Download CORRELACIÓN DE LA INFECCIÓN DE LOS SUBTIPOS DE VIH

MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
CORRELACIÓN DE LA INFECCIÓN DE LOS SUBTIPOS DE VIH-1
POR GRUPO DE RIESGO
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº25
CARLOS AUGUSTO YÁBAR V .
Y
JAVIER SALVATIERRA F
EBERTH QUIJANO
2005
INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO:
CORRELACIÓN DE LA INFECCIÓN DE LOS SUBTIPOS DE VIH-1
POR GRUPO DE RIESGO
CÓDIGO DEL PROYECTO: 953065
INVESTIGADOR PRINCIPAL:
Carlos Augusto Yábar V.
Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, Instituto Nacional de Salud
CO-INVESTIGADORES:
Javier Salvatierra F.
Eberth Quijano.
Centro Especializado en Enfermedades de Transmisión Sexual “Alberto
Barton”
2
SITUACIÓN ACTUAL DEL PROYECTO
Proyecto concluido
RESUMEN DEL PROYECTO
El presente proyecto titutlado: “CORRELACIÓN DE LA INFECCIÓN DE LOS
SUBTIPOS DE VIH-1 POR GRUPO DE RIESGO” es un estudio descriptivo
retrospectivo el cual tuvo como objetivo principal determinar el subtipo genético
y formas recombinantes de VIH-1 a partir de diferentes grupos de riesgo entre
los cuales se tienen a los trabajadores sexuales y población heterosexual en
general o también grupo de no trabajadores sexuales (NTS). Para lograr dicho
propósito se seleccionó una población de 40 sujetos infectados con VIH-1 de
los cuales la mitad correspondió a trabajadores sexuales (TS) y mientras que el
otro grupo perteneció a población heterosexual en general o grupo de no
trabajadores sexuales (NTS). Se realizó la extracción de ADN genómico y la
amplificación del gen de la envoltura por PCR, Nested PCR. Seguidamente se
realizó un rastreo de los subtipos genéticos del virus por Ensayo de Movilidad
de Heterodúplex (HMA) y se confirmó los resultados por análisis de secuencia.
Asimismo se hizo una búsqueda de casos de infecciones mixtas mediante
análisis de RFLP del gen gag
y finalmente se analizaron eventos de
recombinación entre ambas poblaciones. De acuerdo a los resultados de HMA
y secuenciamiento, el 100% de las muestras de VIH fueron subtipo B. Se
encontró un solo caso de infección mixta en un trabajador sexual y se
identificaron doce casos de recombinación intragenética.
3
En conclusión, existen diferencias de variabilidad genética entre ambas
poblaciones
principalmente
a
nivel
de
recombinación
intragenética
y
cladogénesis.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS EN CONGRESOS:
No se presentaron trabajos por el momento.
UTILIDAD DE LOS RESULTADOS
1. Los datos de subtipos de VIH-1 permiten enriquecer y actualizar la base de
datos sobre las variantes genéticas de VIH-1 en el Perú. Las secuencias
obtenidas serán enviadas al banco de Genes (GenBank)
2. Los hallazgos encontrados en el presente estudio han permitido la creación
de una base de datos de secuencias de VIH-1 gen env el cual podrá ser
utilizado para estudios epidemiológicos encaminados a estudiar la dinámica
de transmisión del VIH-1 en poblaciones humanas con diferente conducta
sexual de riesgo de infección.
3. El hallazgo de nuevas formas recombinantes de VIH-1 servirán de
referencia para el fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica del VIH-1
en el país.
IMPACTO DEL ESTUDIO
1. Los datos del presente estudio han permitido la elaboración de los
instructivos “Subtipificación de VIH-1” y “Análisis de secuencias de ADN” los
cuales están en proceso de evaluación por la oficina de calidad.
4
2. El presente proyecto ha permitido la estandarización de la técnica “Ensayo
de Movilidad de Heterodúplex” para la detección de subtipos genéticos de
VIH-1, el cual solo era realizado por el NAMRID.
