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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1
INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON
DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº49
CARLOS AUGUSTO YÁBAR V.
JAVIER SALVATIERRA F.
EBERTH QUIJANO.
2007
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
ARTÍCULO:
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS
CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO SEXUAL
AUTORES:
1Carlos Augusto Yábar V.; 2Javier Salvatierra F.; 2Eberth Quijano.
1. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, Instituto Nacional de
Salud
2. Centro Especializado en Enfermedades de Transmisión Sexual “Alberto
Barton”
2
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
RESUMEN
Objetivo. Realizar un análisis genético del VIH-1 infectando grupos humanos
con diferente comportamiento sexual. Materiales y métodos. Se seleccionó
una población de 80 sujetos infectados con VIH-1 de los cuales 30 fueron
hombres homosexuales que practican el trabajo sexual (HTS), diez
trabajadoras sexuales (MTS) y 40 sujetos heterosexuales (SH). Se realizó la
extracción de ADN genómico y la amplificación de los genes gag y env por
PCR. Seguidamente se realizó un rastreo de los subtipos genéticos del virus
por Ensayo de Movilidad de Heterodúplex (HMA) y se confirmaron los
resultados por análisis de secuencia.
Asimismo se hizo una búsqueda de
casos de infecciones mixtas mediante análisis de RFLP del gen gag y
finalmente se analizaron eventos de recombinación intragenética entre las tres
poblaciones usando el programa Recombination Detection Program versión
1.08.
Resultados.
De acuerdo a los resultados de PCR, se logró la
amplificación de 65 muestras (81%) de las cuales 40 (62%) fueron
secuenciadas completamente. El análisis de HMA y secuenciamiento reveló
que todas las muestras de VIH de todos los grupos de riesgo fueron subtipo B
con excepción de una muestra que correspondió al subtipo D. De manera
interesante se observó un solo caso de infección mixta de VIH-1 en un HTS.
De otro lado, el análisis de recombinación reveló la existencia de múltiples
formas recombinantes entre HTS y SH. Finalmente, el análisis de diversidad
de nucleótidos (Pi) reveló un mayor índice en el grupo de HTS Conclusión.
Se demuestra la existencia de diferencias genéticas en el VIH-1 que circula
entre las tres poblaciones de riesgo, principalmente a nivel de diversidad y
distancia genética, recombinación intragenética e infecciones mixtas.
PALABRAS CLAVE: VIH, variabilidad genética, grupos de riesgo
3
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
ABSTRACT
Aim.
To perform a genetic analysis of HIV-1 infecting human groups with
different sexual behavior. Material and Methods. Eighty HIV-infected subjects
were selected which thirty of them were homosexual sexual workers (HSW), ten
male sexual workers and forty heterosexual subjects (HS). DNA genomic was
extracted and en and gag genes were amplified by PCR.
Following this,
genetic subtypes were determined by Heteroduplex Mobility Assay (HMA) and
confirmed by DNA sequencing. Likewise, a screening of mixed infections was
perform by gag gene RFLP assay and finally intragenic recombination cases
were determined among the three populations using the Recombination
Detection Program version 1.08. Results. According the PCR data, sixty five
samples were amplified (81%) which of them forty (62%) were completely
sequenced. HMA and DNA sequencing analysis revealed that all HIV-1
samples were subtype B excepting one which was subtype D. Interestedly one
case of mixed infection was observed from one HSW. Recombination analysis
revealed multiples cases between HSW and HS. Finally diversity nucleotide
index (Pi) showed a high index into HSW than other groups. Conclusion. This
study shows genetic differences among HIV circulating in three risk populations,
mainly to level of diversity and genetic distances, intragenic recombination and
mixed infections.
KEY WORDS: HIV, genetic variability, risk group
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
INTRODUCCIÓN
El VIH es uno de los agentes patógenos con mayor tasa de variabilidad
genética y con una gran habilidad para adaptarse a las nuevas condiciones de
su hospedero humano1-3. Los estudios realizados al respecto revelan una alta
tasa de diversificación especialmente en el grupo M, el principal grupo del VIH1, el cual se divide en la actualidad en más de 11 subtipos diferentes1.
