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Anticuerpos
Los anticuerpos son moléculas de peso molecular
aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las
inmunoglobulinas (Ig). Son moléculas capaces de
reconocer otras moléculas, los antígenos. La
capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en
las secuencias variables de sus cadenas proteicas,
generadas por recombinación de una serie de 'gene
cassettes" en el proceso de producción de los linfocitos
B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de
estas secuencias puede producir más de un billón de
secuencias diferentes. Esta información es almacenada
en el 'pool' de linfocitos B presentes en nuestro tejido
linfático.
La estructura básica de un anticuerpo se esquematiza en la figura: formado por
dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se
dividen en varias clases que se identifican según el tipo de cadena pesada en:
IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
La acción de enzimas proteolíticas sobre los anticuerpos permite obtener
fragmentos que presentan actividades biológicas diferenciales. Los fragmentos
obtenidos son:

Fc. Corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este
fragmento está constituido por la región constante de la cadena pesada y
es característica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en esta región


donde radican las funciones efectoras de la molécula como son la fijación
del complemento, la interacción con los receptores celulares de monocitos y
macrófagos, la interacción con la proteína A de S. aureus y G de
Streptococcus sp. etc... La región Fc es característica de especie.
F(ab')2. Corresponde al extremo N-terminal de las dos cadenas pesadas y
a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digestión con pepsina. Tiene
reconocimiento divalente del epítope.
F(ab). Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una
cadena ligera, unidas por puentes disulfuro. Se obtiene por digestión con
papaina. Tiene reconocimiento monovalente del epítope.
De las distintas clases de inmunoglobulinas las que se encuentran
predominantemente en el suero de animales inmunizados son las IgM y las IgG.
Las IgM se sintetizan durante la respuesta primaria y se asocian en una estructura
pentamérica. Su capacidad de reconocimiento de epítopes es por ello de 10. Las
IgG se sintetizan tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en
esta última donde se consiguen los mayores niveles de producción. Su acción
bivalente les permite interactuar con más de una molécula de antígeno.
Antígenos, Antigenicidad e inmunogenicidad.
Virtualmente toda molécula ajena a un determinado organismo se comporta frente
a éste como un antígeno, Se pueden diferenciar dos características primordiales
en un antígeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una
molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la
antigenicidad o particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por
un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en
un determinado antígeno. Moléculas de pequeño tamaño (haptenos o péptidos)
son poco inmunogénicas y por ello se asocian a proteínas transportadoras de alto
peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada.
Macromoléculas ubícuas (albúminas, citocromos, etc...) o de especies
filogenéticamente relacionadas, son poco inmunogénicas. En estos casos, para
obtener una respuesta adecuada es aconsejable utilizar como animal huésped una
especie filogenéticamente alejada a la del antígeno a inocular.
Habitualmente se emplean como antígenos puros o previamente enriquecidos
mediante técnicas de concentración o de separación electroforética. Uno de los
criterios de mayor importancia en la obtención de un suero monoespecífico es la
inmunización con antígenos puros.
A la región del antígeno reconocida por un anticuerpo se le denomina epítope o
determinante antigénico. Un antígeno puede presentar un número variable de
epítopes de estructura única o repetitiva. La complejidad estructural de las
proteínas favorece que éstas presenten por lo general un número elevado de
epítopes distintos, mientras que los ácidos nucleicos y los polisacáridos, dada su
repetitividad estructural, poseen un número escaso de epítopes diferentes.
Inmunización y preparación del antígeno
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno en
condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompañantes, y número de
veces, que sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En
general se divide en dos fases: inmunización primaria, en la cual se administra una
determinada cantidad de antígeno en presencia de adyuvante, e inmunización de
recuerdo ('booster'), en la que el antígeno es administrado en forma soluble o bien
con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración
variable.
Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta
inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig específicas
del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los
limfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Como hemos visto un
antígeno puede presentar diferentes epítopes, y cada uno de ellos ser reconocido
por un clon de linfocitos B que producirá moléculas Ig con una secuencia
característica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un
número desconocido, posiblemente elevado, de diferentes moléculas de Ig
específicas en mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero
producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello
se ha denominado policlonal.
Interacción primaria antígeno-anticuerpo.
Afinidad y avidez
La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles,
como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones
electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una
interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratope) y el lugar de
unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a
una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que
epítope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener
una energía de unión suficiente como para resistir la disrupción termodinámica. La
suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del
anticuerpo.
Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con el antígeno.
Las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo
de 2 brazos de unión con el antígeno. En el caso de que este último también sea
multivalente, presentará un mínimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo
correspondiente. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite
introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.