3. El desarrollo del presente estudio ha permitido la firma de un convenio
internacional entre el INS y el AIDS Reagent Program del NIH (2003 –
2005) para el pedido de reactivos no comerciales de biología molecular
destinados a la subtipificación de VIH-1.
4. El presente estudio tiene como impacto científico la demostración que la
presencia de recombinación de VIH-1 es un hecho evidente no solo en
población con conducta de alto riesgo sino también en sujetos
heterosexuales.
5
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo de estudio
Estudio descriptivo restrospectivo
Muestra biológica
Se seleccionó un grupo de 40 muestras de sangre congelada proveniente de
los proyectos: “DETECCIÓN DE SUBTIPOS DE VIH-1 EN TRABAJADORAS Y
TRABAJADORES SEXUALES DE LIMA Y CALLAO” e “IDENTIFICACIÓN
MOLECULAR
DE
RESISTENCIA
A
MUTACIONES
DROGAS
EN
PUNTUALES
VIH-1”.
Todas
RELACIONADAS
las
muestras
A
fueron
seleccionadas siguiendo los criterios de inclusión:
1. Muestras clínicas en óptimo estado de congelación.
2. Muestras clínicas reactivas a PCR por el gen gag, pol y RT.
3. Muestras clínicas con ficha de encuesta sobre datos personales (nombre,
edad, sexo) y consentimiento informado.
Extracción de ADN
Para realizar la extracción de ADN se tomó un volumen de 200 l de sangre
periférica y se siguieron los procedimientos recomendados por el fabricante del
Kit de extracción de ADN a partir de sangre QIABlood (QIAGEN). En ese
sentido se mezcló 200 l de sangre con 20 l de Proteasa en un tubo de 1.5
ml. Posteriormente se añadió a la mezcla 200 l de buffer de lisis AL y se
procedió a homogenizar vigorosamente. La mezcla fue incubada a 56°C por 10
minutos en baño maría modelo 1166 (VWR Scientific).
Seguidamente, la
6
mezcla fue añadida dentro de pequeñas columnas (minicolumnas) de
purificación las cuales fueron ensambladas en tubos de 1.5 ml y luego
sometidas a centrifugación a 8000 RPM por 1 minuto (centrífuga Eppendorf
modelo 5417C).
Las impurezas fueron removidas de la minicolumna con
lavados mediante centrifugación usando el buffer AW1 (8000 RPM x 1 minuto )
y posteriormente el buffer AW2 (14000 RPM por 3 minutos). Seguidamente se
añadió 150 l del buffer AE ó agua dentro de la minicolumna ensamblada a un
tubo de 1.5 ml de capacidad. Todo el sistema fue posteriormente sometido a
una centrifugación de 8000 RPM x 1 minuto para generar el desprendimiento
del material genético de las minicolumnas hacia el tubo de 1.5 ml facilitado por
el buffer AE o agua.
Finalmente, los tubos conteniendo la solución eluída
fueron almacenados a -20°C para su posterior utilización.Los tubos
conteniendo el ADN purificado en solución fueron almacenados a -20°C para
su posterior utilización.
PCR Nested PCR para la amplificación del gen gag
La amplificación de la porción p24-p7 del gen gag fue realizada de acuerdo a
las especificaciones recomendadas por Van der Auwera & Heyndrick, 2000:
·Primer Round de PCR, se utilizaron tubos de 200 µl de capacidad debamente
rotulados conteniendo concentraciones finales de los siguientes componentes:
Buffer de reacción de PCR II (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3), 2.5 mM de
Cloruro de magnesio, 0.8 mM de mezcla de deoxinucleótidos trifosfatos (200
mM de dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0.2 pmoles de los primers H1G777 y
H1P202, 0.25 U de Enzima Taq ADN Polimerasa (Applied Biosystem) y 100 ng
7
de ADN molde. Las condiciones de ciclaje fueron: 35 ciclos de 94 °C por 30
segundos. 50 °C por 30 segundos y 72 °C por 2 minutos, 1 ciclo final de 72°C
por 7 minutos y por último una temperatura de almacenaje de 4 °C. Los tubos
fueron mantenidos a esta temperatura hasta el momento de dar inicio al
segundo PCR; o bien fueron almacenados a -20 °C por toda la noche. Para la
amplificación de los plásmidos de referencia de los subtipos se omitió el primer
round de PCR debido a que los productos clonados en cada plásmido no
presentan la región de hibridación para los primers H1G777 y H1P202.
