Download VoltageClamp2008 - Universidad de Chile

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Curso: FISIOLOGÍA GENERAL 2008
Laboratorio No. 4
EL IMPULSO NERVIOSO I.
En este trabajo práctico hará
mediciones de las corrientes iónicas bajo
voltage clamp usando los programas de
simulación Excel, que están basados en el
modelo de Hodgkin y Huxley 1952 para el
axón gigante de jibia1. El los
experimentos de Voltage Clamp el
experimentador ordena a un circuito
electrónico establecer un potencial
eléctrico a través de la membrana del
nervio y observa la intensidad de la
corriente necesaria para mantener este
potencial. Los potenciales son producidos
por generadores de pulsos controlados
electrónicamente por un computador. El
potencial eléctrico, V, se fija inicialmente
a un potencial de mantención (holding
potential) que es negativo, y cercano al
potencial de reposo de la membrana.
Desde este potencial de mantención se desplaza a otro potencial ya sea despolarizando o
hiperpolarizando la membrana. En la ilustración de más arriba hay un ejemplo en que el potencial de
mantención es de -60 mV. El pulso 1 es de -60mV y dura 0,5 ms. A este potencial la corriente es cero.
El potencial durante el pulso 2 es de 0 mV y la corriente es inicialmente de entrada y luego cambia a
una corriente de salida que se mantiene mientras dura el pulso. El pulso 3 es de -60 mV y la corriente
vuelve en forma instantánea casi a cero. La corriente temprana y transitoria es llevada por los iones
sodio y la corriente tardía y sostenida es llevada por los iones potasio.
Voltage Clamp.
La densidad de corriente que pasa la membrana, Im, (mA cm-2) está dada por la ecuación:
1
Hodgkin, A. L. y A.F. Huxley 1952. A quantitative description of membrane current and its application to conduction
and excitation in nerve. J. Physiol (London). 55:119-113. Ver también F. Bezanilla “El Impulso Nervioso” En: Biofísica y
Fisiología Celular, Latorre et al ed. Universidad de Sevilla, Sevilla 1996. Y el apéndice de esta guía
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
2
dV
dV
 Ii  C
 I Na  I K  I L
(1)
dt
dt
Donde C es la capacidad eléctrica de la membrana (Fcm-2) CdV/dt es la densidad de la corriente
capacitiva, Ii es la densidad de la corriente iónica, INa es la densidad de la corriente de sodio, IK es la
densidad de la corriente de potasio e IL es la densidad de la corriente de fuga (leak). Las corrientes
iónicas siguen ecuaciones de esta forma:
(2)
I x  Gx (V  Vx )
Donde Gx es la conductancia por centímetro cuadrado (mScm-2) de la corriente x y Vx es el potencial
de inversión de la corriente x.
Im  C
Separación de las corrientes iónicas.
Para separar las corrientes de sodio y potasio se usa la Tetrododoxina, TTX, que suprime la corriente
de sodio quedando la corriente de potasio. La corriente de sodio se obtiene restando la corriente de
potasio a la corriente total.
Corrientes de potasio.
La densidad de la corriente de potasio según Hodgkin y Huxley es
I K (V , t )  GK (V  VK )  N K g K n4 V  VK 
(3)
Donde GK es la conductancia de potasio por centímetro cuadrado de membrana, NK es el número de
canales por centímetro cuadrado, gK es la conductancia unitaria del canal de potasio, n es el valor de
una variable comprendida entre 0 y 1 que es función del potencial eléctrico, V, y del tiempo, VK es el
potencial de inversión de la corriente de potasio. La variable n representa la probabilidad de que un
sensor esté en estado activo. En experimentos en que se provocan cambios bruscos en el potencial
(experimentos de relajación), la cinética del sensor n es similar a la del canal de dos estados:
n(t ) n()  (n(0)  n() )et /  n
(4)
Donde n0 es el valor de n al comenzar el pulso de potencial y n es el valor de n para t , y n es la
constante de tiempo de n. Entonces, la ecuación general que describe el curso temporal de las
corrientes de potasio en un experimento de relajación, es