Asimismo se han descrito hasta la fecha 16 diferentes formas recombinantes
circulantes de VIH-1 en todo el mundo2, de las cuales siete han sido
recientemente caracterizadas en América2,4,5. La presencia de recombinación
en VIH-1 se debe básicamente a la existencia de eventos de superinfección y
co-infección (infecciones mixtas) de múltiples variantes genéticas del virus,
eventos que han sido demostrados en los últimos diez años6-8. Todos estos
elementos en su conjunto forman parte del proceso evolutivo del virus,
facilitado por la transcriptasa reversa la cual comete un error por cada 104
nucleótidos1; pero también relacionado en parte a los diferentes modos de
transmisión por parte de la actividad humana 3,10.
Con relación a este último punto, recientes reportes muestran evidencias que
sugieren una relación entre la distribución epidemiológica de subtipos genéticos
de VIH-1 y el modo de transmisión del virus. Por citar un ejemplo, el subtipo B
es
la
variante genética
predominante en
la población de hombres
homosexuales en diferentes regiones del mundo3,11, mientras que los subtipos
F y C están asociados a la población heterosexual en Argentina y
Sudafrica11,12.
De manera interesante, la forma recombinante BF ha sido
encontrada frecuentemente entre usuarios de drogas intravenosas de
Argentina, sugiriendo una posible asociación entre este grupo de riesgo y la
variante BF12. En el Perú, la variante genética de mayor prevalencia es el
subtipo B, sin embargo también se han reportado otros subtipos en algunos
casos puntuales como el A, C y la formas recombinantes BF y CRF17_BF
13,14
,
sin existir aparentemente ninguna correlación entre los diferentes grupos de
riesgo y el subtipo genético. Es importante señalar que dichos estudios fueron
realizados considerando en su mayor parte población de hombres que tiene
sexo con otros hombres (HSH) y en menor número a trabajadoras sexuales
5
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
(MTS) y población general, faltando realizar mayores análisis genéticos en
otros grupos de riesgo.
Con relación a este punto, hemos descrito
recientemente las características del comportamiento sexual de un nuevo
grupo de riesgo formado por hombres homosexuales que practican el trabajo
sexual (HTS). Nuestros datos revelaron un alto consumo de drogas no
intravenosas, frecuente contacto sexual con clientes extranjeros dentro y fuera
del país así como también continuo ejercicio de la prostitución en más del 80%
de los sujetos infectados con VIH, características inusuales en comparación
con el grupo de MTS16. Es de resaltar que al presentar un comportamiento de
riesgo diferente, los HTS podrían albergar cepas virales con características
genéticas diferentes a otros grupos de riesgo, influyendo de manera importante
en la dinámica de transmisión del VIH-1, hecho que requiere ser demostrado.
Por tanto, el objetivo del presente estudio fue realizar un análisis genético del
VIH-1 infectando tres diferentes poblaciones de riesgo tales como HTS, MTS y
sujetos heterosexuales (SH) a través de la identificación de los subtipos
genéticos, eventos de recombinación intragénica, infecciones mixtas y
diversidad genética.
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio es de tipo descriptivo restrospectivo. Se seleccionó un
grupo de 80 muestras de sangre congelada proveniente de los proyectos:
“Detección de subtipos de VIH-1 en trabajadoras y trabajadores sexuales de
Lima
y Callao”
e “Identificación
molecular
de mutaciones
puntuales
relacionadas a resistencia a drogas en VIH-1” financiados por el Instituto
Nacional de Salud. Todas las muestras fueron seleccionadas de acuerdo a los
criterios de inclusión siguientes: 1) Muestras clínicas en óptimo estado de
congelación. 2) Muestras clínicas reactivas a PCR por el gen gag, pol y RT. 3)
Muestras clínicas con ficha de encuesta sobre datos personales (nombre,
edad, sexo) y consentimiento informado.
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
Extracción de ADN
Para realizar la extracción de ADN se tomó un volumen de 200 l de sangre
periférica y se siguieron los procedimientos recomendados por el fabricante del
Kit de extracción de ADN a partir de sangre QIABlood (QIAGEN). Los tubos
conteniendo la solución de ADN total fueron almacenados a -20°C para su
posterior utilización.Los tubos conteniendo el ADN purificado en solución fueron
almacenados a -20°C para su posterior utilización.