·Segundo Round de PCR, en el cual se mezclaron concentraciones finales de
los siguientes reactivos: Buffer de reacción de PCR II (10 mM Tris-HCl, 50 mM
KCl, pH 8.3), 2.5 mM de Cloruro de magnesio,
0.8 mM de mezcla de
deoxinucleotidos trifosfatos (200 mM de dATP, dGTP, dCTP y dTTP),
0.4
pmoles de los primers H1Gag584 y g17, 0.25 U de Enzima Taq ADN
Polimerasa (Applied Biosystem) y un volumen de 2 ml de reacción de primer
round para 20 ml de volumen final. Las condiciones de ciclaje fueron: tres ciclos
iniciales de 94 °C por 1 minuto, 50 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto,
seguido de 32 ciclos restantes de 94 °C por 30 segundos, 45 °C por 30
segundos y 72 °C por 2 minutos. Se realizó una extensión final de 72 °C por 7
minutos. Finalmente se programó una temperatura de almacenaje a 4 °C. Los
tubos fueron posteriormente almacenados a -20 °C.
Para el caso de los
plásmidos de referencia, no fue necesaria la modificación de los tres primeros
ciclos según recomendaciones de Van der Auwera & Heyndrick, 2000. Esta
modificación permite incrementar la afinidad de los primers en el ADN molde de
la muestra, lo cual no es necesario para el caso de las cepas de referencia.
8
PCR Nested PCR para la amplificación del gen env
La amplificación del gen env fue llevada a cabo siguiendo las especificaciones
recomendadas por Delwart et al., 1995 tal como se describe a continuación:
·Primer round de PCR, se utilizaron tubos de 200µl de capacidad debidamente
rotulados conteniendo concentraciones finales de los siguientes componentes:
Buffer de reacción de PCR (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3), 1.25 mM de
Cloruro de magnesio, 0.8 mM de mezcla de deoxinucleotidos trifofosfatos (200
mM de dATP, dATG. dATC y ATT), 1 pmol de los primers ED5 y ED12, 0.25 U
de Enzima Taq ADN Polimerasa (Eppendorf) y 100 ng de ADN genómico. Las
condiciones de ciclaje fueron: Tres ciclos inciales de 94°C por 1 minuto, 55°C
por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, seguido de 32 ciclos restantes de 94°C por
15 segundos, 55°C por 45 segundos y 72°C por 1 minuto. Se realizó una
extensión final de 72°C por 5 minutos y se programó a una temperatura de
almacenaje a 4°C. Finalmente los tubos fueron mantenidos a -20°C.
·Segundo round, se añadieron concentraciones finales de los siguientes
componentes: Buffer de reacción de PCR (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH
8.3), 1.4 mM de Cloruro de magnesio, 0.8 mM de mezcla de deoxinucleotidos
trifofosfatos (200 mM de dATP, dATG. dATC y ATT),
2 picomoles de los
primers ED31 y ED33, 0.25 U de Enzima Taq ADN Polimerasa (Eppendorf) y
un volumen de 1 ml de reacción de primer round para 20 ml de volumen final.
Para lograr la amplificación del gen de la envoltura en un volumen final de 100
ml, se tomó 1 ml de reacción de Segundo round de PCR como ADN molde.
Las condiciones de ciclaje fueron: Tres ciclos inciales de 94°C por 1 minuto,
9
55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, seguido de 32 ciclos restantes de 94°C
por 15 segundos, 55°C por 45 segundos y 72°C por 1 minuto. Se realizó una
extensión final de 72°C por 5 minutos y se programó a una temperatura de
almacenaje a 4°C. Finalmente los tubos fueron mantenidos a -20°C.
