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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO
Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES
RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº37
RICARDO LÓPEZ INGUNZA
ALBINA DÍAZ OLIVERA
EDGAR CONDORI CONDORI
2005
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE
VARIANTES RABICAS EMERGENTES RESPONSABLES DE
CASOS HUMANOS
CÓDIGO OGITT: 2-01-05-03-050
Ricardo López Ingunza*, Albina Díaz Olivera*, Edgar Condori Condori*
*Laboratorio de Referencia Nacional de Zoonosis Virales del Centro Nacional de
Salud Pública del Instituto Nacional de Salud
Correspondencia: Ricardo López Ingunza, Instituto Nacional de Salud, Calle
Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471. Correo electrónico:
[email protected]
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ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
1. TITULO DEL PROYECTO
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES
RABICAS EMERGENTES RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
CÓDIGO: 2-01-05-03-050
2. NOMBRE DE LOS RESPONSABLES
a) Investigador principal: Ricardo López Ingunza.
b) Investigadores colaboradores: Albina Díaz Olivera, Edgar Condori Condori
3. INTRODUCCION
La rabia es un serio problema de salud pública por las consecuencias letales a su
exposición. La rabia en nuestro país se presenta en dos ciclos epidemiológicos, uno urbano
y otro silvestre. En el ciclo urbano, el perro es el reservorio y transmisor de esta enfermedad
y en el ciclo silvestre el reservorio más importante es el murciélago vampiro Desmodus
rotundus, a pesar de existir otras dos especies de murciélagos hematófagos. El virus rábico
implicado en ambos ciclos pertenece al género Lyssavirus, Genotipo 1, de amplia
distribución en el mundo y comprende la mayor parte de los virus de rabia aislados de
mamíferos terrestres, murciélagos (insectívoros y hematófagos) y cepas de laboratorio.
Dentro de este genotipo 1, sin embargo, se han encontrado en diferentes regiones del
mundo, diferencias fundamentalmente a nivel de la glicoproteína, lo cual da origen a distintas
cepas del virus (1). Con respecto a las proteínas de la nucleocápside se cree que están más
conservadas genéticamente. Sin embargo, algunos autores señalan que han hallado
algunas variantes del virus rábico que pudieran explicar algunas fallas producidas en algunas
personas vacunadas correctamente (2). Las diferencias en la glicoproteína han sido
investigadas a través de los estudios con la utilización de anticuerpos monoclonales, que han
demostrado diferentes variantes antigénicas (3). Estas variantes se vienen estudiando en
nuestro medio desde el año 1984, a través de la cooperación con OPS y el CDC y han
demostrado la presencia de por lo menos cinco variantes claramente establecidas (4, 5 y 6).
El objetivo del presente trabajo fue el de caracterizar inmunológicamente, genéticamente y
patogénicamente las cinco variantes de virus rábico aisladas, durante los años de 1999 al
2002 de los casos humanos en el Laboratorio de Referencia Nacional de Zoonosis Virales
del Instituto Nacional de Salud.
3
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
4. MATERIALES Y METODOS
El estudio se realizó en el Laboratorio de Zoonosis Virales del Centro Nacional de Salud
Pública del Instituto Nacional de Salud. Se utilizaron cinco variantes rábicas humanas
aisladas en ratones albinos suizos Balb-C/CNPB- INS de 21 días de edad, remitidas al
Laboratorio del INS, durante los años de 1999 y el 2002. Las variantes rábicas tuvieron
como procedencia los departamentos de: Apurímac (494-1999, 179-1999), Madre de Dios
(3851-2000, 8284-2000) y Puno (1449-1999). De cada variante se preparó un stock de
virus mediante un primer pasaje de ratones en una suspensión de cerebro de ratón al
20% de suero fisiológico, conteniendo suero equino al 2%, penicilina y estreptomicina. El
virus CVS (Challege Virus Standard) fue utilizado y propagado según lo descrito en textos
que describen dicho procedimiento (3).
