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EFECTO DE LA MELATONINA Y ANÁLOGO, SOBRE LAS PROPIEDADES
ELECTROFISIOLÓGICAS EN REBANADAS DE HIPOCAMPO DE RATA.
Xóchitl .P. Vega-Acevedo, Jenny Reyes-Flores, Alfonso S. Lira-Rocha y Elia B.
Naranjo-Rodríguez
Departamento de Farmacia. Facultad de Química. UNAM. . Ciudad Universitaria,
México, D. 04510. [email protected]
RESUMEN
La melatonina (MEL), es una hormona secretada por la glándula pineal (GP), durante el ciclo
luz-oscuridad, produce diferentes efectos pero el mecanismo por el cual los produce, es desconocido. Para
conocerlo, se realiza un estudio sobre las propiedades electrofisiológicas en rebanadas de cerebro de rata,
en la región hipocampal CA1 la cual es importante en el aprendizaje y memoria, en el caso de la memoria
el principal mediador de estos procesos es el neurotransmisor glutamato que participa en la plasticidad
cerebral y esta relacionada con diversos trastornos clínicos. Se utilizan, ratas hembra o macho Wistar
(40g). Las rebanadas de los cerebros se colocan en un sistema convencional “In vitro”; los datos se
capturan en una PC, y se analizan con una t de Student.
INTRODUCCIÓN
La melatonina (MEL) fue originalmente descubierta como una molécula que se encontraba en
los melanocitos de ranas y pescados. Posteriormente se encontró que estaba presente en todos los
vertebrados, bacterias, protozoarios, plantas, hongos e invertebrados.(6)
La MEL es la hormona primaria de la glándula pineal (GP) secretada rítmicamente, la cual actúa
como un cronobiótico ya que está involucrada en la regulación del ciclo circadiano y en ocasiones en los
ritmos de las estaciones (7). La MEL es una indolamina (N-Acetil-1-5-metoxitriptamina) que se obtiene a
partir del aminoácido triptófano, convertido enzimáticamente a serotonina, La síntesis es principalmente
nocturna y es controlada por la exposición a los ciclos de luz y oscuridad, independientemente del sueño
Los niveles séricos de melatonina son bajos durante el día con picos altos de 2-4 am de la noche (3). Así la
síntesis de melatonina es inhibida por la exposición a la luz y su producción es estimulada durante los
períodos de oscuridad debido a las sinapsis neurales conectadas de la glándula pineal al medio ambiente
vía retina.(6).
A demás de la GP, la MEL también, es sintetizada en la retina, médula espinal y tracto
gastrointestinal. El tracto gastrointestinal indica que produce de manera proporcional más MEL que la GP
y su secreción de melatonina disminuye con la edad.(7)
Figura 1.
Fig. 1 Estructura de la MEL. Compuesto metoxiindólico, es la principal hormona producida
por la GP su nombre químico es N-acetil-5-metoxitriptamina.(6)
1
La MEL cuyo nombre IUPAC es N-Acetil-5-metoxitriptamina, (fig 1) posee dos grupos
funcionales que no solo son decisivos para la unión específica con su receptor si no que también,
proporcionan afinidad permitiendo a la molécula entrar a la célula, compartimientos celulares o fluido
corporales.(6)
La MEL modula funciones endocrinológicas y fisiológicas en los invertebrados; además tiene
propiedades antioxidantes (más fuertes que la vitamina E) y oncostáticas. Tres estudios recientes
epidemiológicos muestran que las mujeres que trabajan exclusivamente en la noche por largos períodos
tienen niveles significativos de riesgo de cáncer de seno.(8)
Por otro lado, se sabe que el t1/2 de la MEL en plasma de rata es de 30-40min, con la finalidad de
contar con una molécula que mejore su t1/2. se sintetizaron compuestos análogos a ella, como es el caso
del compuesto M3C.
Figura 2
NHCOCH3
H3CO
N
OCH3
Fig 2. Se muestra el Análogo de la melatonina M3C
Así. durante los últimos años varios modelos moleculares del sitio de unión han sido propuestos.
