azar es menor que t la compuerta se declara activa; si no, queda en
reposo. El procedimiento es el similar para la compuerta activa, si el número al azar es
menor que t la compuerta pasa al estado de reposo; si no, queda activa. En la celda I4
está t.
El procedimiento se repite para las 3 compuertas m, para 5000 intervalos t y los
resultados quedan en las columnas B, C, y D, a partir de la fila 11. Compuerta en reposo =
0, activa = 1. El procedimiento es similar para la compuerta h y el estado de esta compuerta
se anota en la columna H a partir de la celda H11. El estado del canal, se anota en la
columna F. Abierto (1) si la suma de las m1 + m2 + m3 + h es 4, cerrado (0) si no es 4.
La cuenta de eventos, el tiempo total que el canal está abierto y el número de eventos se
calcula como CanalesV6.xls . Finalmente, la corriente se anota en la columna en la
columna I, calculado del estado del canal, la conductancia unitaria y el potencial de
inversión de la corriente.
En las celdas B8 a G8 se anotan los resultados de la simulación en presencia de pronasa.:
el potencial eléctrico, la corriente promedio de la membrana, la corriente promedio del
canal abierto, la duración total en estado abierto, la duración total en estado cerrado y el
número de veces que el canal se abrió. En ausencia de pronasa no se muestra la corriente
promedio ni la duración total del estado cerrado.
El programa presenta dos gráficos. El primero muestra los 5000puntos de la simulación del
curso temporal de la corriente. El segundo muestra la evaluación 2000 puntos de l curso
temporal de m1, m2, m3, h, y el estado del canal: abierto o cerrado.
Recolección de resultados.
Experimentos en canales que se inactivan.
Haga simulaciones cubriendo el intervalo de voltajes entre -50 y 80 mV, con prepulso de 100mV y en ausencia de pronasa ( B4=0 ). Observe el funcionamiento de las compuertas m
y h. Observe que los eventos abiertos se terminan ya sea por el cierre de una compuerta m
o el cierre de la compuerta h.
¿Qué relación hay entre m, h y la duración promedio de los eventos abiertos?
Transfiera los resultados a las celdas correspondientes de la hoja Resultados.
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Análisis de los resultados.
Con los resultados recolectados haga gráficos de la corriente del canal abierto en función
del voltaje. Determine el potencial de inversión de la corriente de sodio, y la conductancia
unitaria del canal.
Calcule la duración promedio de los eventos abiertos a diferentes voltajes. Haga una
representación gráfica de sus resultados.
Experimentos en presencia de pronasa.
En presencia de pronasa (B4=1) se elimina la inactivación de los canales por lo que se
pueden estudiar en estado estacionario, como se hizo para los canales de potasio. Para estas
simulaciones el voltaje del prepulso debe ser igual al voltaje del pulso, para asegurarse
estado estacionario.
Haga simulaciones cubriendo el intervalo de voltajes entre -50 y 80 mV, Observe el
funcionamiento de las compuertas m y h. Observe que los eventos abiertos se terminan solo
por el cierre de una compuerta m. ¿Qué relación hay entre  m, y la duración promedio de
los eventos abiertos?
Calcule la probabilidad de encontrar el canal abierto Po. Usando los tiempos acumulados
en estado abierto y cerrado. Haga una representación gráfica de Po y de m en función del
voltaje y analice el resultado.
Calcule la duración promedio de los eventos abiertos. Compárela con la obtenida en
ausencia de pronasa. Con los resultados de m y la duración de los eventos abiertos calcule
la constante m. Busque la ley que relaciona de m y  m con el voltaje.
Experimentos en membranas con muchos canales.
CanalesNaG3.xls es el programa Excel para las simulaciones de los experimentos en
membranas con muchos canales de sodio.
Este programa funciona con macros y se deben aceptar al momento de abrir el
programa.
La hoja se recalcula al apretar la tecla F9, no se recalcula automáticamente.
Funcionamiento del programa.
En estas simulaciones los canales empezarán en un estado de acuerdo al m y h para el
voltaje del prepulso y evolucionan en el tiempo hasta llegar a un nuevo estado estacionario.