ESTUDIO DE INMUNOGENICIDAD
Variantes Rábicas. Los aislamientos de los casos humanos fueron caracterizados
antigénicamente previamente al estudio mediante la prueba de Inmunofluorescencia
indirecta (ver Cuadro No 1). Esta fue realizada en impresiones de cerebro fijadas en
acetona fría, utilizando un panel de ocho anticuerpos monoclonales dirigidos contra la
nucleoproteína viral, proporcionada por el Centro de Prevención y Control de
Enfermedades de Estados Unidos. Los perfiles de reacción de las diferentes variantes
rábicas a los anticuerpos monoclonales han sido previamente descritos (7).
Cuadro No 1. Caracterización antigénica de las cinco cepas humanas aisladas en
los años, 1999 al 2002.
No de muestra
Variante
Origen
Año
Animal agresor
1449
1
Puno
1999
Can
3851
2
Madre de Dios
2000
Can
494
3
Apurímac
1999
Murciélago
8284
4
Madre de Dios
2002
Chozna
179
5
Apurímac
1999
Murciélago
4.3. Prueba de virus neutralización
Se siguieron los procedimientos estandarizados descritos (8). Básicamente, la prueba de
neutralización del virus en ratones es un procedimiento que se basa en la neutralización
de una serie de diluciones de virus con una dosis constante de un suero antirrábico
4
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
conocido, previamente titulado. Los resultados son expresados en términos de títulos
virales definidos como la dilución más elevada que neutraliza una cantidad estándar de
suero. El método comprendió tres etapas:
a) Titulación del virus desafío, b) preparación de las mezclas suero-virus y c) inoculación
en ratones. Para esta técnica se emplearon ratones albinos suizos, cepa Balb-C de 21
días y de 11 a 14 g de peso.
Dilución del virus y suero de referencia: Se calculó la dilución del virus que contenía: 3,2
32, y 320 DL50 que se enfrentaron a 0,5 UI de suero de referencia internacional. El
diluyente utilizado fue agua destilada con suero equino al 2%.
4.4. Prueba de sero-neutralización
Esta prueba está basada en la neutralización de una serie de diluciones del suero problema
(en este caso un suero positivo de paciente inmunizado con vacuna antirrábica de CRL) con
una dosis constante de virus rábico de desafío, (32 DL50 de cepas de casos humanos)
previamente titulado (8). El procedimiento seguido fue el siguiente: primero, se inactivaron
los sueros problemas a 56º por 30 minutos, luego se prepararon diluciones seriadas del
suero:1/2.5, 1/12.5 y 1/62.5, 1/312.5. De cada una de estas diluciones se pasaron 0.2 ml a
uno de una serie de tubos de ensayo. A continuación se agregan 0.2 ml de la dilución de
virus correspondiente a 64 DL50 de esta forma se produce una dilución doble tanto de los
virus como del suero, con lo que la dilución final de virus fue de 32 DL50 y las diluciones
finales del suero fueron de 1/5, 1/25, 1/125, 1/625, etc. Se incluyó en la prueba un suero de
referencia internacional (NIBSC). Una vez incubados los sueros a 37 grados centígrados
durante 1.5 horas, los tubos se colocaron en un recipiente con agua y hielo. Luego, se
inocularon intracerebralmente 0.03 ml de estas mezclas suero-virus en seis ratones, en el
caso de los sueros problema y se empleó ocho ratones para la titulación de virus. Los
ratones empleados de 11 a 14 gramos de peso, fueron albinos suizos, cepa Balb C,
proporcionados por el bioterio del Centro Nacional de Productos Biológicos del INS. Los
distintos grupos de ratones se mantuvieron en observación por 14 días y se consideraron
positivos los que mostraron sintomatología compatible a rabia durante este período. Se
realizó el análisis de la mortalidad por el método de Reed and Muench para la determinación
de valores logarítmicos alcanzados en la seroneutralización (8).
4.5. Prueba de potencia NIH
Se siguieron los procedimientos estandarizados descritos (8). Brevemente, se realizaron
dos vacunaciones a ratones albinos suizos Balb-C de tres semanas de edad, con una
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ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
semana de intervalo con 0,5ml de vacuna de uso humano, diluido a 1/5, 1/25 y 1/125, vía
intraperitoneal, producida en cerebro de ratón lactante mediante la técnica de FuenzalidaPalacios, para luego realizar el desafío con 5 a 50 DL50 de las cinco variantes antigénicas
y virus fijo CVS (Challenge Virus Standard), a la tercera semana. La dosis efectiva 50%
(DE50) de la vacuna fue calculada de acuerdo a lo descrito (8).
