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PRÁCTICA # 2
TÉCNICAS DE TINCIÓN
Objetivo
El alumno aprenderá y aplicará las técnicas básicas de tinción más frecuentes.
Generalidades
La coloración es el proceso de teñir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscópico forma, agrupación y
estructuras)
Un colorante es un compuesto orgánico que consta de anillos bencénicos y
grupos cromóforos ( agrupación de átomos que da color a ciertos compuestos) y
auxocromos ( sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las
características de absorción del cromóforo)
En el laboratorio de microbiología se pueden usar los colorantes de varias
formas como:
a) Para teñir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificación de microorganismos en base a sus características de
tinción, por ejemplo, si son o no alcohol-ácido resistentes, si son Gram positivas
o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y así
poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.
TINCIÓN DE BACTERIAS
La célula bacteriana intacta se tiñe fácilmente con colorantes básicos como el
cristal, azul de metileno y fucsina básica, pero relativamente mal con colorantes ácidos
como la eosina.
Un colorante básico es aquel constituido por un agrupamiento de átomos
orgánicos con carga positiva que será la parte activa del colorante ya que tendrá
afinidad por los ácidos nucleicos. Un colorante ácido es aquel que se encuentra
constituido por átomos orgánicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad
por el citoplasma.
TIPOS DE TINCIÓN
1. Tinción simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer más
fácilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna característica en especial.
Una tinción simple se lleva a cabo cubriendo con colorante básico un frotis seco
y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las células por un minuto y se
lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante
para que quede listo para observarse.
2. Tinción negativa. Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya
que tienen poca afinidad por la célula bacteriana por lo tanto como no se
absorben se colorea el fondo en el que están las bacterias pero la célula queda
incolora y transparente, así pues las bacterias aparecen como pequeñas áreas
iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con nigrosina, o neutral ( con
tinta china) son las más usadas.
3. Tinción diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como
químicamente, por lo cual su reacción ante algunos colorantes también será
diferente dando lugar así a grupos tintoreales característicos. Entre estos
grupos están los que se originan por la tinción descubierta por Hans Christian
Gram, esta tinción divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo
cual no solo sirve para diferenciarlas sino aún para elegir la terapia adecuada
en algunos casos. Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en
microbiología clínica como la de Ziehl- Neelsen.
4. Tinción estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su
afinidad se utilizan para teñir y detectar ciertas estructuras de la célula
bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cápsulas.
TINCIÓN SIMPLE
MATERIAL
2 portaobjetos
Asa bacteriológica
Aceite de inmersión
Microscopio
Mechero
Azul de metileno de Löeffler
Cepa de Escherichia coli
TÉCNICA
1. Preparar un frotis de E. coli de acuerdo a las indicaciones de la figura 1 y fijarlo
al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
4 portaobjetos
Asa bacteriológica
Aceite de inmersión
Microscopio
Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%
Nigrosina o tinta china
Puente de tinción
Cepa de Klebsiella pneumoniae
TÉCNICA
1. Hacer una suspensión ligera en solución salina de K. pneumoniae y mezclar una
gota de esta suspensión con una pequeña gota de nigrosina o tinta china en el
borde central del portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer
portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.
4. Observe con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
Asa bacteriológica
Aceite de inmersión
Microscopio
Mechero
Puente de tinción
Cepas de Gram negativos ( Escherichia coli) y de Gram positivos
(Staphylococcus aureus).
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina
TÉCNICA
1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno
con una mezcla de ambos microorganismos.
2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teñir con cristal violeta por un minuto.
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la
charola de tinción y añada goteando el etanol, dejando que corra por todo
el frotis. Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la acción decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el
frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN DE ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriológica
Aceite de inmersión
Microscopio
Mechero
Papel filtro
Lámpara de alcohol
Cepa de Bacillus subtilis
Ácido acético al 5%
Azul de metileno de Löeffler
TÉNICA
1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1.
2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lámpara de alcohol
hasta la emisión de vapores. Es importante que su puente de tinción esté
bien nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al
calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos
4. Lavar con agua corriente
5. Decolorar con ácido acético al 5% hasta que el frotis tome un ligero color
rosa
6. Lavar con agua corriente
7. Teñir durante 3 minutos con azul de metileno de Löeffler
8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el
objetivo de inmersión
FIGURA 1
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO
Presentación de resultados
1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:
a) Tipo de tinción
b) Nombre de la bacteria
c) Característica observada
2. Conteste el cuestionario
3. Conclusiones
4. Bibliografía