Ensayo de Movilidad de Heterodúplex (HMA)
Los productos de amplificación luego de ser analizados por electroforesis en
geles de agarosa fueron seleccionados y sometidos a HMA. Para tal efecto se
prepararon productos de PCR del gen env a partir de cuatro subtipos de
referencia A, B, C y F, los cuales fueron mezclados en igual proporción con 7 l
de producto de PCR de la muestra problema en un tubo conteniendo buffer de
alineamiento de heteroduplex 10X (1M de Cloruro de Sodio, 100 mM de Tris
HCl, pH 7.8 y 20 mM de EDTA). Seguidamente la mezcla fue sometida a 97 °C
por 3 min. e inmediatamente incubada en un baño de hielo (ºC).
Electroforésis para el análisis de movilidad de heterodúplex
Para realizar la identificación de los subtipos de VIH por HMA los productos de
PCR fueron separados por electroforésis en un gel no denaturante conteniendo
5% de poliacrilamida, TBE 1X (88 mM Tris borato, pH 8; 8.9 mM acido bórico y
2 mM de EDTA), 0.1% de APS y 0.066% de TEMED bajo un sistema
sumergido conteniendo buffer de electroforesis TBE 1X. La electroforésis se
llevó a cabo en una cámara de electroforésis vertical modelo V16-2
(GIBCO/VRL) de 19 cm de altura x 19.5 cm de ancho a una temperatura no
superior a los 22 °C a 250 V por 2 horas y setenta minutos. Posteriormente el
10
gel fue removido de la cámara para ser incubado en solución conteniendo 1
mg/ml de bromuro de etidio por un tiempo de 20 minutos. El gel colocado
directamente en un transiluminador de luz UV modelo TM-20 chromato-vue
(UVP Inc.). El tamaño de los heterodúplex fueron discriminados usando un
marcador de peso molecular de 1Kb ladder (Promega)
Análisis de infecciones mixtas por RFLP
Para la identificación de infecciones mixtas de VIH-1 se generaron patrones de
restricción en el gen gag de VIH-1 mediante el uso de la enzima Alu I. Este
ensayo fue estandarizado durante la ejecución del proyecto ““DETECCIÓN DE
SUBTIPOS DE VIH-1 EN TRABAJADORAS Y TRABAJADORES SEXUALES
DE LIMA Y CALLAO” y reportado recientemente (Yabar et al. 2005) Para tal
efecto, se tomaron volúmenes de 6 a 8 ul de los productos de amplificación. La
cantidad de producto de PCR utilizado dependió de la intensidad de la
fluorescencia emitida por la luz ultravioleta después de la incubación del ADN
con bromuro de etidio (ver más detalles en Electroforesis de ADN). La reacción
se llevó a cabo en un vial de 0.5 ml de capacidad de conteniendo 10 ul de
reacción de una concentración final de 6 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM de
NaCl, 6 mM de MgCl2, 1 mM de DTT y 0.1 U de enzima Alu I. La reacción de
digestión fue sometida a 37 °C por 1 hora.
Secuenciamiento de ADN
Para realizar el secuenciamiento de los genes de VIH se siguió el protocolo
establecido por los fabricantes del Kit de Secuenciamiento (Thermo Sequenase
11
Cy5 Dye Terminador Cycle Sequencing Kit).