I K (t )  N K g K n0et /   n (1  et /  n ) V  VK 
4
(5)
Consideremos algunos casos particulares:
1) Un experimento en el que la membrana se encuentra hiperpolarizada (los canales están cerrados) y
se aplica un voltaje que la despolariza hasta un cierto potencial V. En este caso, el curso temporal de la
corriente de potasio inducida por la despolarización está dada por la Ec. 5, con n0 = 0:
I K (t )  N K g K n4 (1  et /  n )4 V  VK 
(6)
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
3
En este caso, el valor de n dependerá del potencial de membrana V.
2) Considere ahora una situación en que los canales se encuentran abiertos (debido a la aplicación de
un pre-pulso despolarizante, por ejemplo, +40 mV) y en esas condiciones la membrana es repolarizada
hasta un potencial en que todos los canales se cierren (por ejemplo, hasta -90 mV). En el primer
instante, los canales se encontrarán aún abiertos, de modo que existirá una corriente inicial
(instantánea) de potasio, la que caerá con el siguiente curso temporal (haciendo n0 = 1 y n = 0 en la
Ec. 5):
I K (t )  N K g K e
4t /  n
V  VK 
(7)
Para estudiar las corrientes de potasio use el programa IKSHOW.xls.
Este programa calcula el curso temporal de la corriente de potasio en condiciones de Voltage Clamp.
El potencial de mantención está en la celda B10.
El potencial del pulso 2 es D10
El potencial del pulso 3 es E10.
La duración del pulso 2 es D11
La duración del pulso 3 es E11.
El comando Ctrl d (despolariza) suma al pulso 2 el contenido de la celda G10.
El comando Ctrl h (hiperpolariza) resta al pulso 2 el contenido de la celda G10.
El comando Ctrl D suma al pulso 3 el contenido de la celda H10.
El comando Ctrl H resta al pulso 3 el contenido de la celda H10.
El tiempo está en la columna A, en milisegundos. El intervalo de tiempo t está en la celda F10,
inicialmente 0.02 ms. El voltaje está en la columna B y la corriente de potasio en la columna V.
Observe las corrientes de potasio generadas al despolarizar la membrana a partir de un potencial de
mantención de -140 mV (V(hold)) hasta +40 mV durante 10 ms y luego repolarizarla hasta -100 mV
(Para esto, fije la duración del Pulso 1 en 0 ms y asigne un valor de +40 mV al Pulso 2 y de -100 mV
al pulso 3.
Observe la forma sigmoidal del curso temporal de la corriente IK(t), que corresponde a lo descrito por
la Ec (6), ya que en este caso se puede suponer que antes de despolarizar la membrana n era cero.
NB. Para leer las coordenadas tiempo y corriente, ponga el puntero del mouse sobre un punto de la
curva.
Nota: Para todas las simulaciones que realizará con el programa IKSHOW.xls fije el potencial de
mantención en -140 mV y la duración del Pulso 1 en 0 ms.
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
4
Determinación del potencial de inversión de la corriente de potasio.
Para determinar el potencial de inversión de la corriente de potasio es necesario abrir los canales con
un pre-pulso y luego medir la corriente durante un pulso de prueba de diferentes voltajes.
 Para un pre-pulso de 40 mV (Pulso 2) mida la corriente instantánea al pasar a -100 mV
(Pulso3) La corriente en el primer instante del Pulso 3 está en la celda F11. Vea la nota al
pie2
 Repita la observación para diferentes voltajes del pulso de prueba (Pulso 3)
 Construya un gráfico de la corriente instantánea en función del potencial del Pulso 3.
 Determine el potencial de inversión de la corriente por intersección de la recta obtenida con el
eje del voltaje.
Determinación de la conductancia de potasio (GK) en el estado estacionario y de n.
Usted puede determinar el valor estacionario de GK en función del potencial, utilizando la Ec. 3. El
siguiente procedimiento le permitirá calcular el valor de GK al final del Pulso 2 (una vez alcanzado el
estado estacionario), en función del voltaje de ese pulso. Para distintos valores del voltaje del Pulso 2
mida la corriente instantánea generada inmediatamente después de repolarizar la membrana hasta -90
mV (Pulso 3). IK(t0,P3) en el primer intervalo de tiempo al potencial del Pulso 3, VP3 será:
I K (to, P3 )  NgK n4 ,VP2 VP3  VK   GK (VP3  VK )
(8)
Donde n,VP2 es n para el voltaje del Pulso 2 y es igual a n0 para el Pulso 3, de modo que las
conductancias de potasio al final del Pulso 2 y en el instante de comenzar el Pulso 3, son iguales (GK).
a) Intervalo de 20 a 200 mV.
 Mida IK(t0,P3) para diferentes voltajes del Pulso 2 entre 20 y +200mV.
 Calcule la conductancia a partir de IK(t0,P3) , VP3 y VK
 Anote sus resultados en la hoja “Resultados”.
b) Intervalo de 20 a -80 mV.
Para un pulso de prueba fijo de -90 mV ( Pulso 3) mida la corriente instantánea después de un
prepulso de -60 mV (Pulso 2). Observe que la densidad de corriente no ha llegado a un valor
independiente del tiempo a los 10 ms, por lo tanto necesita un Pulso2 más largo. Para extender el
Pulso 2 cambie Delta t a 0.06 ms (celda F10) y la duración de l Pulso 2 a 50 ms (Celda D11). Cambie
el contenido de la celda F11 a “V848”. Vea la nota al pie.
Para el intervalo completo desde -80 a 200 mV.
El contenido de la celda F11 es “=V515”, apunta a la celda que tiene la
densidad de la corriente un instante después del final del pulso 2. La columna V
contiene la densidad de corriente para todos los tiempos. Para determinar la
fila escriba el tiempo en la celda L4 y le la fila de la celda M4. Para al caso
de un Delta t de 0.02 ms la fila que corresponde al final de pulso2 de 10 ms es
la 514. Por lo tanto la fila del próximo intervalo de tiempo es la 515.
2
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4