PCR Nested PCR para la amplificación del gen gag
La amplificación de la porción p24-p7 del gen gag fue realizada de acuerdo a
las especificaciones recomendadas por Van der Auwera & Heyndrick17,
mediante una primera corrida de PCR en tubos de 200 µl de capacidad
conteniendo concentraciones finales de los siguientes componentes: Buffer de
reacción de PCR II (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3), 2.5 mM de Cloruro
de magnesio, 0.8 mM de mezcla de deoxinucleótidos trifosfatos (200 mM de
dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0.2 pmoles de los primers H1G777 y H1P202,
0.25 U de Enzima Taq ADN Polimerasa (Applied Biosystem) y 100 ng de ADN
molde. Las condiciones de ciclaje fueron: 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos.
50 °C por 30 segundos y 72 °C por 2 minutos, 1 ciclo final de 72°C por 7
minutos y por último una temperatura de almacenaje de 4 °C. Los tubos fueron
mantenidos a esta temperatura hasta el momento de dar inicio al segundo
PCR; o bien fueron almacenados a -20 °C por toda la noche.
En la segunda
corrida de PCR (Nested-PCR), se mezclaron concentraciones finales de los
mismos componentes con excepción de los primers H1Gag584 y g17 (0.4
pmoles) y un volumen de 2 l de reacción de primer round para 20 l de
volumen final. Las condiciones de ciclaje fueron: tres ciclos iniciales de 94 °C
por 1 minuto, 50 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto, seguido de 32 ciclos
restantes de 94 °C por 30 segundos, 45 °C por 30 segundos y 72 °C por 2
minutos. Se realizó una extensión final de 72 °C por 7 minutos y finalmente se
programó una temperatura de almacenaje a 4 °C.
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
PCR - Nested PCR para la amplificación del gen env
La amplificación del gen env fue en dos pasos de PCR siguiendo las
especificaciones recomendadas por Delwart et al.18. En ese sentido se realizó
una primera corrida de PCR en tubos de 200 l conteniendo concentraciones
finales de buffer de reacción de PCR (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3),
1.25 mM de Cloruro de magnesio, 0.8 mM de mezcla de deoxinucleotidos
trifofosfatos (200 mM de dATP, dATG. dATC y ATT), 1 pmol de los primers
ED5 y ED12, 0.25 U de Enzima Taq ADN Polimerasa (Eppendorf) y 100 ng de
ADN genómico. Las condiciones de ciclaje fueron: Tres ciclos inciales de 94°C
por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, seguido de 32 ciclos
restantes de 94°C por 15 segundos, 55°C por 45 segundos y 72°C por 1
minuto. Se realizó una extensión final de 72°C por 5 minutos y se programó a
una temperatura de almacenaje a 4°C. Durante la segunda corrida de PCR
(PCR anidado), los componentes y concentraciones fueron similares con
excepción del Cloruro de magnesio (1.4 mM) y los primers ED31 y ED33 (2
picomoles) y finalmente un volumen de 1 l de reacción de primer round para
20 l de volumen final. Las condiciones de ciclaje fueron: Tres ciclos inciales
de 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, seguido de 32
ciclos restantes de 94°C por 15 segundos, 55°C por 45 segundos y 72°C por 1
minuto. Se realizó una extensión final de 72°C por 5 minutos y se programó a
una temperatura de almacenaje a 4°C.
Finalmente los tubos fueron
mantenidos a -20°C.
Ensayo de Movilidad de Heterodúplex (HMA)
Los productos de amplificación luego de ser analizados por electroforesis en
geles de agarosa fueron seleccionados y sometidos a HMA18. Para tal efecto se
prepararon productos de PCR del gen env a partir de cuatro subtipos de
referencia A, B, C y F, los cuales fueron mezclados en igual proporción con 7 l
de producto de PCR de la muestra problema en un tubo conteniendo buffer de
alineamiento de heteroduplex 10X (1M de Cloruro de Sodio, 100 mM de Tris
HCl, pH 7.8 y 20 mM de EDTA). Seguidamente la mezcla fue sometida a 97 °C
por 3 min. e inmediatamente incubada en un baño de hielo (0 ºC).