El programa calcula el estado de cada una de las cuatro compuertas, el estado del canal y la
corriente que pasa por la membrana como CanalesNa2.xls. En la columna J se anota la
corriente en pA. En la columna Q se anota el resultado de la suma de los dm/dt para cada
una de las compuertas m. Un 1 representa una compuerta que pasó del estado de reposo al
estado activado, -1 representa el paso de una compuerta del estado activo al estado de
reposo, 0 indica que no hubo transiciones en el intervalo.
Para hacer una simulación de una relajación primero se define el el voltaje del prepulso, por
ejemplo -100mV. Luego se define el voltaje del pulso, por ejemplo 90 mV, y se ejecuta la
simulación con la tecla F9 o Control r. F9 recalcula la hoja, Control r que ejecuta un
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macro que además actualiza los gráficos de la hoja de cálculo que representan el curso
temporal de la corriente y registran las transiciones de las compuertas m.
Cada vez que se ejecuta el programa se obtiene una representación gráfica diferente, debido
a la naturaleza aleatoria de la operación de los canales. Para tener un resultado significativo
es necesario repetir el experimento muchas veces y promediar los resultados.
Para obtener el curso temporal de la corriente use la tecla Control a, que ejecuta un macro
que recalcula la hoja y suma la corriente de cada simulación a la suma de las
determinaciones anteriores, de modo que la Columna M contiene la suma de las corrientes
registradas para cada intervalo de tiempo. La celda M11 contiene el número de veces que
se ha repetido el experimento y la Columna N contiene la el promedio de la corriente para
cada intervalo de tiempo. Los valores máximos y mínimos de la columna N se registran en
las celdas C8 y D8.
La Columna O contiene la varianza de la corriente para cada intervalo de tiempo. La tecla
Control A ejecuta 100 iteraciones.
La gráfica Promedio y varianza de i muestra los valores de las columna O y P en función
del tiempo. La gráfica Varianza vs. Promedio muestra una representación XY de las
columnas P y O.
Para acumular las transiciones de las compuertas m se usa el macro que se ejecuta con la
tecla Control g. La columna Q contiene la acumulación de todas las transiciones y el
resultado se muestra en la gráfica Histograma de impulsos. La tecla Control G ejecuta
100 iteraciones. La celda D8 muestra el número de veces que se calculó las gating currents
y la celda E8 es la suma de los valores de la columna Q, es decir el número neto de
compuertas m que se ha movido desde el estado cerrado al abierto. La cuenta se incrementa
cada vez que una compuerta m se abre y se decrementa cada vez que una compuerta m se
cierra
Determinación de la corriente máxima durante una despolarización
Con el programa CanalesNaG3.xls acumule una 300 repeticiones del curso temporal de la
corriente usando como pulso 0 mV y prepulso -100 mV. La máxima corriente registrada la
encontrará en la celda C8 o en la D8. Repita el procedimiento para diferentes voltajes del
pulso manteniendo el prepulso en -100mV. Construya una curva Corriente-Voltaje para la
corriente máxima de sodio. Para potenciales superiores al potencial de inversión de la
corriente de sodio el valor máximo de la corriente está en la celda D8.
Determinación de la corriente unitaria.
El promedio y la varianza de la corriente están en las columnas O y P. Busque con ayuda
de Solver los parámetros de la parábola y determine corriente unitaria del canal, el número
de canales presentes en la membrana y la máxima probabilidad de encontrar los canales
abiertos 0 mV. El procedimiento y la teoría están en la guía de los canales de K.
Estudio de la inactivación. Determinación de h.
Recolección de resultados.
Con el programa CanalesNaG3.xls acumule una 300 repeticiones del curso temporal de la
corriente usando como pulso 0 mV y prepulso -100 mV. Observe la evolución del gráfico
de la corriente promedio a medida que se acumulan las iteraciones. Anote la corriente
registrada en el pico de la corriente de sodio. ( Celda C8) en la hoja de resultados. Esta
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corriente corresponde a la corriente del canal abierto, multiplicada por m3h al momento del
pico de la corriente. Repita la simulación usando otros valores para el prepulso,
manteniendo el pulso siempre en 0mV. (intervalo sugerido -100 mV a -40mV en
incrementos de 5 mV, si la corriente es poca, acumule más iteraciones)
Análisis de los resultados.