5
Haga un gráfico de la conductancia en función del potencial del Pulso 2.
Suponga que el valor de la asíntota de la conductancia para voltajes muy positivos es la
medida a +200mV (GKmax)
GK max  Ng K
(9)
La conductancia GK,V medida a un voltaje V es NgKn4 por lo tanto n se puede calcular así:
n  4

GK ,V
GK ,max
(10)
Grafique n en función de V.
Determinación de n.
 Fije la duración del Puslo2 en 10 mS (Celda D11) y el intervalo de tiempo Delta t a 0.02 ms
(Celda F10).
 A partir del potencial de mantención de -140 mV despolarice la membrana hasta +20 mV
(Pulso2). Anote la intensidad de la corriente medida al final del pulso despolarizante, cuando
ésta llegue a un valor independiente del tiempo, IK(t)
I K (t )  Ng K n4 V  VK 

(11)
Ponga el puntero en un punto sobre la curva en que la corriente de potasio sea la mitad de la
registrada al final del pulso. Anote el tiempo transcurrido desde el inicio del pulso
despolarizante hasta este punto. Este tiempo es t1/2.
I K (t1 / 2 )  Ng K n4 (1  e t1 / 2 /  n ) 4 V  VK 
0,5 
I K (t1 / 2 )
 (1  e t1 / 2 /  n ) 4
I K (t )
t1 / 2  1,84 n
(12)
(13)
(14)
El procedimiento descrito para determinar la constante de tiempo servirá para potenciales iguales o
superiores a 20 mV, ya que para potenciales menores el valor máximo de la corriente, IK(t), no se
alcanza durante el intervalo de tiempo considerado. Este problema se puede solucionar modificando el
largo del pulso y el intervalo de tiempo, como lo hizo en la sección anterior, sin embargo, utilice la
alternativa siguiente:

Fije la duración del Pulso2 en 10 mS (Celda D11) el voltaje del Pulso2 en 0 mV ( Celda D10),
y el intervalo de tiempo Delta t en 0.02 ms (Celda F10).
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
6

Copie el curso temporal de la densidad de corriente de potasio a la hoja “Ajustes” usando el
Macro Ctrl. t.
La Hoja “Ajustes” está preparada para buscar las constantes de relajación para el voltaje del pulso 2 y
3. El curso temporal de la densidad de la corriente de potasio durante el Pulso2 está en el intervalo de
tiempo entre 0 y 10 ms y el del Pulso3 entre 10 y 20 ms. La corriente durante el intervalo 10 a 10 ms
se llama “corriente de cola” (tail current). Las constantes de relajación las buscará ajustando con
Solver el curso temporal de la densidad de la corriente de potasio dada por la ecuación 5.