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
Electroforésis para el análisis de movilidad de heterodúplex
Para realizar la identificación de los subtipos de VIH por HMA los productos de
PCR fueron separados por electroforésis en un gel no denaturante conteniendo
5% de poliacrilamida, TBE 1X (88 mM Tris borato, pH 8; 8.9 mM acido bórico y
2 mM de EDTA), 0.1% de APS y 0.066% de TEMED bajo un sistema
sumergido conteniendo buffer de electroforesis TBE 1X. La electroforésis se
llevó a cabo en una cámara de electroforésis vertical modelo V16-2
(GIBCO/VRL) de 19 cm de altura x 19.5 cm de ancho a una temperatura no
superior a los 22 °C a 250 V por 2 horas y setenta minutos. Posteriormente el
gel fue removido de la cámara para ser incubado en solución conteniendo 1 g
/ ml de bromuro de etidio por un tiempo de 20 minutos. El gel fue colocado y
registrado directamente en un documentador de geles modelo BioDoc-It
System (UVP Inc.).
El tamaño de los heterodúplex fueron discriminados
usando un marcador de peso molecular de 1Kb ladder (Promega)
Análisis de infecciones mixtas por RFLP
Para la identificación de infecciones mixtas de VIH-1 se generaron patrones de
restricción en el gen gag de VIH-1 mediante el uso de la enzima Alu I cuyos
datos
fueron reportados recientemente19.
Para tal efecto, se tomaron
volúmenes de 6 a 8 l de los productos de amplificación dependiendo de la
intensidad del producto de PCR. La reacción se llevó a cabo en un vial de 0.5
ml de capacidad de conteniendo 10 ul de reacción de una concentración final
de 6 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM de NaCl, 6 mM de MgCl2, 1 mM de DTT
y 0.1 U de enzima Alu I. La reacción de digestión fue realizada a 37 °C por 1
hora.
Secuenciamiento de ADN
Para realizar el secuenciamiento de los genes de VIH se siguió el protocolo
establecido por los fabricantes del Kit de Secuenciamiento (Thermo Sequenase
Cy5 Dye Terminador Cycle Sequencing Kit. Se añadió volumenes entre 3 a 4
l de producto de PCR purificado en una solución conteniendo 19.44 mM Tris-
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
HCl (pH 9.5), 8.7 mM MgCl2, 4 pmoles de uno de los primer ED31 y ED33 y 1.2
U de la enzima ADN polimerasa termosecuenasa I. La mezcla maestra fue
completamente homogeneizada y luego repartida en los tubos conteniendo
ddNTPs marcados con Cy5 y dNTPs. Cada uno de los tubos fueron sometidos
a las condiciones de PCR para la amplificación del gen env (descrito
previamente) exceptuando los pasos de denaturación y extensión final.
Culminado el proceso de amplificación se realizó la purificación de los
productos de PCR por centrifugación 0.4M de acetato de amonio, 0.59 g/l de
glicógeno y 88% de etanol frío puro (Merk). La mezcla fue incubada a -20 ºC
por 20 minutos y luego sometida a centrifugación a 14000 rpm por 30 minutos.
El sobrenadante fue removido cuidadosamente y el ADN fue lavado con 200 l
de etanol frío al 70%. Los tubos fueron brevemente centrifugados a 14000 rpm
y el sobrenadante eliminado.
El etanol remanente fue eliminado por
evaporación incubando los tubos en una estufa a 37 ºC por 3 minutos.
Finalmente el producto de PCR fue resuspendido en 6 l de formamida
desionizada con el fin de depositar el ADN sobre cada pocillo del gel de
secuenciamiento.
Para corroborar la confiabilidad de la lectura de las
secuencias de nucleótidos, se repetió más de dos veces el secuenciamiento de
ADN de cada muestra. Por cada repetición se volvió a hacer la extracción de
ADN genómico, PCR, Nested PCR, purificación de ADN y el secuenciamiento
de ADN propiamente dicho.
Determinación de recombinación
Se
analizaron
secuencias
mediante
el
programa
Genotyping
tool
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi) con el fin de
realizar una búsqueda heurística de algún evento de recombinación
intragenético.