En la hoja ajustes habrá construido una tabla de la corriente en el pico en función del
voltaje del prepulso. (Columna D8 o E8). Para calcular h divida la corriente registrada
para cada prepulso por la que registró con un prepulso muy negativo, donde h =1.
Grafique h en función de l voltaje del prepulso (El valor de m será el mismo para todas
las determinaciones porque se mide a igual voltaje de pulso y en el mismo momento, el
valor de h será una fracción del h al voltaje del prepulso, esta fracción será la misma
para todos las determinaciones porque el momento de la medida será siempre el mismo.
Ecuaciones 9, 10 y 15)
Gating currents.
Determinación de m
Recolección de resultados.
El histograma de eventos representa el número de compuertas m que se mueven en cada
intervalo de tiempo. Esto es la derivada dm/dt, por lo tanto el número de compuertas que se
ha movido al hacer una despolarización es la integral, es decir la suma de todos los valores
de la columna Q. Esta sumatoria está en la celda F8. El valor máximo de esta sumatoria es
3 veces el número de iteraciones, porque hay 3 compuertas m por canal y la membrana
tiene 1 canal. Como m es la probabilidad de encontrar una compuerta m abierta, m se
puede calcular como la fracción compuertas m desplazadas a cada potencial.
Acumule unas 300 iteraciones para construir el histograma de eventos a con un prepulso de
-100mV y pulso de 0mV. Transfiera los valores de las celdas A8 a F8 a lo hoja de
resultados. Repita para diferentes valores del pulso manteniendo el prepulso en -100mV.
Análisis de los resultados.
En la hoja de resultados calcule el número de compuertas m movilizadas Para cada voltaje
y el número esperado si todas se movieran. Calcule m de la fracción de compuertas m
movilizadas a cada potencial. Grafique m en función del voltaje del pulso y ajuste una
función de Boltzmann para determinar zm y V0m.
Determinación de m
Recolección y análisis de los resultados
El histograma de eventos representa el número de compuertas m que se mueven en cada
intervalo de tiempo. Esto es la derivada dm/dt, la derivada de la exponencial de la ecuación
12. La derivada de una exponencial es una exponencial con la misma constante de tiempo
m.
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Acumule unas 300 iteraciones para construir el histograma de eventos a con un prepulso de
-100mV y pulso de 0mV. Copie los valores de las columnas A y Q, a partir de la fila 11, a
las columnas H e I de la hoja Ajustes. Con ayuda de Solver y las ecuaciones que
encontrará en Ajustes busque la constante de tiempo m. La suma de las desviaciones al
cuadrado está en la celda J3 y los parámetros ajustables son los de las celdas J1 y J2.
Una vez determinados m y m calcule m y  m usando las ecuaciones 2 y 13. Repita el
procedimiento para diferentes voltajes del pulso.
Reconstrucción del curso temporal de la conductancia y determinacion de h.
Recolección y análisis de los resultados
Acumule una 300 repeticiones del curso temporal de la corriente usando como pulso 0 mV
y prepulso -100 mV. Copie los valores de las columnas A y L, a partir de la fila 9, a las
celdas correspondientes de las columnas A y B de la hoja de Ajustes. Complete la lista de
valores de las celdas C2 a C7 con los valores correspondientes obtenidos de las
determinaciones anteriores. En la columna B se indica que variable se necesita poner en la
celda C adyacente.
C2 es el voltaje del pulso
C3 es el potencial de inversión de la corriente
C4 la conductancia del canal abierto
C5 m para el voltaje en C2.
C6 h para el voltaje en C2.
C7 m para el voltaje en C2.
C8 es m que lo vamos a determinar ajustando el curso temporal de la conductancia a un
producto de dos funciones exponenciales m3 y h, ecuaciones 9, 12 y 15.
La ecuación de la conductancia está en la columna D, los desviaciones al cuadrado en la
columnas E y la suma de cuadrados en la celda E8. Con Solver busque el valor mínimo de
la suma de cuadrados variando la celda C8. C8 es m.una vez ejecutado Solver.