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UPR - Aguadilla Biol. 3019 – Biología del Desarrollo JA Cardé, PhD Ejercicio 2 – Repaso del Desarrollo en Anfibios - Xenopus Introducción: Ranas ( Xenopus leavis, Rana pippiens) y otros anfibios como las salamandras (Ambystoma mexicanus) han servido, por mucho tiempo como sistema modelo para estudiar embriología ya que sus huevos son fáciles de recoger y observar durante el desarrollo. Desafortunadamente su genética es prácticamente inexistente, ya que son difíciles de mantener en cautiverio. En este modulo estaremos repasando de forma resumida lo que se sabe sobre su desarrollo embrionario. Embriología descriptiva Huevo: El huevo de anfibios es por lo general moderadamente vitelogénico. Su citoplasma se distribuye de forma polarizada en dos áreas o polos. El polo animal es el superior y el de mayor contenido citoplasmático y contiene gránulos de pigmento localizados en la corteza, justo debajo de la membrana citoplasmática . El polo vegetal es el inferior y el mas vitelogénico con una corteza transparente no pigmentada. Es el que alimenta al embrión. Porque estos nombres; animal y vegetal? Fecundación: Es externa. El espermatozoide penetra el huevo por el hemisferio animal. La membrana citoplasmática se despolariza, los gránulos corticales se funden con la membrana liberando enzimas que crearan la envoltura de fecundación, la cual evitará la polispermia. (fecundación por mas de un espermatozoide). La contracción cortical rota la corteza pigmentada del lado animal hacia el punto de entrada del espermatozoide (s.e.p.) y expone citoplasma no pigmentado hacia el otro lado, la creciente gris. Tres funciones importantes: permite que los dos pronúcleos se unan para formar el cigoto; genera movimientos citoplasmáticos lo que permite que porciones citoplasmáticas se reubiquen en nuevos lugares; activación de moléculas necesarias para el comienzo de la segmentación y la gastrulación. Segmentación: Durante este proceso el volumen del segmentación huevo de no este cambia. La huevo es holoblástica: las primeras dos divisiones son longitudinales. La primera división pasa a través del s.e.p. y diseca la creciente gris. La segunda división es ortogonal a la primera, se intersectan en los polos animal y vegetal. La tercera división es ecuatorial. Blastómeros en la Figure 1 Xenopus life cycle 1 parte animal se dividen mas rápidamente (animadamente) que los blastómeros vegetal, que se dividen mas lentos (vegetativamente). Blástula: En esta etapa la bola de células esta hueca, llena de fluido. La mitad animal tiene una capa simple de células que forman un domo sobre la cavidad del blastocele. Esta capa de células es conocida como el gorro animal. Células de esta capa se diferencian en ectodermo. Células del área vegetal formaran el endodermo. Células del margen, entre el gorro animal y las del área vegetal, formarán el mesodermo. (6 hrs) Gástrula: Etapa caracterizada por una invaginación de células, que comienza en el margen vegetal opuesto al s.e.p., zona conocida como el labio dorsal del blastoporo. El blastoporo se agranda en un anillo alrededor del polo vegetal. La invaginación de las células crea una nueva cavidad, el arquenterón, o tracto digestivo primitivo. El techo del arquenterón inicialmente esta formado por células mesodermales del labio dorsal. Como resultado de gastrulación las tres capas germinales Figure 2 - Gastrulation terminan en sus posiciones finales. (10 hrs) Néurula: Esta etapa esta caracterizada por una segunda invaginación de células ectodermales sobre el techo del arquenteron para generar el tubo neural, característica distintiva de vertebrados. El tubo neural que surge del células mesodermales que instruyen a las del ectodermo a que se diferencian eventualmente en el cerebro y cordón espinal (18 hrs) Organogénesis: Una vez el tubo neural esta formado, este y el notocordio instruyen a sus vecinos a diferenciarse en somitas, precursores de lo músculos dorsales, las vertebras y piel. El embrión desarrolla boca y ano y se alarga. Se forman las branquias, y eclosiona. Se forman las yemas precursoras de las extremidades y se desarrollan. (72 hrs) Metamorfosis: El cambio de la larva/renacuajo acuática al adulto que puede vivir en la tierra. Ocurre gracias a la glándula tiroidea del