Especificidad y reacción cruzada
La complementariedad existente entre epítope y paratope condiciona la relación
específica entre antígeno y anticuerpo. Dicha complementariedad afecta tanto a
una relación espacial entre los grupos químicos reaccionantes, a la relación
complementaria de cargas netas como a la relación estérica entre las estructuras
reaccionantes.
En general los anticuerpos son altamente específicos, siendo capaces de discernir
entre pequeñas variaciones del antígeno, tanto a nivel de estructura primaria como
de conformación estérica o configuración óptica del mismo.
Interacción secundaria antígeno-anticuerpo.
En la interacción in vitro de un antígeno con su correspondiente anticuerpo se
distinguen dos etapas, la reacción primaria no visualizable y la reacción
secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un
fenómeno visible como la aglutinación, la precipitación, etc.
Los complejos iniciales que se forman rápidamente, sobre los que dentro de
ciertos limites las variaciones de temperatura y concentración salina tienen poca
influencia, se agregan luego para dar diferentes fenómenos visibles cuyas
características dependen en gran parte del estado físico del antígeno. Esta etapa
se acelera con la temperatura, la agitación y es electrolitodependiente.
Es importante separar las etapas de la reacción antígeno-anticuerpo. Puede
ocurrir que se demuestre la presencia de anticuerpo por interacción primaria, pero
que este no sea detectable por interacción secundaria o terciaria. Esto puede ser
consecuencia de variaciones cuantitativas, ya que para conseguir fenómenos
visibles son indispensables determinadas concentraciones de anticuerpo, y
cualitativas inherentes a las propiedades de la clase de inmunoglobulina
comprometida en la respuesta inmune, así como de las características del ligando.
Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interacción
primaria, ello no significa que siempre deban ocurrir reacciones secundarias o
terciarias.
Precipitación
Cuando una anticuerpo, excepción hecha de los bloqueantes y no precipitantes,
es puesto en contacto con una solución de macromoléculas que lo origino, se
forman complejos Ac/Ag que se insolubilizan luego en su mayor parte dando una
reacción de precipitación, que puede ser total o zonal.
Es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos y no una característica
particular de un determinado tipo al que originalmente se lo llamo anticuerpo
precipitante.
Precipitación en medios líquidos
Esta reacción se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla
rápidamente y es influida muy poco por la temperatura y los electrolitos, se forman
los complejos Ac/Ag primarios. A medida que el tiempo transcurre, esos complejos
iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaños, las que finalmente
precipitan. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solución.
La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo además
electrolitodependiente.
Es mucho más lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que
se complete.
La formación de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los
anticuerpos y la multivalencia de los antígenos. Con haptenos monovalentes o
antígenos que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la
precipitación no se produce.
Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su
mayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos
casos, especialmente cuando están dirigidos contra macromoléculas en solución,
reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados.
La formación de estos diferentes complejos ha sido explicada mediante la llamada
teoría del enrejado, que considera que la composición del precipitado formado es
una consecuencia del modo en que anticuerpo y antigeno se han unido. Dada la
bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antigeno, las posibilidades de
combinación varían según que en la mezcla exista exceso de antigeno, exceso de
anticuerpos o equivalencia de ambos.
En la zona de exceso de antigeno, los complejos son solubles.
Si bien la precipitación en medios líquidos es muy útil para la identificación de
antígenos y anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo
relativo a la formación de los precipitados, la misma puede usarse con fines
cuantitativos y constituye un buen método para la medida de la concentración de
los anticuerpos presentes en un suero. Puede usarse también para medir niveles
de antígeno.
Precipitación en medios gelificados
Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles; dicha difusión
esta limitada por la concentración del gel. Empleando soportes adecuados, en
especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible
hacer migrar antígenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen.
Pueden utilizarse también geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida y aun
tiras de acetato de celulosa gelatinizado.
Los precipitados que se originan se visualizan como nítidas bandas de
precipitación, que permanecerán estables mientras un mayor aflujo de moléculas
de los reactivos no provoquen su redisolución.
Se han descripto numerosas técnicas cualitativas y cuantitativas basadas en este
principio, entre las que pueden citarse la difusión simple monodimensional,
difusión doble monodimensional, difusión doble bidimensional, difusión radial, etc..
Difusión simple monodimensional
Se coloca en un tubo de ensayo pequeño agar fundido, solución al 1% en cloruro
de sodio 0,15 M, mezclado con un volumen igual del antisuero para analizar.