Para lograr este propósito las secuencias de ADN de cada
muestra fueron introducidas en el programa la cual realizó la comparación de
secuencias de VIH usando una base de datos del banco de genes (117
secuencias de referencia). Los resultados fueron visualizados en forma de
barras y de acuerdo a la identidad obtenida por cada secuencia se asignó un
score o puntaje.
Las muestras potencialmente recombinantes fueron
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
confirmadas mediante el programa RDP (Recombination Detection Program
versión 1.08)20 para una verificación estadísticamente significativa de la
presencia de recombinación de cada muestra perteneciente a uno de los
grupos de riesgo.
Identificación del subtipo por análisis filogenético
Para
la
identificación
del
subtipo
genético
de
VIH-1
se
analizó
filogenéticamente cada secuencia a partir de los dos grupos de TS y SH. En
ese sentido, se realizó la alineación de las secuencias usando el programa
ClustalW versión 1.83. Posteriormente, el árbol filogenético fue diseñado con
base a las secuencias alineadas usando el el método Neighbor-Joining21
aplicando el modelo de Kimura 2 parámetros22 considerando 1000 boostrap
como réplicas, omición de gaps y una distribución gamma de 0.5. Para este
análisis se utilizó el programa Mega versión 3.123.
Todos los modelos
matemáticos utilizados fueron seleccionados de acuerdo al análisis generado
por el programa Model Generador versión 6 con base a las secuencias
genéticas seleccionadas en este estudio.
Análisis de diversidad de nucleótidos (Pi) y distancia genética
Para calcular el análisis de diversidad de nucleótidos (Pi) se recurrió al
programa DAMBE versión 4.5.2724 para cada uno de los grupos de riesgo.
Para el cálculo de la distancia genética se utilizó el programa Mega utilizando el
modelo de Kimura 2 parámetros con un boostrap de 1000 réplicas.
11
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
RESULTADOS
PCR Nested PCR en muestras de VIH-1
De acuerdo a los resultados de Nested – PCR se logró amplificar un producto
de aproximadamente 550 pb (ver figura 1). Se observó una sensibilidad de
80% en el sistema de PCR para env.
Algunas muestras que no fueron
reactivas a PCR para este gen (98% de las evaluadas) sí lo fueron para el gen
gag (Datos no mostrados) lo cual descarta cualquier tipo de posibilidad de
inhibición en la reacción.
1
2
3
4
5
23
24
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
750 –
500 –
250 –
B
21
22
25
26
27
28
29
30
31
32
750 –
500 –
250 –
Figura 1. Análisis del fragmento de 550 pb del gen env a partir de un grupo de trabajadores
sexuales (Panel A) y población general de heterosexuales (Panel B). Carril 1 y 21: Control de
sistema. Carriles 2 y 22: Marcador de peso molecular 1Kb ladder. Carriles del 3 al 20 y del 23
al 32: Muestras de pacientes infectados.
Ensayo de Movilidad de Heterodúplex
De acuerdo a los resultados del Ensayo de Movilidad de Heterodúplex (HMA
por sus siglas en inglés, ver figura 2) se observó que el 84% (n = 27) de las
12
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
muestras analizadas fueron subtipo B, mientras que el resto dio resultados
indeterminados (Ver tabla 1). Estas últimas muestras serían después serían
confirmadas por secuenciamiento de ADN (Ver tabla 1).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Heteroduplex
Homoduplex
Figura 2. Análisis de HMA de una muestra de VIH-1 de trabajador sexual (BM13) subtipo B.
M: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder. Carril: HMA de la muestra BM13. Carriles del 2 al
9: HMA de BM13 con los subtipos de referencia A2, A3, B1, B2, C1, C2, C3 y F1. En el
recuadro se resaltan los heterodúplex de mayor movilidad que se forman al haber mayor
complementariedad de bases.
Análisis de infección mixta por RFLP
El análisis de restricción del gen gag a partir de las muestras reactivas a PCR
por env (40 muestras) reveló la presencia de un solo caso de infección mixta
entre las variantes VA1 + VA2 (VA = Variante Alu I) (Ver figura 3).
13
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura 3. Análisis de RFLP del gen gag usando la enzima Alu I para la identificación de
infecciones mixtas. En el recuadro se resalta un caso de infección mixta hallada en un TS.