ESTUDIO DE PATOGENICIDAD
Se siguió el procedimiento de inoculación descrito (3). Para esto, se realizaron diluciones
de las cinco variantes del virus rábico con para luego ser inoculadas por diferentes vías
(intramuscular, subcutánea e intracraneal), con este procedimiento se calculó la dosis letal
50% (DL50).
ESTUDIO GENÉTICO
4.7. Prueba de RT-PCR
Para el RT-PCR se siguió el procedimiento descrito (1). Brevemente, la extracción del
ARN viral se realizó del cerebro de muestras de ratón empleando TRIzol (Invitrogen, San
Diego, CA, USA). El ADN complementario fue obtenido mediante trascripción reversa y la
reacción
en
cadena
de
la
polimerasa
(RT-PCR)
utilizando
los
primers
10g
(5´CTACAATGGATGCCGAC3´) y el 304 (5´TTGACGAAGATCTTGCTCAT3´): Los
tiempos y temperaturas utilizadas en el termociclador marca Amplitron® utilizados fueron:
RT-PCR: 94° C x 1 minuto, 42 °C x 60 minutos y 70° C x 15 minutos; PCR: 94° C x 2
minutos, 94°C x 30 segundos, 54°C x 40 segundos, 72°C x 60 segundos (30 ciclos) con
una extensión final de 72°C x 10 minutos. Posteriormente se realizó la electroforesis
empleando agarosa al 1.5% y en buffer TAE al 1%, se empleó como marcador de peso
molecular Phi X 174 Hae III empleando 100 voltios por 45 minutos.
4.8. Secuenciamiento viral
Para la prueba de Secuenciamiento se hizo la purificación de los productos amplificados
mediante un kit (Wizard, Promega™) y se utilizó primeramente el secuenciador
automatico de gel (ALF Express DNA Sequencer -Pharmacia). Posteriormente, se empleó
el secuenciador automático de ADN capilar ABI 310 Genetic Analyzer empleando para
ello un kit de secuenciamiento (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing). Las
secuencias obtenidas fueron alineadas mediante el software ClustalW (8).
Las
secuencias genéticas fueron comparadas con secuencias reportadas en el GENBANK
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ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ dicha comparación se realizó empleando 500 nucleotidos
correspondientes al gen de la nucleoproteína N localizado en la posición 874 y 1384
según la cepa BRvmbt41 reportado en Brasil. Para construir el árbol filogenético, se utilizó
el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versión 3.1 El método
utilizado fue el de Neighbor – Joining y la robustez o confianza del árbol filogenético
generado fue realizado utilizando un análisis de 1000 replicas –bootstrap. Asimismo, para
realizar la comparación en este estudio se incluyeron muestras de virus fijo CVS y PV y
un aislamiento de canino del año 2002 con el código 37476-02 el cual procede del
departamento de Puno.
5. RESULTADOS
5.1. Prueba de patogenicidad
Las pruebas de patogenicidad realizadas (Cuadro No 2) demostraron que de las cinco
variantes analizadas, la más patógena fue la Variante 5 por haber obtenido DL50
superiores al utilizar las diferentes vías de inoculación. Esta variante, cuando se utilizó la
vía intracraneal obtuvo una DL50 de 10-6.1, en la vía intramuscular 10-4 y por la vía
subcutánea 10-3.77 (como referencia el virus control, CVS, tuvo una DL50 de 10-7.6 vía
intracraneal). Ninguna de las otras cuatro variantes rábicas mostró similar consistencia
patogénica utilizando las tres vías de inoculación. A través de la vía intracraneal las
variantes 1 y 3 revelaron mayores DL50 que las variantes 2 y 3. Sin embargo, por vía
intramuscular, se observó que las variantes 1 y 2 correspondientes a rabia urbana fueron
más patógenas (DL50 101.77.y 101.8) que las variantes 3 y 4 de rabia silvestre (101.44 y
101.53). Caso contrario ocurrió en la vía subcutánea, donde las variantes 3 y 5,
correspondientes a rabia silvestres, fueron las más patógenas (102.26 y 103.77) comparadas
con las variantes de rabia urbana 1 y 2 (101.34 y 101.8 respectivamente).
