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Generalidades y fundamento de la Coloración de Gram. Aplicaciones clínicas.
La tinción de Gram se utiliza como un método de despistaje para evaluar la calidad de diferentes
tipos de muestras clínicas, incluyendo muestras respiratorias, orina y muestras no invasivas de heridas.
La base científica de esta tinción consiste en que la presencia de polimorfonucleares se considera
indicativa de la existencia de inflamación o infección, y la de células epiteliales se considera indicativa
de contaminación superficial de la muestra. Esta tinción también se puede utilizar para decidir cuántos
microorganismos se van a valorar en muestras con cultivos polimicrobianos. Además, la observación
de determinados microorganismos puede indicar la realización de procedimientos especiales de trabajo
(inoculación de la muestra en medios especiales, incubar los medios en determinadas condiciones o
prolongar la incubación).
Es de bajo costo y gran utilidad:
1. Orientación diagnóstica rápida
2. Indica características inflamatorias
3. Orienta en infecciones mixtas (anaerobios)
Algunas Aplicaciones Clínicas:
1. Orina:
El examen microscópico con tinción de Gram es el método más simple, más rápido, más barato
y probablemente más fiable para identificar muestras de orina con recuentos bacterianos iguales o
superiores a 105 UFC/ml. Sin embargo, no es posible detectar bacteriurias inferiores por examen
microscópico. Además de su baja sensibilidad, el examen individual de cada muestra por esta técnica
lleva demasiado tiempo y resulta impracticable como método de rutina, aunque debe disponerse de ella
en los casos seleccionados que requieran un examen rápido de orina.
La tinción de Gram también puede ser útil para establecer el tratamiento empírico de sepsis
urinarias de naturaleza polimicrobiana, como las asociadas a una infección nosocomial o en portadores
de sonda urinaria. Así, la visualización de cocos grampositivos obligará a cubrir fundamentalmente
enterococo; por otro lado, si sólo se observan bacilos gramnegativos, el tratamiento antibiótico puede
realizarse con antibióticos con actividad frente a los mismos, cubriendo también Pseudomonas
aeruginosa, tales como aztreonam o ceftazidima y/o amikacina.
2. Esputo:
La aplicación de la tinción de Gram al esputo constituye unos criterios estandarizados de
cribado y permite determinar el grado de contaminación y la calidad de la muestra antes de la
realización del cultivo y establecer, de este modo, unos criterios de rechazo. No obstante, la tinción de
Gram presenta también problemas, por su gran variabilidad en la especificidad, sensibilidad y
reproducibilidad, dependiendo de factores como la muestra y la experiencia del observador.
La evaluación adecuada de la tinción de Gram de la muestra es crítica para asegurar que sólo se
procesan muestras de calidad. Los criterios de aceptabilidad del esputo y de las secreciones traqueales
se basan en la presencia de numerosas células inflamatorias y la ausencia o escasez de células
epiteliales, que se consideran indicadoras de contaminación orofaríngea superficial.
Para la aceptación de la muestra, varios autores han descrito criterios celulares cuantitativos de
cribado que difieren en el número límite de leucocitos y células epiteliales aceptables, pero todos
coinciden en considerar que un número elevado de células epiteliales indica contaminación
orofaríngea. En general, los criterios de Murray y Washington (1975) establecen como esputo de
calidad aceptable para el cultivo la muestra que contiene: > 25 leucocitos/campo de 100X y < 10
células epiteliales escamosas/campo de 100X
En el caso de la presencia concomitante de numerosos leucocitos y células epiteliales
escamosas, Heineman y Radano (1979) establecen como criterio de aceptación el índice de > 10
leucocitos/1 célula epitelial.
Por otra parte, la detección en un esputo, aceptable por los criterios citológicos anteriores, de un
morfotipo bacteriano claramente predominante sobre el resto de la microbiota que habitualmente
contamina estas muestras, permite sugerir, con sensibilidad variable (57% para S. pneumoniae; 82%
para H. influenzae), el agente etiológico de la neumonía y ayuda en la valoración de los
microorganismos crecidos en los cultivos. Así, algunos morfotipos de microorganismos, como
Haemophilus, Bacteroides y los bacilos entéricos pueden ser fácilmente identificados en la tinción de
Gram. Por otra parte, en algunos microorganismos como, S. aureus y M. catarrhalis, se ha establecido
una correlación del 69-93% y del 90%, respectivamente, entre la presencia en gran cantidad (>50
microorganismos/campo de 1.000X) de sus correspondientes morfotipos en la tinción de Gram y la
evidencia clínica de neumonía causada por estos agentes. Igualmente, un aumento significativo de la
microbiota mixta (>50 microorganismos/campo de 1.000X) y la detección de microorganismos
intracelulares grampositivos y gramnegativos, es claramente sugerente (valor predictivo del 79%) de
neumonía por aspiración.
Los laboratorios que reciben esputos y secreciones traqueales para tinción y cultivo, deben
seguir las siguientes recomendaciones:
-Examinar con bajo aumento (100X) de 20 a 40 campos de la extensión del esputo o secreción
endotraqueal teñidos con tinción de Gram. Realizar una media del número de células en los campos
representativos que contengan células. Se aceptarán para cultivo:
- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y < 10 células epiteliales escamosas/campo de
100X.
- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y >10 células epiteliales/campo de 100X, cuando el
cociente leucocito/célula epitelial sea >10 y exista un predominio franco (3 ó 4 +) de un único
morfotipo bacteriano.
Cuando en una muestra con numerosos leucocitos (4+) y detritos celulares no se observan
microorganismos, puede ser útil inundar la extensión con naranja de acridina y observarla con
microscopio de fluorescencia para confirmar la ausencia de microorganismos en los detritos.
Pseudomonas y Haemophilus pueden no observarse en estas tinciones por la dificultad de
diferenciación entre los detritos celulares. Legionella se puede observar con la tinción de naranja de
acridina, aunque en esta infección hay a menudo ausencia de leucocitos en el esputo.
Se rechazarán e informarán como "muestra inaceptable" o "no compatible con procesos infecciosos
bacterianos", según corresponda, las siguientes muestras:
- Esputos con >10 células epiteliales/ campo de 100X.
- Aspirados traqueales de adultos con >10 células epiteliales/campo de 100X, o los aspirados en los que
no se observan microorganismos.
- Aspirados traqueales de pacientes pediátricos en los que no se observen microorganismos,
independientemente del número de células epiteliales.
No se rechazarán los esputos y aspirados endotraqueales con petición de cultivo para Legionella,
Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus, ni las muestras de pacientes con fibrosis quística o
neutropenia aunque no cumplan los criterios citológicos de calidad.
3. Líquidos Estériles
La observación de cualquier morfología bacteriana, aunque sea única es indicativa de infección.
Por ejemplo, la tinción de Gram del líquido cefalorraquídeo permite identificación del agente etiológico
en aproximadamente 60 a 90% de los casos de meningitis bacteriana, en el caso de meningococo
evidencia reacción leucocitaria y diplococos Gram negativos intra o extracelulares.
4. Gonorrea en el hombre.
La observación de diplococos Gram negativos intracelulares a partir de una secreción uretral
purulenta es indicativo de gonorrea.
5. Infecciones por Anaerobios
La tinción de Gram es de una gran utilidad en el diagnóstico microbiológico presuntivo de
infecciones producidas por anaerobios, ya que proporciona información acerca de los tipos de bacterias
existentes, cantidad relativa de las mismas, presencia de leucocitos, etc. Por otra parte, es un elemento
importante para el control de calidad del laboratorio. Si no se consigue aislar todos los morfotipos
observados, puede ser debido, probablemente, a algún fallo en los distintos pasos del diagnóstico de los
anaerobios (recolección de la muestra, transporte o procesamiento), o bien se trata, aunque es menos
común, de una inhibición del microorganismo por un antibiótico residual. Además, la presencia de
tipos morfológicos múltiples en la tinción de Gram sugiere específicamente el diagnóstico de
infecciones por anaerobios, puesto que la mayoría de las infecciones en las que están implicados son
polimicrobianas
Coloración de Gram: teoría y fundamento
En 1884, el físico danés Hans Christian Gram desarrolló una tincÍón compuesta, que es
probablemente la más importante que se usa en bacteriología. Sobre la base de esta coloración, las
bacterias se pueden clasificar en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas.
Durante este procedimiento, una vez fijada la muestra al portaobjeto, se añade una solución de
violeta de genciana o cristal violeta (colorante primario) que penetra todas las bacterias de la
preparación. Luego se agrega solución de lugol (mordiente), el yodo entra en la célula y forma un
complejo insoluble con la violeta de genciana, posteriormente se procede a la decoloración con una
mezcla de alcohol-acetona; las bacterias cuya pared celular es más densa, constituidas principalmente
por peptidoglicano (Grampositivas), se deshidratan y cierran los poros de la pared impidiendo la salida
del complejo violeta de genciana-yodo, por lo tanto estas bacterias permanecen de color púrpura;
mientras que las bacterias gramnegativas, debido a su alto contenido de lípidos, al decolorar estos
lípidos se deshidratan o desnaturalizan y desaparecen del espacio que los contiene, quedando poros en
la pared donde antes estuvieron los lípidos. Esto permite la salida del complejo violeta de gencianayodo en las bacterias gramnegativas, pero no en las grampositivas y al adicionar el colorante de
contraste (safranina), las primeras toman dicho colorante por lo que se observan de color rosado. En la
tabla 1 se resume el aspecto de ambos tipos de células después de cada paso del procedimiento de
tinción de Gram.
Tabla 1. Aspecto de las bacterias durante los diferentes pasos de la coloración de Gram
Después del colorante o
reactivo
Grampositivas
Gramnegativas
Cristal violeta
Púrpura
Púrpura
Lugol
Púrpura
Púrpura
Alcohol acetona
Púrpura
Incolora
Safranina
Púrpura
Rosada
Técnica de coloración de Gram
Luego de extender la muestra sobre la lámina de vidrio portaobjeto, la cual previamente
debe estar limpia y seca, se procede de la siguiente manera:
1. Fijar el extendido por calor pasando el portaobjeto a través de la llama del mechero
con un movimiento rápido (3 veces).
2. Aplicar el colorante violeta de genciana por un minuto.
3. Lavar con agua corriente.
4. Aplicar el lugol por un minuto.
5. Lavar con agua corriente.
6. Aplicar el alcohol-acetona durante 10 segundos.
7. Lavar con agua corriente.
8. Aplicar la safranina por 30 segundos.
9. Lavar con agua, secar al aire y observar en el microscopio.