Carriles del 1 al 5: TS, carriles del 7 al 9: SH. Carril 6: Marcador de peso molecular.
Análisis de recombinación intragenética
Se
intentó
identificar
evidencias
de
recombinación
en
el
gen
(recombinación intragenética) usando el programa Genotyping tool.
env
Los
resultados revelaron la presencia de tramos de secuencias con regiones
altamente idénticas con formas recombinantes de los tipos B / CRF03, B /
CRF014 y CRF015 lo cual sugiere la existencia de recombinación
intragenética. En total, a través del análisis blast se encontraron seis (6 / 32 =
19%) en TS y siete casos en SH (7 / 32 = 22%) (Ver figura 4 y tabla 1).
14
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO SEXUAL
/------------------------------------------------------/ Gen env /-------------------------------------------------------/
B
BF11 (MTS)
B / CRF03
BF13 (MTS)
B / CRF014
BM13 (HTS)
CRF15
A4 (SH)
Figura 4. Análisis de recombinación intragenética mostrando las formas recombinantes representativas encontradas en HTS. MTS y SH.
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ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
Para corroborar si la presencia de recombinación por comparación de
secuencias Blast fue estadísticamente significativa, cada secuencia fue
analizada con cinco métodos de detección de recombinación diferentes usando
el programa RDP versión 1.08. De acuerdo a los resultados, se identificaron
solo dos casos de recombinación en HTS (B/C) y dos en SH (B_J) (p <
0.05)(Tabla 1). No se encontró recombinación entre grupos de riesgo. (datos
no mostrados)
Análisis filogenético
El análisis filogenético de las 40 muestras reactivas a PCR para env reveló que
el 100% de las muestras fueron subtipo B (Ver figura 5). Este análisis dio los
mismos resultados usando tanto el método de Neighbor Joning como el de
Máxima Parsimonia lo cual confirma que el subtipo predominante en muestras
peruanas es el B. Sin embargo se observó un grupo de muestras (BM13, A14,
BF9 y BM47) que formaron un grupo filogenético no determinado el cual se
ubicó entre los subtipos B y D(Ver figura 5).
De otro lado, se observó la formación de un grupo filogenético muy relacionado
entre muestras del grupo SH y la muestra de referencia TH14-B2 proveniente
de Thailandia (boostrap = 96%) el cual fue denominado “grupo Thai”.
16
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
B F4a
A 11
B F23b
B F17
99 B F13b
A 7a
A 51A
A 15
A 28
B m 52
B m 65
A 54a
A 27
A9
A6
B M 98
B M 96
A 53a
bm 78
B
B M 90S E Q8
B M 77S E Q10a
bm 113
B F11SE Q9a
B m 54
59
A 5a
A 12a
A 23
95
A 18B
th14-B 2
A 4a
A 19b
A 17a
A 25a
B M 70
s f162-B 3
B M 67
A 55a
A 52a
B1
Rwand A
60
93
A
sf170-A 3
Tanz A
96 bz162-F1
F
C
bz 163-F2
z m 18-C2
59
98
in868-C3
m a959-C1
81 se9173-J1
89
s e9280-J2
vi525-G3
75
ru131-G1
58
J
G
lbv21-G2
B M 13a
B F9
?
A14rep
100 A 14b
B M 47
B ots wana D
100
ug21-D1
D
99 Uganda D
0.02
Figura 5. Identificación del subtipo genético de VIH-1 a partir de HTS, MTS y SH. Las llaves indican el
subtipo genético de las secuencias analizadas (en letras mayúsculas). El recuadro en líneas punteadas
indica un clado filogenético de muestras SH relacionados a la cepa Thai. El signo de interrogación
muestra un grupo filogenético de clasificación aún indeterminada.
17
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
Tabla 1.