renacuajo. Las aletas desaparecen y las extremidades se desarrollan. El cráneo de cartílago del renacuajo se sustituye por uno óseo. Dientes puntiagudos de la larva Figure 3 - Metamorphosis desaparecen y aparece la mandíbula y boca con la lengua para atrapar moscas. Tracto GI de la larva, que es largo (herbívoros), se reduce adaptándose para 2 dieta carnívoras. Desaparecen la agallas y aparecen los pulmones. Es gatillada por presiones ambientales como otoños, para prepararse para el invierno. (4 semanas) Embriología Experimental Separación de blastómeros: Cada uno de los dos medios blastómeros, cuando son separados uno del otro, pueden formar un renacuajo completo y eventualmente una rana. Sin embargo luego de la segunda división los blastómeros del cuarto no pueden completar hasta renacuajos. Organizador de Spemann y Mangold: en los 1920’s Hans Spemann y Hilde Mangold transplantaron el labio dorsal del blastoporo dentro de otro embrión en etapa de gástrula. El embrión receptor formo dos ejes embrionarios. El labio dorsal transplantado se diferencio en notocordio como lo haría normalmente e indujo al presunto ectodermo ventral a formar un tubo neural. Asi el labio dorsal del blastoporo que forma el notocordio mesodermal, tiene el poder de inducir la diferenciación neural de células ectodermales no comprometidas y subsiguientemente organizar un eje secundario (mas información en http://embryo.asu.edu/pages/spemannmangold-organizer). Transplante de la cresciente gris: Como y cuando la especificación dorsal ocurre? A.S.G. Curtis removio la corteza de la creciente gris de un huevo acabado de fecundar o de embriones de 8 celulas. Los embriones de 8 celulas sobrevivieron y se desarrollaron normalmente. El huevo recién fecundado no llego ni a gástrula. Si la corteza de la creciente gris es implantada en el presunto margen ventral del huevo recién fecundado o del embrión de 8 células, los primeros llegan a gástrula en ambas crecientes grises con dos blastoporos y desarrollan un segundo eje embrionario. Salen gemelos, hallazgo que provoco una estampida de estudios para caracterizar lo que había en la corteza de la creciente gris para identificar los determinantes citoplasmáticos que inducían la formación de un segundo labio dorsal. La etapa de 8 células no llego a gástrula. Rotación y Radiación UV: Irradiar el hemisferio vegetal con luz UV (254 nm) antes de la primera división también previene la gastrulación. La división celular procede al ritmo normal pero no se forma creciente gris. El resultado es un embrión ventralizado sin estructuras dorsales ni anteriores; no hay eje A-P. Interesantemente con solo inclinar el huevo se puede rescatar a los huevos irradiados con UV, y restaurar la gastrulación con el desarrollo normal del embrión. El huevo debe ser inclinado antes de la segunda división. La dirección hacia donde se incline el huevo indica donde se formara el labio dorsal del blastoporo. La inclinación de huevos sin irradiar induce gemelos si esta se realiza luego de fecundados y antes de la segunda división. Cual es la relación entre la luz UV, la inclinación y la creciente gris? Que destruye la luz UV? Como la inclinación rescata los huevos irradiados? Ejercicios: 1. Si se le suministra muestras de agua de charca observar en microscopios para tratar de identificar huevos en distintas etapas del desarrollo. 3 2. Utilizando las laminillas preparadas y los modelos suministradas sobre desarrollo, observarlas e identificar estructuras: blastómeros, polo animal, polo vegetal, creciente gris, labio dorsal del blastoporo, notocordio, tubo neural, blástula, gástrula, néurula. 3. Repasar los procesos del desarrollo de anfibios en los enlaces con videos suministrados en la presentación 4. Resultados: una tabla de tiempo con etapas del desarrollo de anfibio y los aspectos mas notables o distintivos de cada una de ellas. Referencias: Developmental BIology, S. Gilbert 9th Edition, Sinauer Associatess, Cap 1. Experimentos en BIologia del Desarrollo, MH Morales y JR Ortiz, Universidad de Puerto Rico, Rio Piedras Developmental Biology Interactive http://www.devbio.biology.gatech.edu/?page_id=49 General Biotechnology Animations http://www.sumanasinc.com/webcontent/animation.html http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/generalscience.html 4