Producida la solidificación, se añade la solución de antigeno. Por difusión a través
del gel el antigeno va penetrando, creando un gradiente de concentración. En la
interfase gel-liquido no se forman precipitados, dada la alta concentración
antigénica, y aparecen con la forma de bandas cuando la concentración del
antigeno que ha difundido es la optima.
Si en el suero había mas de un anticuerpo y en la solución añadida mas de un
antigeno que se correspondan, se formara tantas bandas de precipitación como
sistemas hayan interaccionado.
Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta que dichas separaciones dependen
de las velocidades de difusión de las diferentes moléculas antigénicas, solo será
cierto si aquellas son distintas. El numero de bandas de precipitación nos indica la
cantidad mínima de sistemas reaccionantes presentes. Esto también es relativo,
ya que es indispensable que los reactivos no estén en concentraciones inferiores a
las necesarias para que la reacción ocurra.
Difusión doble monodimensional
En este caso la reacción se efectúa colocando en la parte inferior del tubo un
volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con partes iguales del antisuero.
Producida la gelificación, se agrega agar al 0,5 % en solución salina, en un
volumen igual a la mitad del anterior. Después de la solidificación se cubre todo
con un volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con igual volumen de la
solución antigénica.
Antígenos y anticuerpos migrarán hacia la zona media e interaccionarán
desencadenándose la precipitación cuando las concentraciones sean las óptimas.
Estando la difusión en relación directa con la concentración de la sustancia que
difunde, la banda de precipitación estará más próxima a la zona del antígeno
cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrirá lo inverso en caso contrario.
Este es un buen método cualitativo que permite demostrar varios sistemas
reactivos simultáneos, cosa que no ocurre en la precipitación en medios líquidos.
Pueden detectarse hasta 10 µg/ml de anticuerpo.
Difusión doble bidimensional
Un interesante método de doble difusión en placas fue descripto por Oüchterlony.
Consiste en enfrentar en pequeñas perforaciones efectuadas en el agar, y a
distancias convenientes, las soluciones de antígeno y de anticuerpo. Al difundir
ambos y ponerse en contacto, producirán una banda de precipitación cuando
estén en la relación óptima.
Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos
moleculares de los antígenos y anticuerpos reaccionantes. Trabajando con
concentraciones óptimas de Ag y de Ac, si la banda de pecipitación formada es
recta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy próximos. Si la banda
es cóncava con especto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular
de éste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en que la banda
presente convexidad.
Todo esto es una consecuencia de las leyes generales de la difusión, que
establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa
con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. Mediante esta
metodología, es posible identificar varios sistemas reaccionantes
simultáneamente, pues cada uno de ellos dará una banda de precipitación
específica y, además, investigar reacciones cruzadas, pues en estos casos habrá
fusión de bandas. Originariamente Oüchterlony describió, de acuerdo a este
hecho, tres tipos de reacciones. Fueron denominadas como reacciones de
identidad, no identidad e identidad parcial.
En el primer caso, los dos sistemas reactivos se funden en una única banda de
precipitación. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada
uno reacciona independientemente originando bandas de precipitación que se
cruzan. Cuando uno de los antígenos analizados tiene algún componente capaz
de dar una reacción cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad
parcial), las bandas de precipitación de ambos sistemas se unen y funden
parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón en la
correspondiente al antígeno que se empleó para la obtención del antisuero. Esto
indica que en este antígeno hay componentes antigénicos no compartidos con el
restante.
Difusión radial (Técnica de Mancini)
Cuando un antígeno es colocado en un orificio circular practicado en una placa de
agar, al cual se adicionó anticuerpo monoespecífico, difunde en forma radial y, de
acuerdo con los principios básicos de la difusión, el diámetro del halo de
precipitación está en relación directa con su concentración. Si a esta operación se
la efectúa colocando en varios orificios de la placa cantidades variables conocidas
del antígeno específico para el antisuero mezclado con el agar y se lo deja a
temperatura ambiente hasta que el halo de precipitación no se modifique, con los
resultados obtenidos se puede confeccionar una curva relacionando el diámetro
de los halos de precipitación con las correspondientes concentraciones
antigénicas. Esta curva permite calcular la concentración de ese mismo antígeno
en cualquier muestra desconocida.
La difusión radial se utiliza en la cuantificación de proteínas que se encuentran
presentes en mezclas complejas como lo son los componentes del suero humano.
Es indispensable disponer para ello de antisueros monoespecíficos destinados a
los antígenos que se quieren valorar.
Bibliografía
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/anticuerpos.htm#arriba
Inmunología e Inmunoquímica. Margni, R. A., 5° edición Editorial Médica
Panamericana 1996.