Llene las celdas a la derecha de las etiquetas Gmax, V(K), usando los datos colectados en las
etapas anteriores.
Para el intervalo 0 a 10 ms n0 es el correspondiente a VHold. n es el correspondiente al
Pulso2.
Para el intervalo 10 a 20 ms n0 es el correspondiente a Puslo2 n es el correspondiente al
Pulso3.
Busque n para el voltaje del Pulso2 minimizando con Solver la suma de cuadrados ( Celda
C11) variando la celda C10 ( y posiblemente la C5)
Busque n para el voltaje del Pulso3 minimizando con Solver la suma de cuadrados ( Celda
F11) variando la celda F10 ( y posiblemente la F5)
Repita el procedimiento hasta cubrir el intervalo de potenciales
Recuerde las relaciones entre n, n, n, y n . Con n y n calcule n y n para cada voltaje y
haga las representaciones gráficas correspondientes.
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4

7
Corrientes de sodio.
La corriente de sodio según Hodgkin y Huxley 1952 está descrita por:
I Na (V , t )  N Na g Na m3hV  VNa 
(15)
Donde NNa es el número de canales de sodio en un centímetro cuadrado de membrana, gNa es la
conductancia unitaria de los canales de sodio, m es una variable que depende del voltaje y del tiempo,
toma valores entre 0 y 1 y da cuenta de la probabilidad de encontrar cada una de las tres sensores de
potencial en estado activo, h es otra variable que depende del voltaje y del tiempo y da cuenta de la
probabilidad de encontrar abierta la compuerta de inactivación. V es el potencial de la membrana y
VNa es el potencial de inversión de las corrientes de sodio.
Según Hodgkin y Huxley 1952, las cinéticas de las compuertas m y h son similares a la del canal de
dos estados:
m(t ) m  (m0  m )e  t /  m
(16)
Donde m es el valor de m para t , y m es la constante de tiempo de m.
h(t ) h   (h0  h )e  t /  h
(17)
Donde h es el valor de h para t , y h es la constante de tiempo de h.
Para estudiar las corrientes de sodio use primero el programa INaSHOW.xls y después
INaSHOW2.xls
El programa INaSHOW.xls tiene un formato similar al IKSHOW.xls, con las siguientes diferencias:
1. La corriente de sodio está en la columna AE;
2. La celda I10 tiene una variable que indica el efecto de la Pronasa, donde 0 ( o menor que cero)
indica la ausencia de Pronasa y 1 ( o mayor que 1) indica el 100% del efecto de la Pronasa.
3. Ctrl p aumenta el efecto de la Pronasa Ctrl n dismunye el efecto de la Pronasa. Ctrl. p suma el
contenido de J10 a I10, ctrl. n sustrae J10 del contenido de I10.
Observe el curso temporal de la corriente de sodio INa para diferentes amplitudes del Pulso 2. Para un
pulso despolarizante (Pulso 2) desde un potencial de mantención suficientemente negativo tal que m
a ese potencial sea 0 (y por lo tanto m0 = 0 para el Pulso 2), la corriente sigue un curso temporal dado
por la ecuación:

I Na (t )  Ng Na m3 1  e t /  n
 h  h
3

 h e  t /  h V  VNa 
(18)
En esta ecuación, h0 es igual a la probabilidad de encontrar abierta la compuerta de inactivación al
voltaje de mantención (es decir, es igual a h para el voltaje VHold); h es la probabilidad de
encontrar abierta la compuerta de inactivación al voltaje del pulso despolarizante (Pulso 2) después
de un tiempo muy largo. Los otros símbolos no necesitan definición.

0
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
8
Determinación del potencial de inversión de la corriente de sodio
 Considere la situación sin Pronasa.
 Mida la corriente en el pico de la corriente de sodio a diferentes potenciales del pulso 2.
 Haga un gráfico de la relación corriente-voltaje.
 Determine el potencial de inversión de las corrientes de sodio de la intersección de la curva
con el eje del voltaje.
Determinación de m, m en canales libres de inactivación.
Elimine la inactivación de los canales de sodio usando Pronasa. El efecto de la pronasa se instala con
Ctrl. p y se quita con Ctrl. n.
En presencia de Pronasa, el curso temporal de la corriente de sodio a partir de un potencial de
mantención que asegure que m inicialmente sea cero:

I Na (t )  Ng Na m3 1  e t /  n

 V  V 
3
Na
(19)
Usando un procedimiento similar al usado para los canales de potasio, diseñe un protocolo
para medir m, m m, y m. La corriente de sodio en el primer instante del pulso 3 está en la
celda F11.
Inactivación de los canales. Medidas de h y h
Para estudiar la inactivación de los canales de sodio use el programa INaSHOW2.xls.
El formato del programa es similar al IKSHOW.xls con estas diferencias:
No hay controles para el Pulso 3.
Ctrl s (short) acorta la duración del Pulso 2 en pasos igual a G11.
Ctrl l (long) alarga el Pulso 2.
La celda F11 contiene el mínimo de la corriente de sodio.
Determinación de h
 Para un Pulso 2 de -55 mV y 20 ms de duración mida la corriente en el pico de la corriente de
sodio durante el Pulso 3 que está a 0 mV. Celda F11.
 Repita la observación para otros voltajes del Pulso 2. NB. Si la corriente durante el pulso 2 es
más negativa que la corriente en el pulso 3, entonces la celda F11 tiene la corriente del pulso
2 y necesita leer con el cursor la corriente en el pico de la corriente durante Pulso 3.
 Grafique la corriente registrada en el pico durante el Pulso 3 en función del voltaje del Pulso 2.
 Busque el valor de la asíntota para esta corriente a voltajes muy negativos.
 Calcule h dividiendo la corriente medida para cada prepulso por la corriente máxima
obtenida del paso anterior.
Curso temporal del desarrollo de la inactivación h.
 Para un prepulso (Pulso 2 ) a -55 mV y 20 milisegundos y mida la corriente máxima de sodio
con un pulso de prueba de 0 mV (Pulso 3).
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4




9
Acorte la duración del prepulso manteniendo fijo el voltaje y anote en una tabla el voltaje y la
duración del prepulso, y la corriente pico de sodio durante el pulso de prueba.
Haga un gráfico de la amplitud de la corriente de sodio pico durante el pulso en función de la
duración del prepulso.
De la función exponencial resultante calcule h para el voltaje del pre-pulso.
Describa lo que observa al repetir la operación para diferentes voltajes del prepulso
Curso temporal del retorno de la inactivación h.
 Inactive los canales con un primer pulso despolarizante. (Pulso 1)
 Repolarice la membrana durante un tiempo corto para sacar los canales de la inactivación
(pulso 2).
 Mida la corriente de sodio con pulso de prueba (Pulso 3).
 Repita la medida cambiando la duración del pulso 2.
 Grafique la amplitud de la corriente de sodio durante el pulso 3, en función de la duración del
pulso 2.
 Calcule h para el potencial del pulso 2 de la función exponencial resultante
 Repita el procedimiento para diferentes voltajes del pulso 2
Corriente de fuga.
Con el programa ILeakSHOW.xls calcule el potencial de inversión y la conductancia de la corriente
de fuga.
¿Como funciona el programa?
Para el potencial de mantención el programa calcula el valor de n y n usando las ecuaciones 9.56,
9.57, 9.59 y 9.60 página 249 del libro Biofísica y Fisiología celular, Latorre et al. Las ecuaciones
correspondientes para m y h están en la página 253. Estos resultados quedan en la fila 14.
El programa lee de la columna A el potencial para el intervalo de tiempo siguiente, (la fila siguiente) y
calcula los valores correspondientes de n , n, m  , m, h, y h.
Con el valor de n para el intervalo presente y el valor de n para el intervalo anterior (n0 para el
presente) el programa calcula la derivada de la ecuación 4:
n  n(  )  t /  n
dn
  ( 0)
e
dt
n
(20)
Donde t es la duración del intervalo.
El valor de n para el intervalo presente se calcula usando los primeros términos de una serie de Taylor:
n  n( 0 ) 
dn
t
dt
(21)
El mismo procedimiento se usa para obtener m y h.
Con n, m y h para este intervalo y conociendo V, VNa, VK, VL, GNa, GK, GL el programa calcula IK,
INa, e IL.
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
El procedimiento se repite por 1000 filas.
10
Fisiología General 2008. Trabajo Práctico No. 4
APÉNDICE
11