Todos ellos coinciden en que el enlace de hidrógeno del grupo 5-metoxi de la MEL actúa como grupo
donador, el carbonilo como grupo aceptor y el átomo de nitrógeno del acetamida como grupo donador. La
adición de un grupo voluminoso en la posición 2 ha sido considerado como un sitio farmacofórico
adicional. La síntesis del análogo probado (M3C) se basa en la sustitución del átomo de nitrógeno en el
anillo del indol con los siguientes argumentos. Primero, este átomo esta lejos de la zona de unión ligandoreceptor así la posible interacción estérica con los sustituyentes en este átomo es minimizada. Segundo el
átomo de nitrógeno incrementa la densidad electrónica en la posición 3 del anillo indólico, por la
deslocalización del par de electrones. Por lo tanto modificaciones en esta distribución electrónica pueden
modificar las propiedades electrónicas de la molécula y como consecuencia su actividad biológica. (4)
Todos estos antecedentes nos llevaron a plantear los siguientes objetivos.
OBJETIVOS


Caracterizar el efecto de ATP, MEL y sus análogo M3C en la región hipocampal del cerebro de
rata.
Demostrar la habilidad de la MEL de modular específicas formas de plasticidad en neuronas
piramidales de hipocampo.
METODOLOGÍA
Las rebanadas de hipocampo son de 400 µm y fueron obtenidas a partir de ratas Wistar hembra
o macho (Harlan, México, S. A. De C.V.I) de 21 a 22 días de edad, con un peso promedio de de 402g,
mantenidas en condiciones constantes de temperatura, agua y alimento ad libitum.
Los animales se sacrificaron por decapitación con una guillotina para ratas (World Precision
Instruments, Inc. Sarasota, Fl. USA). Una vez extraído el cerebro se colocó en una caja Petri con Líquido
Cefalorraquídeo Artificial (LCRA) a 4 C estabilizada con una mezcla de O2 y CO2 al 95% y 5%
respectivamente (gas carbógeno). El cerebro se colocó ventralmente hacia arriba, en una caja Petri con
LCRA, cortando la parte anterior del cerebro a la altura del quiasma óptico y por la parte posterior a la
altura del cerebelo. Este bloque, se fijó con una capa delgada de cianoacrilato (QuickTite) a la base de la
cámara del “Vibro Slice” (Vibratome 1000 Plus-Pelco,Ted Pella, Inc. Moutain Lakes Blvd. Redding,
CA) (5). Se obtuvieron ocho rebanadas por cortes coronales por cada cerebro de rata, generalmente las dos
primeras rebanadas del hipocampo se desechaban, para asegurar que la rebanada contenga el hipocampo
anterior con la región CA1. La duración de todo este proceso desde que se sacrificó al animal hasta la
obtención de las rebanadas fue de aproximadamente 5min. Las rebanadas se sumergieron en la solución
de LCRA a temperatura ambiente (22  3ºC) y con burbujeo constante de gas carbógeno (95% de O 2 y
5% de CO2), mientras eran utilizadas para los registros, en esta solución se consideraron 30 min. de
estabilización para la primera rebanada.
2
Posteriormente, se transfirió una rebanada a la cámara de registro y continuamente se perfundío
con una solución de LCRA (36  1 ºC) y oxigenada con gas carbógeno. Para mantener el volumen
constante de la perfusión, la cámara está conectada a una aguja de succión la cual a su vez esta conectada
al vacío. La solución se mantuvo en un frasco Mariotte colocado a 50 cm de la cámara y equilibrada con
gas carbógeno, para mantener el pH = 7.4 y a una temperatura de 36  1ºC, mediante un sistema de
recirculación. La solución que se encontraba en contacto con la rebanada se mantuvo en un rango de
temperatura de 36 1ºC, la cual se midió durante todo el registro. La velocidad de perfusión fue de 1.5 a
2mL/min.
