Download Inmunoquímica-Aplicaciones- Prof y Lic CsBiol-Lic Biotec

Lic. Cs. BIOLÓGICAS
Prof. en BIOLOGÍA
Lic. BIOTECNOLOGÍA
QUÍMICA BIOLÓGICA
2016
LIC. Y PROF. CS BIOL – LIC. BIOTECNOLOGÍA
Bolilla 11 - Inmunoquímica -
QCA. BIOLÓGICA
Aplicaciones
PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN
•
Inmunoquímica. El Sistema Inmunitario. Inmunidad Humoral:
cinética de la respuesta inmune, estructura de las inmunoglobulinas,
isotipos de las cadenas pesadas, inmunoglobulinas de membrana,
naturaleza del antígeno (Ag). Haptenos. Anticuerpos monoclonales y
policlonales. Reacción Ag-Ac. Afinidad de los anticuerpos.
Termodinámica de la afinidad. Cinética de la reacción Ag-Ac. Afinidad y
avidez: determinación. Especificidad del anticuerpo. Significado
biológico de los anticuerpos de alta y baja afinidad. Técnicas
inmunoquímicas.
Técnicas
de
enzimo-inmunoensayo.
Inmunoprecipitación
e
Immunoblotting.
Técnicas
de
inmunofluorescencia. Aplicaciones. Producción de anticuerpos.
Producción y Especificidad de antivenenos. Reconocimiento del
veneno de animales ponzoñosos. Neutralización de la actividad
letal del veneno, mezcla antisuero. Detección de pesticidas por
técnicas inmunoquímicas. Otras.
TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS
¿Qué son?
Aplicaciones analíticas de la reacción Ag-Ac
Reacciones Inmunológicas
Aplicaciones
Métodos analíticos biológicos
Herramientas para el análisis de sustancias
de interés en Biología Animal y Vegetal difíciles de medir
Propiedades aplicadas
Especificidad de la unión
Antígeno-Anticuerpo
(Ag-Ac)
Un Ac se une a un Ag determinado
Cuantificación del
Ag conociendo
la cantidad de Ac
(o viceversa)
Capacidad de
visualización
de la unión Ag-Ac
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
en animales de experimentación
Muchos Anticuerpos usados en Técnicas Inmoquímicas
son producidos por inmunización repetida de un animal
por ejemplo: conejo, cabra, oveja, gallina, ratón, cobayo;
El método usual para producir ANTICUERPOS POLICLONALES
experimentalmente consiste en:
 La inoculación de animales de experimentación con preparaciones del
Antígeno (inmunógeno) purificado total o parcialmente
 La administración de un inmunógeno in vivo estimula diferentes
células del sistema inmune, dando origen a una población mixta de
anticuerpos derivados de un número variado de clones de linfocitos B
(policlonal)
 El suero de un animal inmunizado contiene estos anticuerpos y es
referido como ANTISUERO POLICLONAL
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
en animales de experimentación
En general, al preparar un protocolo de inmunización
experimental se debe considerar un conjunto de
factores que afectan el tipo y la magnitud de la
respuesta humoral del animal inmunizado
Estos factores son los siguientes:

especie del animal utilizado

constitución genética del animal

dosis del inmunógeno

ruta de administración del inmunógeno

número de inmunizaciones (refuerzos)