Resumen de datos en la población de HTS, MTS y SH
Subtipos
Grupo
riesgo
MTS
MTS
MTS
MTS
MTS
MTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
HTS
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
SH
Codigo HMA
BF11
B
BF13
B
BF17
B
BF4
B
BF9
B
BF23
B
Filogenia
B
B
B
B
B
B
Análisis de recombinación
RDP
Blast
P < 0.05
B
B /CRF03
B
B/CRF03
B
B
-
BM13
BM47
BM52
BM54
BM65
BM67
BM70
BM76
BM77
BM78
BM90
BM96
BM98
BM113
B
ND
B
ND
B
B
B
B
B
B
B
B
ND
B
B
ND
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B/CRF014
B
B
B
B
B/CRF014
B/CRF03
B
B
B
B
B/CRF03
B
B
A4
A5
A6
A7
A9
A11
A12
A14
A15
A17
A19
A23
A25
A27
A28
A51
A52
A53
A54
A55
B
B
B
ND
B
B
B
B
B
B
ND
B
B
B
B
B
B
ND
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
CRF15
B
B
B
B
B/CRF03
CRF15
B/CRF14
B
CRF15
CRF15
B
B
B
B/CRF03
B
B
B
B
B
B/J
B/G
B/D
B/G
B/G
-
Infección
mixta
SI
-
18
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
Diversidad genética (Pi)
Los datos de análisis de diversidad (Pi) de nucleótidos dentro de cada grupo de
riesgo revelaron que el mayor índice se encontró entre HTS (0.128) mientras
que el mínimo valor se encontró entre MTS (0.11) (Tabla 2). Del mismo modo
el análisis de distancia genética entre grupos de riesgo demostró que el mayor
índice se presentó entre HTS y SH (0.141), mientras que el más bajo valor fue
encontrado entre MTS (0.113). (Tabla 3).
Tabla 2
Diversidad nucleótidos (Pi) de cepas de VIH-1 correspondiente a cada
grupo de riesgo
HTS
MTS
SH
HTS
0.128
MTS
0.125
0.11
SH
0.126
0.122
0.123
Tabla 3
Distancia genética de cepas de VIH-1 correspondiente a cada grupo de
riesgo
HTS
MTS
SH
HTS
0.14
MTS
0.137
0.113
SH
0.141
0.135
0.133
19
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
DISCUSIÓN
En el presente estudio hemos realizado un análisis genético del VIH-1
circulando entres tres grupos de riesgo diferentes con el fin de encontrar
diferencias en las características genéticas del virus. Este planteamiento parte
de evidencias que demuestran una asociación entre la forma de transmisión del
VIH-1 y la variante genética. Al respecto, nuestros resultados demuestran que
el subtipo B de VIH-1 sigue siendo la variante predominante sin importar de
qué grupo de riesgo se trate.
Este hecho podría guardar relación con las
características del comportamiento humano que podrían favorecer la
transmisión de algunas variantes genéticas con mayor éxito que otras. En el
caso de Argentina por ejemplo, el subtipo F es más prevalente que el subtipo
B, principalmente entre usuarios de drogas intravenosas12,13, hecho que en
nuestro país sucede lo contrario debido a que la prevalencia de dicho grupo de
riesgo es baja25 desfavoreciendo probablemente la expansión del subtipo F
cuya frecuencia en comparación con el subtipo B también es baja14. Por tanto,
la existencia de un nuevo grupo de riesgo podría alterar la distribución de
variantes genéticas de VIH-1 en nuestro país. Al respecto hemos descrito las
características epidemiológicas de un grupo de riesgo formado por HTS16, el
cual se trata de una población vulnerable muy poco estudiada en nuestro
medio. Evidencias epidemiológicas demuestran que se trata efectivamente de
un grupo con conductas de transmisión totalmente diferentes a las MTS16 por lo
que podría influir de manera importante sobre las características genéticas del
VIH-1. En tal sentido, nuestros datos de análisis filogenético demuestran que
el subtipo B es la variante predominante en esta población, lo cual podría
deberse a la práctica homosexual, la cual está fuertemente relacionada a una
alta prevalencia de esta variante genética3. Sin embargo, el hecho que esta
población ejerza la prostitución en el extranjero y tenga frecuente contacto
sexual con clientes extranjeros sugiere una probable transmisión de nuevas
variantes de VIH, eventos de infecciones mixtas y recombinación entre cepas
de VIH. De manera interesante, el análisis de RFLP demostró la existencia de
un evento de infección mixta en un HTS (muestra BM52).