Figura 3
Fig. 3. Equipo para perfundir y visualizar las rebanadas hipocampales. Las rebanadas hipocampales
fueron colocadas para registrar su actividad en una cámara de acrílico y perfusión constante con LCRA
calentado a 361 C.G (1)
Una vez realizado este procedimiento, a la rebanada se le colocaron los electrodos de registro y de
estimulación, posteriormente se buscó la espiga poblacional y se registró. La espiga poblacional o
potencial de campo poblacional que es el reflejo del número de neuronas piramidales activadas.
Figura 4
Figura 5
Fig. 4. Se muestra la cámara de registro (1) Fig 5·.Elementos neuronales de la formación
hipocampal. Las áreas marcadas incluyen el subinculum, parte de la corteza entorhinal, el gyrus dentate
y las regiones CA1 a CA4. El hipocampo se divide en (1) estrato orines 2) estrato piramidale 3) estrato
radiatum y 4) estrato lacunosum-moleculare. Se esquematizan también la forma más comúnmente usada
para inducir un potencial sináptico: que es aplicando un estímulo en las fibras colaterales de Schaffer y
registrar la actividad eléctrica en una neurona de CA1 a través de un microelectrodo (Modificado ) 2.
Registros de la actividad eléctrica de las neuronas piramidales.
Los registros extracelulares se realizaron utilizando microelectrodos llenos de solución de NaCl
2M, con una resistencia de 2-6 M. El potencial de membrana de un conjunto de neuronas se midió con
un preamplificador Axopatch (Axon Instruments Inc., USA). Los parámetros medidos a cada conjunto de
células fueron: la duración de la espiga, la amplitud y el número de espigas por pulso así como el
potencial de membrana en reposo. Una vez obtenida la espiga poblacional se adicionaron MEL y M3C a
rebanadas independientes y se observaron los efectos respectivamente. Figuras 6,7,8 y 9.
1.
3
RESULTADOS ANÁLISIS
Figura 6
Fig. 6. Se muestra la respuesta (promedio del porcentaje de amplitud) cuando se administra M3C a las
rebanadas
Figura 7
Fig. 7. Se observa que la MEL a las concentraciones de 15, 30 y 45M, aumenta la transmisión sináptica
sobre la región CA1 hipocampal. La curva de color amarillo representa la respuesta a ATP. Se muestra la
amplitud de la espiga (% control) en función del tiempo. La MEL y ATP aplicada por 5 min. está
indicada por la barra horizontal. La tetanización por LTP estimula la transmisión sináptica. A los 10 min.
de iniciado el registro se adicionaron los compuestos.
4
Figura 8
Figura 9
Fig 9.En esta figura se observa que el ATP a la
concentración de 30M, no presenta cambios
en esta gráfica. Pero con M3C se observa una
disminución de la respuesta (actividad eléctrica
de las neuronas del hipocampo). A los 5 min. de
iniciado el registro se adicionaron los
compuesto
Fig 8.En esta figura se observa que la MEL a la
concentración de 45 M, no presenta cambios
en esta gráfica. Con M3C 30M se observa una
disminución de la respuesta (actividad eléctrica
de las neuronas del hipocampo.). A los 3 min.
de iniciado el registro se adicionaron los
compuestos.
CONCLUSIONES
1.
2.
3.
La MEL produce excitación de los potenciales evocados (espiga poblacional), en la región CA1
hipocampal a las concentraciones de 15, 30 y 45 M, con mayor duración que con ATP a 30M.
El ATP produce depresión de los potenciales evocados (espiga poblacional), en la región CA1
hipocampal, a 30M.
El M3C produce depresión significativa de los potenciales evocados (espiga poblacional), en la
región CA1 hipocampal, a 30M comparados con ATP y MEL a 30M
BIBLIOGRAFÍA
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Maloine.1911.
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Sin autor, “Melatonin. Monograph.”, Alternative medicine review: a journal of clinical
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Touitou Y., “Melatonin: what for?”, Bull. Acad. Natl. Med., Vol. 189,5, 2005, pp. 879-891.
AGRADECIMIENTOS
Al Proyecto apoyado por PAPIIT-DGAPA-UNAM. Clave No. IN205905 para el desarrollo de este
trabajo.
Al Ing. E. Jorge Zamorano-Velasco, por su asesoría en el manejo del software.
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