Cuadro No 2. Títulos virales y períodos de incubación (PI), vías intracraneal,
intramuscular y subcutánea de las variantes rábicas.
No
variante
1
Titulo
Intracraneal
5.4
2
P.I.
11-18
Titulo
Intramus.
1.77
4.4
10-19
3m
5.17
4
5m
P.I.
13-23
Titulo
Subcutáneo
1.34
P.I.
18-25
1.8
17-25
1.8
18-22
7-17
1.44
12-28
2.26
13-25
4.33
12-21
1.53
13-23
1.7
12-23
6.1
6-22
4
10-22
3.77
11-22
7
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
CVS
7.6
6-11
1.57
6-8
1.75
6-8
ESTUDIO DE INMUNOGENICIDAD
5.2. Prueba del índice de neutralización del virus y la seroneutralización.
En el Cuadro No 3 se observan los resultados del índice de virus neutralización, indicando
que las variantes rábicas que obtuvieron la mayor neutralización a las 0.5 UI del suero de
referencia internacional utilizado, fueron las Variantes 4 y 3 (0.36, 0.11). Las variantes
menos neutralizadas fueron la variantes 1, 2, y 5 (< 0.1). El CVS utilizado como
comparación relativa tuvo un índice de 0.64.
Cuadro No 3. Prueba del índice de neutralización del virus utilizando las cepas
rábicas aisladas.
No Variante
Sobrevivientes /
Sobrevivientes /
Índice de virus
Total (con suero)
Total
neutralización
1
3 / 18
4/17
< 0.01
2
5 / 18
6/17
< 0.01
3
11/18
10/18
0.11
4
5/18
3/18
0.36
5
5/17
5/18
0.01
CVS
7/18
3/18
0.64
En el caso de las pruebas de seroneutralización, se encontraron diferencias al utilizar
diferentes sueros controles (de paciente e internacional). Cuando se utilizó el suero
control de paciente, las variantes 1, 2 y 3, obtuvieron mayor neutralización (DE50 2.19,
1.65 y 2.19 respectivamente) que las variantes 4 y 5, que obtuvieron menor neutralización
(DE50 0,7 y 1.48 respectivamente) Sin embargo, al utilizar el Suero de Referencia
Internacional, la variante 4 (DE50 1,0) obtuvo una mayor neutralización que las variantes 1,
2, 3 y 5 (DE50 1,1, 0.88, 1.22, 1,0 respectivamente) que obtuvieron menor
neutralizaciones.
8
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
Cuadro No 4. Resultados de la prueba de seroneutralización con las variantes
rábicas y sueros control de paciente y de referencia internacional.
Suero control de
Suero referencia
Variante
paciente
DE
Int.
Título de
DE 50
No
Sobrevivientes /
50
Sobrevivientes /
testigos
Total inoculados
Total inoculados
1
15/24
2.19
7/23
1.1
5.19
2
11/24
1.65
4/24
0.88
5.08
3
18/28
2.19
9/25
1.22
4.6
4
4/32
< 0.7
17/32
1.79
4.44
5
8/24
1.48
5/24
1,0
6.37
5.3. Prueba de Potencia
El Cuadro No 5 muestra los resultados de las pruebas de potencia de la vacuna
antirrábica humana CRL con cada una de las cepas de desafío. La vacuna protegió mejor
contra las Variante 3 (DE50 1.48), Variante 1 y Variante 5 (DE50 1.48, 1.07 y 1.05
respectivamente). Poca protección se obtuvo contra la Variante 4 y 2, sin embargo, se
debe de tomar en cuenta que las DL50 utilizadas fueron muy superiores en la prueba (32 y
36 respectivamente) contra las 3 - 10 DL50 utilizadas en el caso de las otras variantes.
Cuadro No 5. Prueba de potencia de la vacuna antirrábica humana CRL desafiada
con variantes rábicas responsables de casos humanos.