calidad, cantidad y pureza del inmunógeno
En el laboratorio se inmuniza frecuentemente : conejos
son fáciles de mantener
responden bien frente a un amplio rango de antígenos
es posible obtener hasta 25 ml de suero de cada desangrado
sin efectos dañinos para el animal
ANTISUERO POLICLONAL
•específicos contra un único
epítope
•derivados de la activación y
proliferación de un solo clon de
linfocitos B
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Visualización de la unión Ag-Ac
Principales métodos analíticos basados en la unión Ag-Ac
TRAZADOR
Complejo Ag-Ac
Aglutinado
TÉCNICA
INMUNOPRECIPITACIÓN
(Inmunoelectroforesis,
Técnica de Ouchterlony, etc.)
INMUNOAGLUTINACIÓN
(Hemoaglutinación, partículas
de látex, etc.)
Fluorocromo
INMUNOFLUORIMETRÍA
(Directa, Indirecta, Citometría
de Flujo)
Radioisótopos
RADIOINMUNOENSAYOS
(RIA)
Enzimas
ENZIMO-INMUNOENSAYO
(ELISA)
TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS
Las principales técnicas aplicadas
1- TÉCNICAS DE INMUNOPRECIPITACIÓN
1.a)- Reacción de precipitación clásica
Cuando se agrega un Ag en solución a un Antisuero se forma
un precipitado del complejo Ag-Ac
El complejo Ag-Ac originan estructuras enrejadas tridimensionales
Estas estructuras se contactan preferentemente por interacción de
los fragmentos Fc-Fc de los Ac
El Ag y el Ac deben estar en solución
Se emplea como ensayo cualitativo o semicuantitativo
para medir la cantidad de Ac
El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación
cuando la proporción de Ag y Ac de la mezcla es equivalente
-Cantidades crecientes de Ag se agregan a una concentración constante de Antisuero (Ac)
1.b)- Difusión radial doble – Técnica de Ouchterlony
Inmunoprecipitación en medio sólido (agar):
Línea de precipitación
(zona de equivalencia)
Suero (Ac) = muestra a investigar
2- TÉCNICAS DE INMUNOAGLUTINACIÓN
Cuando el Ag forma parte o se ha unido a la superficie de
glóbulos rojos
plaquetas
leucocitos
partículas de látex
El complejo Ag-Ac se hace visible por la aglutinación
que producen los Ac al reconocer los Ag en las superficies
de células o partículas de gran tamaño
Se utilizan para identificar bacterias, tipificar glóbulos rojos
2.a)- Aglutinación de partículas recubiertas por Ag
Ej:
Anticuerpo
Antígeno de superficie
Partícula de látex
Ej: látex-IgG
detecta factores reumatoideos
2.b)- Hemoaglutinación - Directa
Ej: Determinación del grupo sanguíneo y factor Rh
Detecta la presencia de Ag en la superficie de los glóbulos rojos
Produce aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad
del Ac (antisuero) añadido
Aglutinación
Ac anti A, B ó AB
3- TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA (IF)
 Utiliza fluorocromos o moléculas colorantes fluorescentes
 Cada fluorocromo absorbe luz en una longitud de onda de alta energía
(long. onda corta) y la convierte en luz de menor energía (long. de
onda más larga)
 Un fluorocromo tiene un espectro de excitación y otro de emisión
característicos
 La molécula que fluoresce se puede fijar en el Ac
preparado contra la proteína de interés
 La fluorescencia es detectada usando luz UV
en un microscopio de fluorescencia
 La IF se utiliza en detección de Ac contra Ag de
Células y tejidos
Ej. de Fluorocromos:
Fluoresceína, Rodamina, Texas Red
3.a)- Inmunofluorescencia Directa
Usa un Ac marcado con el fluorocromo: Ac Primario (Ac 1°)
El Ac marcado se une al Ag de membrana y se observa su
fluorescencia al microscopio de luz UV
Permite la detección del Ag de interés en un solo paso
Limitación: hay que producir un Ac-marcado con fluorocromo para
cada Ac necesario
3.b)- Inmunofluorescencia Indirecta
Usa un Ac primario sin marcar que reacciona con el Ag de interés
Luego, un Ac secundario (Ac 2°) marcado se une al Ac1° y puede ser
detectado por fluorescencia
IF Directa
IF Indirecta
3.c)- Citometría de Flujo
Las células en suspensión circulan como gotas microscópicas
Las células pasan por un campo atravesado por un rayo laser
El laser produce dispersión de la luz y activación de la fluorescencia
Las células son separadas al ser cargadas eléctricamente, y por
placas deflectoras
 El flurocromo se excita
 Permite conocer el % células reconocido por el Ac monoclonal usado
 Permite el estudio de poblaciones de células vivas
(ej: sangre periférica) marcadas con un fluorocromo