En tal sentido se prepararon
cuatro conteniendo una mezcla de dideoxiadeninatrifosfato o ddATP (0.8 mM
de Cy5-ddATP y 2mM de deoxinucleótidos trisfosfatos o dNTPs), mezcla de
ddCTP (0.63 mM de Cy5-ddCTP y 2mM de dNTPs), mezcla de ddGTP (1.6mM
de Cy5-ddGTP y 2mM de dNTPs) y mezcla de ddTTP (1.3 mM de Cy5-ddTTP y
2mM de dNTPs). Seguidamente se añadieron volumenes entre 3 a 4 l de
producto de PCR purificado en una solución conteniendo 19.44 mM Tris-HCl
(pH 9.5), 8.7 mM MgCl2, 4 pmoles de uno de los primer ED31 y ED33 (gen
env) y 1.2 U de la enzima ADN polimerasa termosecuenasa I. La mezcla
maestra fue completamente homogeneizada y luego repartida en los tubos
conteniendo los ddNTPs y dNTPs. Cada uno de los tubos fueron sometidos a
las condiciones de PCR para la amplificación del gen env (descrito
previamente) exceptuando los pasos de denaturación y extensión final.
Culminado el proceso de amplificación se realizó la purificación de los
productos de PCR por centrifugación 0.4M de acetato de amonio, 0.59 g/l de
glicógeno y 88% de etanol frío puro (Merk). La mezcla fue incubada a -20 ºC
por 20 minutos y luego sometida a centrifugación a 14000 rpm por 30 minutos.
El sobrenadante fue removido cuidadosamente y el ADN fue lavado con 200 l
de etanol frío al 70%. Los tubos fueron brevemente centrifugados a 14000 rpm
y el sobrenadante eliminado.
El etanol remanente fue eliminado por
evaporación incubando los tubos en una estufa a 37 ºC por 3 minutos.
Finalmente el producto de PCR fue resuspendido en 6 l de formamida
desionizada con el fin de depositar el ADN sobre cada pocillo del gel de
secuenciamiento.
Para corroborar la confiabilidad de la lectura de las
12
secuencias de nucleótidos, se repetió más de dos veces el secuenciamiento de
ADN de cada muestra. Por cada repetición se volvió a hacer la extracción de
ADN genómico, PCR, Nested PCR, purificación de ADN y el secuenciamiento
de ADN propiamente dicho.
Determinación de recombinación por comparación de secuencias (Blast)
Se
analizaron
secuencias
mediante
el
programa
Genotyping
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi) con el fin de
determinar algún evento de recombinación intragenético.
Para lograr este
propósito las secuencias de ADN de cada muestra fueron introducidas en el
programa la cual realizó la comparación de secuencias de VIH usando una
base de datos del banco de genes (117 secuencias de referencia). Los
resultados fueron visualizados en forma de barras y de acuerdo a la identidad
obtenida por cada secuencia se asignó un score o puntaje.
Identificación del subtipo por análisis filogenético
Para
la
identificación
del
subtipo
genético
de
VIH-1
se
analizó
filogenéticamente cada secuencia a partir de los dos grupos de TS y NTS. En
ese sentido, se realizó la alineación de las secuencias usando el programa
ClustalW versión 1.83. Posteriormente, el árblo filogenético fue diseñado con
base a las secuencias alineadas usando el el método Neighbor-Joining (Saitou
& Nei, 1987) aplicando el modelo de Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980)
considerando 1000 boostrap como réplicas, omición de gaps y una distribución
gamma de 0.5. Para este análisis se utilizó el programa Mega versión 3.1.
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Todos los modelos matemáticos utilizados fueron seleccionados de acuerdo al
análisis generado por el programa Model Generador versión 6 con base a las
secuencias genéticas seleccionadas en este estudio.
14
RESULTADOS
PCR Nested PCR en muestras de VIH-1
De acuerdo a los resultados de Nested – PCR se logró amplificar un producto
de aproximadamente 550 pb (ver figura 1). Se observó una sensibilidad de
80%
A en el sistema de PCR para env.
Algunas muestras que no fueron
reactivas a PCR para este gen (98% de las evaluadas) sí lo fueron para el gen
gag (Datos no mostrados) lo cual descarta cualquier tipo de posibilidad de
inhibición en la reacción.