De manera
importante los datos de la encuesta del paciente portador de esa muestra
20
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
revelaron que el sujeto tuvo contacto sexual con múltiples clientes extranjeros
provenientes de EEUU y Corea.
Es importante señalar que el contacto con
clientes extranjeros es una conducta de riesgo asociado a la transmisión de
VIH tal como fue demostrado por Bautista et al.26 lo cual sugiere la existencia
de contacto sexual sin protección. Asimismo es de resaltar que múltiples casos
de infecciones mixtas han sido reportados principalmente en sujetos
homosexuales con alta promiscuidad sexual y en trabajadoras sexuales8,9, por
lo que su presencia en la población de HTS podría ser frecuente y en
consecuencia requeriría ser estudiado con mayor profundidad.
De otro lado, nuestros datos demostraron la presencia de un grupo de
muestras de VIH que aparentemente formaron un clado filogenético diferente
entre los subtipos B y D.
Al respecto, es probable que algunos sitios de
recombinación e hipermutación existentes en la secuencia de dichas muestras
no hayan permitido definir completamente su identidad genética, tal como
ocurrió de manera similar con muestras de VIH de Brasil28. En consecuencia
estas cepas virales podrían presentar algunos tramos dentro de la región C3V5 de env muy similares al subtipo D. Debido a que este último subtipo nunca
ha sido reportado en nuestro país es probable que una porción genética de
esta variante se haya recombinado con el subtipo B a través del contacto
sexual con un portador extranjero. De manera interesante, el paciente portador
de una de las muestras en cuestión (muestra bm47, ver figura 5) reveló haber
tenido contacto sexual con clientes extranjeros aunque sin declarar a qué
nacionalidad pertenecieron.
Estos datos demuestran que el ejercicio de la
prostitución en el extranjero o contacto con clientes extranjeros dentro del país
podría ser una conducta de riesgo importante para la introducción de nuevas
variantes genéticas y eventos de recombinación de especies de VIH en el Perú.
Con relación a este último punto, hemos realizado el análisis de recombinación
intragenética demostrando la presencia de algunas formas recombinantes
intersubtipo en muestras de HTS y SH. Estos datos sugieren la existencia de
múltiples eventos de infecciones mixtas en estas poblaciones probablemente
debido a la práctica sexual sin protección aún en estado de infección viral.
Aunque los datos obtenidos mediante comparación de secuencias (Blast)
21
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
difirieron sustancialmente del programa RDP, es importante tomar en cuenta
ambos resultados a fin de contar con toda la información posible que permita
resolver con prontitud la identidad genética del agente infeccioso.
De otro lado, hemos calculado la diversidad de nucleótidos y la distancia
genética de VIH-1 entre los tres grupos de riesgo. Nuestros datos sugieren que
el grupo de HTS es mucho más diverso que los demás grupos de riesgo,
mientras que las MTS muestran una baja divergencia genética. Estos datos
podrían estar relacionados a las características de su comportamiento sexual,
desde que cerca del 50% de MTS dejan de practicar la prostitución después de
conocer su diagnóstico, mientras que en HTS más del 80% continúa ejerciendo
el comercio sexual16. Esta conducta de riesgo podría traer como consecuencia
una alta probabilidad de superinfección y recombinación entre cepas virales y
por tanto generar una mayor variabilidad genética tal como se ha demostrado
en el presente estudio.
En conclusión, nuestros datos demuestran diferencias en las características
genéticas del VIH-1 circulando en tres diferentes grupos de riesgo,
principalmente a nivel de variabilidad genética, recombinación e infecciones
mixtas. Sin embargo, es importante señalar que en este trabajo no se han
considerado otros grupos de riesgo importantes tales como personas privadas
de la libertad (PPL), clientes de trabajadoras sexuales y homosexuales
propiamente dichos.
En consecuencia, se recomienda continuar el estudio
ampliando el número de grupos de riesgo, de muestras y de marcadores
moleculares a fin de conocer con mayor detalle todos los eventos que ocurren
durante la evolución del virus en poblaciones de diferente conducta sexual.
22
ANÁLISIS GENÉTICO DEL VIH-1 INFECTANDO GRUPOS HUMANOS CON DIFERENTE COMPORTAMIENTO
SEXUAL
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