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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
MICROBIOLOGIA VETERINARIA
PRÁCTICA: TINCIONES ESPECIALES EN MICROBIOLOGIA
Debido a que las bacterias y otros microorganismos tienen un tamaño muy pequeño,
se requiere de tinciones biológicas para visualizarlos, demostrar detalles de su
estructura interna, o algunas funciones fisiológicas; además estos colorantes, son
utilizados como indicadores de pH en los medios de cultivos, y como indicadores
REDOX par demostrar la presencia o ausencia de condiciones de Anaerobiosis.
En su mayoría, los colorantes útiles son derivados del Alquitran. La estructura
fundamental alrededor de la cual están constituidos químicamente la mayoría de los
colorantes es el anillo Bencénico. La diferencia de los colorantes se basa en el número
y disposición de estos anillos y la sustitución de los átomos de Hidrógeno por otras
moléculas. Hay tres únicas sustituciones claves de un átomo de Hidrógeno del
Benceno que constituyen la estructura básica de la mayoría de los colorantes:
1) Sustitución de un grupo Metilo para formar Tolueno (metil-benceno).
2) Sustitución de un grupo oxhidrilo para formar fenol (ácido-carbólico).
3) Sustitución de un grupo amino para formar Anilina (fenilamina);
Tolueno (metil-benceno)
Anilina (fenilamina)
Fenol (ac.Carbólico)
La mayoría de los colorantes son derivados de la Anilina, están compuestos
generalmente, por uno o más anillos bencénicos por uniones químicas bien definidas
(Cromóforos) que están asociadas a la producción del color. Cómo no se conoce el
mecanismo básico del desarrollo del color, es posible que ciertos radicales químicos
tengan la propiedad de absorber luz de diferentes longitudes de onda, actuando como
prismas químicos; algunos de estos grupos cromóforos más comunes de los colorantes
son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2. La intensidad de coloración de un
colorante es directamente proporcional al número de radicales cromóforos del
compuestos.
Los colorantes se clasifican en base a los cromóforos presentes, se designan como
ACIDOS o BASICOS, términos relacionados no con el pH, sino una porción significativa
de la molécula si es aniónica o cationica.
Los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina
nuclear de las células, los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas tales
como: las estructuras citoplasmáticas.
De acuerdo a su composición pueden ser simples o compuestos: los simples son
aquellos que se disuelven en agua o alcohol; los compuestos son los formados por
varios colorantes y soluciones como el Colorante de GRAM.
COLORACION DE GRAM: composición, fundamento, utilidad y técnica de laboratorio.
COMPOSICIÖN: Esta constituido por: Cristal Violeta: colorante primario o básico,
que se une a la pared celular bacteriana. (color azul o violeta).
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LUGOL: solución de yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la adhesión del
cristal violeta a la pared celular.
ALCOHOL ACETONA: decolorante.
SAFRANINA o FUCSINA DE GRAM:
colorante secundario, que imparte una
coloración de contraste o contracolor (color rojo o rosado).
FUNDAMENTO DE LA COLORACION DE GRAM: Un frotis es tratado con una
solución de cristal violeta el cual se une a las paredes celulares bacterianas, luego de
un tratamiento con lugol, algunas bacterias debido a la naturaleza química de sus
paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del
tratamiento con un decolorante orgánico (alcohol acetona).
Tales bacterias se
denominan GRAM POSITIVAS. Las bacterias GRAM NEGATIVAS presumiblemente
debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración
primaria del cristal violeta aparecen rojas o rosadas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como colorante de contraste a sus paredes celulares, las GRAM POSITIVAS
aparecen al microscopio de color azul intenso o violeta.
UTILIDAD DE LA COLORACION DE GRAM: coloración diferencial, utilizada para
demostrar las propiedades tintoriales de todos los tipos de bacterias.
TECNICAS DE LA COLORACION DE GRAM.
1. Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.
2. Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama de un
mechero de Bunsen.
3. Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con
solución de Cristal Violeta por 1 minuto.
4. Pasando el minuto, lavar con agua destilada.
5. Cubrir el preparado con Lugol Gram por 1 minuto. Lavar nuevamente con agua
destilada.
6. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas
gotas del decolorante: alcohol acetona hasta no arrastrar más colorante violeta.
Esto, requiere habitualmente unos 30 segundos o menos.
7. Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte.
Cubrir la superficie con Safranina (contracolor), durante un minuto. Lavar con
agua.
8. Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando que
escurra el exceso de agua y que se seque el extendido.
9. Examinar el extendido al microscopio con objetivo de inmersión (100X).
Las bacterias Gram positivas se observan de color azul intenso o violeta.
Las bacterias Gram negativas se observaran de color rojo o rosado.
BIBLIOGRAFÍA
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T Stuart Waiker, Me Graw Hill, Mexico-2000-Editores S.A-Microbiología
Jawest - Meinick y Edelberg, 16a Edición- México - Manual Moderno Microbiología Médica.
Murray Patrick -2a Edición- 1993. Harcourt Brace- Microbiología Médica. 53
Restrepo
Angela, Robledo Jaime. 6a Edición - Corporación ParaInvestigaciones
Biológicas. Fundamentos De Medicina- Enfermedades Infecciosas.
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TALLER
NOTA: PARA DAR RESPUESTA A ESTAS PREGUNTAS POR FAVOR NO
CORTE Y PEGUE DE INTERNET (WIKIPEDIA Y/O/U SIMILARES)
1. ¿Cuáles son los errores que usted identificó que pueden influir en una
buena tinción de gram?
2. Estructuralmente ¿Qué funadamenta la tinción de gram en bacterias?
3. ¿Qué importancia diagnóstica tiene la tinción de Gram?
4. ¿Cómo sería la tinción de gram de una levadura?
5. ¿Esta tinción de Gram en levaduras tendrá la misma importancia
diagnóstica que para las bacterias?
6. ¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los reactivos utilizados
en la técnica de coloración de Gram?
7. Teniendo en cuenta la clasificación bacteriana por la tinción de gram
(Gram positivos y Gram negativos) ¿Cuál grupo tiene mayor importancia
desde el punto de vista clínico veterinario?
8. Que medios selectivos y/o diferenciales se usan para el crecimiento y
aislamiento de bacterias Gram positivas y Gram negativas?.
9. Desde el punto de vista terapéutico ¿Qué importancia tiene clasificar un
aislamiento como gram positivo ó gram negativo?
10. Si usted se encuentra con un problema de diarrea en terneros,
lechones ó aves y al hacer el aislamiento de la bacteria sospechosa del
proceso infeccioso, se encuentra con que es una bacteria Gram positiva
¿Tendría mejor pronóstico?. Justifique su respuesta.
11. Usted encontrará varias placas; obsérvelas al microscopio, descríbalas
y diga qué importancia tienen estas estructuras/microorganismos en la
práctica veterinaria.
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