1
2
3
4
5
23
24
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
750 –
500 –
250 –
B
21
22
25
26
27
28
29
30
31
32
750 –
500 –
250 –
Figura 1. Análisis del fragmento de 550 pb del gen env a partir de un grupo de trabajadores
sexuales (Panel A) y población general de heterosexuales (Panel B). Carril 1 y 21: Control de
sistema. Carriles 2 y 22: Marcador de peso molecular 1Kb ladder. Carriles del 3 al 20 y del 23
al 32: Muestras de pacientes infectados.
15
Ensayo de Movilidad de Heterodúplex
De acuerdo a los resultados del Ensayo de Movilidad de Heterodúplex (HMA
por sus siglas en inglés, ver figura 2) se observó que el 84% (n = 27) de las
muestras analizadas fueron subtipo B, mientras que el resto dio resultados
indeterminados (Ver tabla 1). Estas últimas muestras serían después serían
confirmadas como subtipo B por secuenciamiento de ADN (Ver tabla 1).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Heteroduplex
Homoduplex
Figura 2. Análisis de HMA de una muestra de VIH-1 de trabajador sexual (BM13) subtipo B.
M: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder. Carril: HMA de la muestra BM13. Carriles del 2 al
9: HMA de BM13 con los subtipos de referencia A2, A3, B1, B2, C1, C2, C3 y F1. En el
recuadro se resaltan los heterodúplex de mayor movilidad que se forman al haber mayor
complementariedad de bases.
Análisis de infección mixta por RFLP
El análisis de restricción del gen gag a partir de las muestras reactivas a PCR
por env (19 muestras de TS y 13 muestras de NTS) reveló la presencia de un
16
solo caso de infección mixta entre las variantes VA1 + VA2 (VA = Variante Alu
I) (Ver figura 3).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura 3. Análisis de RFLP del gen gag usando la enzima Alu I para la identificación de
infecciones mixtas. En el recuadro se resalta un caso de infección mixta hallada en un TS.
Carriles del 1 al 5: TS, carriles del 7 al 9: NTS. Carril 6: Marcador de peso molecular.
Análisis de recombinación intragenética
Se
intentó
identificar
evidencias
de
recombinación
en
el
gen
(recombinación intragenética) usando el programa Genotyping tool.
env
Los
resultados revelaron la presencia de tramos de secuencias con regiones
altamente idénticas con formas recombinantes de los tipos B / CRF03, B /
CRF014 y CRF015 lo cual sugiere la existencia de recombinación
intragenética. En total se encontraron seis (6 / 32 = 19%) en TS y siete casos
en NTS (7 / 32 = 22%) (Ver figura 4 y tabla 1).
17
/------------------------------------------------------/ Gen env /-------------------------------------------------------/
B
(BF11)
B / CRF03
(BF13)
B / CRF014
(BM13)
CRF15
NTS4)
Figura 4. Análisis de recombinación intragenética mostrando las formas recombinantes representativas encontradas en TS y NTS.
18
Análisis filogenético entre TS y NTS
El análisis filogenético de las 32 muestras reactivas a PCR para env reveló que
el 100% de las muestras fueron subtipo B (Ver figura 5, boostrap = 84%). Este
análisis dio los mismos resultados usando tanto el método de Neighbor Joning
como el de Máxima Parsimonia lo cual confirma que el subtipo predominante
en muestras peruanas en general es el B.
En este mismo análisis filogenético cabe resaltar la formación de un clado
filogenético muy relacionado el cual estuvo conformado por la muestra NTS12
y la muestra de referencia TH14-B2 proveniente de Thailandia (boostrap =
96%)
De otro lado se realizó un análisis filogenético considerando cada grupo de
riesgo por separado (Figura 6). Los resultados revelaron la existencia de una
distribución de clados completamente diferente entre las muestras de TS y
NTS.
En el caso de NTS se observó la formación de dos sub-clados
filogenéticos diferentes los cuales fueron denominados NTS-I y NTS-II (Bootrap
= 66% y 54% respectivamente), mientras que el grupo de TS se observó una
distribución homogénea de subgrupos filogenéticos (Ver figura 6).