Ejemplo: Análisis de una muestra de agua
marina conteniendo fitoplancton
fotosintético por medio de CITOMETRÍA
DE FLUJO mostrando tres poblaciones
diferentes
(Prochlorococcus, Synechococcus,
ypicoeucariotas)
3.c)- Citometría de Flujo
Reoresentación de un citómetro de flujo y
Separación celular
4- TÉCNICAS DE RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)
Técnica que nace en los años 60-70 – Utiliza Radioisótopos (Iodo125,
Iodo132) – Esta es su principal desventaja.
Es muy sensible, mide pequeñas cantidades de sangre.
Cualquier sustancia del organismo puede ser considerada un antígeno.
Los anticuerpos sirven para medir la cantidad de hormonas que hay en
el organismo.
Se aplica para medir:
Hormonas peptídicas: T3, T4, TSH, GH. Casi todas las hormonas
hipofisarias.
Hormonas no peptídicas: Estrógenos, testosterona...Hormonas
sexuales.
Sustancias no hormonales que pueden considerarse como antígenos:
Marcadores tumorales, medicamentos.
Esquema del principio general
de RIA para medir Hormonas
5- TÉCNICAS DE ENZIMOINMUNOANÁLISIS
(ELISA: Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay, ensayo de enzima ligada)
El complejo Ag-Ac se hace visible por el uso de una Enzima
que reacciona con su Sustrato en una reacción colorimétrica
La Enzima se puede unir al Ag o al Ac y este se encuentra inmovilizado
en la superficie de una fase sólida (pocillo de una placa de microtitulación)
El complejo Ag-Ac formado en la fase sólida debe separarse (lavados) de los
reactivos libres que están en solución y en exceso
Esa separación debe realizarse antes de medir la señal colorimétrica
5.a)- ELISA No Competitivo
(“sandwich”)
Fig. A)- Usa 2 tipos de Ac, cada uno reconoce un Ag
•Un Ac está inmovilizado en la fase sólida
•El otro Ac está conjugado con una Enzima
•El analito queda atrapado entre los 2 Ac
•La cantidad de analito de interés es directamente
proporcional a la Enzima medida
•5.a)- ELISA Competitivo
Figs. B, C y D) El analito (Ag ó Ac) compite con el
Ag ó Ac respectivamente marcado con la Enzima
Técnica de la enzima Peroxidasa de rábano aplicada a tejidos
Sustrato : H2O2
Enzima : Peroxidasa
5.a)- ELISA Competitivo
EJEMPLO
Técnicas Inmunoquímicas para análisis de
Residuos de Pesticidas
Objetivo: Detección y cuantificación de residuos de PESTICIDAS
(Insecticidas, Herbicidas, Fungicidas) en muestras biológicas (alimentos),
y en el ambiente (agua, suelos)
Obstáculo:
PESTICIDAS
Moléculas pequeñas de bajo peso molecular
No son inmunogénicas = HAPTENOS
Sólo provocan respuesta inmune si se acoplan a una macromolécula
(Proteínas: ovoalbúmina, albúmina sérica bovina, fibrinógeno)
No presentan grupos funcionales que posibiliten la conjugación con la proteína
Se le incorporan grupos funcionales: -NH2, -COOH, -OH, -SH
Esto se conoce como sintetizar el Hapteno
(mimético del pesticida en estudio)
Repasemos…
( Albúmina de suero bovino)
•5.a)- ELISA Competitivo
EJEMPLO
•Técnicas Inmunoquímicas para análisis de
Residuos de Pesticidas
Pesticida = Hapteno
Etapas para el análisis de un Pesticida
I)-Conocer el diseño del Hapteno (molécula de bajo PM, no inmunogénica)
II)-Síntesis del Hapteno
III)-Conjugación de una proteína (complejo inmunogénico)
IV)-Inmunización adecuada del huésped (conejo)
V)-Análisis de los Ac en el suero sanguíneo, a lo largo del tiempo (Ag-Ac)
•5.a)- ELISA Competitivo
EJEMPLO
•Técnicas inmunoquímicas para análisis de
Residuos de Pesticidas
Ventajas
Rápido
Sensible
Se realiza in situ
Muchas muestras diarias
•5.a)- ELISA Competitivo
EJEMPLO
•Técnicas inmunoquímicas para análisis de
Residuos de Pesticidas
Equipos de Inmunoensayos comerciales (kits de análisis)
La mayoría aplican la técnica ELISA Competitivo
Proteína = Ag
Ligando = Ac
6- TÉCNICAS DE
INMUNOANÁLISIS
CROMATOGRAFÍA
DE AFINIDAD
Separación de Proteínas
en una columna
cargada de polímero
El polímero contiene el
Ac específico contra
la proteína de interés
Las proteínas no deseadas
se lavan
La proteína de interés
se libera de la columna
con exceso de Ac en solución
Método: Western Blotting = Inmunoblotting
(Towbin et al. 1979)
Se basa en la unión específica de Ac a Proteínas (Ag) inmovilizadas sobre una
membrana
Permite detectar el Ac unido y con eso la Proteína, con uno de numerosos
métodos de detección
Permite identificar la proteína de interés dentro de una mezcla y conocer datos
cualitativos y semicuantitativos sobre la misma
“Blotting” significa “transferencia” de macromoléculas biológicas de un gel a una
membrana
Etapas:
1- Separación de las macromoléculas (proteínas) mediante Electroforesis en gel, según su PM
2- Transferencia (blotting) de las macromoléculas a una membrana de nitrocelulosa
3- Bloqueo de la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie
de los Ac que se usarán para detectar la proteína de interés
4- Unión a la proteína transferida de un Ac específico marcado con una Enzima (Reacción Ag-Ac)
5- Detección con un Sustrato apropiado para esa Enzima formando un Producto detectable: precipitado
cromogénico o fluorogénico, sustrato quimioluminiscente que al reaccionar con la Enzima da un
Producto luminoso
6- Detección del producto final luminoso mediante una película fotográfica o una cámara (revelado).
7- Cuantificación de la señal - La intensidad de la señal, cualquiera sea el S utilizado, es directamente
proporcional a la cantidad de Ag en la superficie de la membrana
Western Blotting-Etapa 1- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Objetivo: separación de proteínas de una mezcla
Western Blotting-Etapa 1
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Separación de la mezcla de Proteínas
Western Blotting-Etapa 1
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Separación de la mezcla de Proteínas
-Etapa 2
- Transferencia (blotting) de las macromoléculas a una
membrana de nitrocelulosa
Western Blotting-Etapa 2
-Transferencia (blotting) de las macromoléculas
a una membrana de nitrocelulosa
Western Blotting-Etapas 2-3-4-5-6
Aplicación del WESTERN BLOT –Venenos de alacrán
Obtención de anticuerpos anti-venenos
VENENOS DE SERPIENTES DE ARGENTINA
!!MUCHAS GRACIAS POR ESTAR
EN QUIMICA BIOLOGICA!!
2016