19
Bm52
Bm65
NTS28
NTS6
NTS9
BF23b
BF17
BF13b
BF4b
NTS27
NTS15
NTS7a
A11
BM98
BM90SEQ8
bm78
B
BM77SEQ10a
sf162-B3
BF11SEQ9a
Bm54
NTS5a
bm113
BF9
th14-B2
NTS12a
NTS19b
NTS17a
NTS4a
BM67
BM13a
A14rep
BM47
bz162-F1
bz163-F2
F
zm18-C2
in868-C3
C
ma959-C1
se9173-J1
se9280-J2
J
lbv21-G2
G
vi525-G3
ru131-G1
BF13
Figura 5. Identificación del subtipo genético de VIH-1 a partir de trabajadores sexuales (códigos BM y BF)
y No trabajadores sexuales (código A. Las llaves indican el subtipo genético de las secuencias analizadas
(en letras mayúsculas). Las secuencias resaltadas en cuadrados indican dos muestras de subtipo B de
referencia demostrando que las secuencias analizadas son subtipo B.
20
A
B
A7a
A7b
BF4a
A11
BF4b
A15
Bm52
A28
Bm65
BF17
A27
BM98
NTS-I
A6
bm96
A9
BM90SEQ8
A14a
BM90SEQ9
A14b
BM76
BF11SEQ9a
A14rep
BF11SEQ9b
A14rep2
Bm54
A5a
bm113
A5b
BM77SEQ10a
BM77SEQ10b
BM47
A12b
A12a
bm78
A17a
BM67
NTS-II
A19b
BM70
A19a
BF9
BM13a
A4b
Bm13b
A4a
lbv21-G2
BF13
OutgroupG2
Figura 6. Distribución filogenética de secuencias de VIH en trabajadores sexuales (Panel A) y
no trabajadores sexuales (Panel B). En el caso de NTS se observa la formación de dos subclados filogenéticos: NTS-I y NTS-II.
21
Tabla 1.
Resumen de datos en la población de trabajadores sexuales (TS) y no
trabajadores sexuales (NTS)
HMA
Análisis
Filogenético
gag / env
BF11
Subtipo B
Subtipo B
B
-
BF13
BF17
BF4
BF9
BM13
BM47
BM52
BM54
BM65
BM67
BM70
BM76
BM77
BM78
BM90
BM96
BM98
BM113
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
ND
Subtipo B
ND
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
ND
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
B /CRF03
B
B/CRF03
B
B/CRF014
B
B
B
B
B/CRF014
B/CRF03
B
B
B
B
B/CRF03
B
B
SI
-
NTS4
NTS5
NTS6
NTS7
NTS9
NTS11
NTS12
NTS14
NTS15
NTS17
NTS19
NTS27
NTS28
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
ND
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
ND
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
Subtipo B
CRF15
B
B
B
B
B/CRF03
CRF15
B/CRF14
B
CRF15
CRF15
B
B/CRF03
-
Codigo
Recombinación
Infección mixta VA1+VA2
Intragenética env (Blast) por análisis de RFLP (gag)
Nota. En el caso de TS los códigos BM y BF han sido usados para identificar a los
participantes de sexo masculino y femenino respectivamente.
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CONCLUSIONES
1. El presente estudio demuestra que el 100% de las muestras analizadas
tanto en TS como en NTS corresponden al subtipo B.
2. Se demuestra la presencia de un caso de infección mixta en la población de
TS
3. Existen diferencias en la distribución filogenética de TS y NTS. En este
último caso se han identicado dos grupos filogenéticos, uno de ellos
altamente relacionado con la cepa
correspondientes a TH14-B2 de
thailandia (boostrap = 96%)
4. Se han encontrado evidencia de recombinación tanto en TS (19%) como en
NTS (22%)
5. Existen diferencias a nivel de cladogenésis entre NTS y TS hallándose dos
sub-clados filogenéticos en NTS denominados NTS-I y NTS-II
6. En síntesis, existen diferencias de variabilidad genética entre ambas
poblaciones principalmente a nivel de recombinación intragenética y
cladogenésis.
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