Variante utilizada
Sobrevivientes / Total
DE50
DL50
en desafío
1
16/46
1.07
10
2
6/44
0.63
36
3
25/46
1.48
5
4
3/44
0.49
32
5
15/45
1.05
3
CVS*
22/45
1.38
4
* Al utilizar la vacuna de referencia se obtuvo una DE50 1.71, prueba no corrida en
simultáneo.
ESTUDIO GENÉTICO
Las secuencias encontradas de las cinco muestras fueron las siguientes:
>179
9
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
GAGAGATGTATACATCTCGTTGGTGTTTACAATCTTGTTGTTCAACTCCTCACGAGTCACTCGAATATGTCTTGTTTAAAA
ACTCTGCAAACGAGTTAGGGCGAGTTTGATGGTTAGAGCTGACTGAGACATACCTCCTTATGTGTGATCTTTTTAGTCTA
CCTCCATTCATCATGATTCGTGTGTAAACGGCTTCTGGACTCCTAGTTTCACTGGAAAAGTAATCCTCATCATCAGAATTG
ACTGTTCCGTCATCTGCCAGGGCCGTTTCGGCTTTTGTTAATTCAGCTGCCTCATATTCCTGAAGTTCCTTCTCGTCCCT
GAAGAATCTCCTCTCAAAAGTTCCTTTTCCAAAAAACTCCTCCCCCAAATAGCCCCCAAGAACAGACATCTCATGCGGGG
CACATGTTGCAATCACCGTTGCATTTAAAGATCTCACCTGACCCATATAACATCCAACAAAGTGAATGAGGGTGAATACA
TGACCAACTGCCTTGGATGAGTACGGAGA
>3851
GGTGGATATACACAATCTCTAGATTTCTGGCACTCTGTTATTCAACTCTTTATGAGTCACTCGAATACGTCTTGTTTAGGA
ACTCAGCGAATGAGCCTGGACGGATTTGATGATTTGAACTGACTGAGACATATCTCCGAATATGTGATCTCTTCAGTCGA
CCTCCATTCATCATGATTCGAGTATAAACAGCTTCTGGACTTCTGGTCTCACCGGAGAAGTAGTCCTCGTCGTCGGAGTT
GACAGTTCCGTCGTCTGCCAGGGCCACGTCAGTTTTTATTAGTTCAGCCGCCTCATATTCTCGAAGTTCTTTTTCATCTC
TAAAGAATCTTCTTTCAAACGTCCCTTTCCCAAAGAATTCCTCTCCAAGATAGCCCCCTAGAACAGACATCTCATGAGGA
GCACAGGCGGCAATAACTGTTGCATTAAGGGATCTGACTTGACCCATGTAGCATCCAACAAAGTGAATGAGATTGAACA
CATGACCAACGGCATTTGATGAATAAGGAGA
>8284
GAGAGATGTATACATCTCGTTGGTGTTTACAATCTTGTTGTTCAACTCCTCACGAGTCACTCGAATATGTCTTGTTTAAAA
ACTCTGCAAACGAGTTAGGGCGAGTTTGATGGTTAGAGCTGACTGAGACATACCTCCTTATGTGTGATCTTTTTAGTCTA
CCTCCATTCATCATGATTCGTGTGTAAACGGCTTCTGGACTCCTAGTTTCACTGGAAAAGTAATCCTCATCATCAGAATTG
ACTGTTCCGTCATCTGCCAGGGCCGTTTCGGCTTTTGTTAATTCAGCTGCCTCATATTCCTGAAGTTCCTTCTCGTCCCT
GAAGAATCTCCTCTCAAAAGTTCCTTTTCCAAAAAACTCCTCCCCCAAATAGCCCCCAAGAACAGACATCTCATGCGGGG
CACATGTTGCAATCACCGTTGCATTTAAAGATCTCACCTGACCCATATAACATCCAACAAAGTGAATGAGGGTGAATACA
TGACCAACTGCATTGGATGAGTACGGAGA
>1449
GAGGGATATACACGATTCCTGGATCTCCGGCACCCTGTTATTCAACACCTTATGAGTCACTAGAATATGTCTTGTTCAAA
AACTCGGCGAATGAGTTTGGACGGGCTTGATGATTGGAACTGACCGAGACATATCTCCGTATATGCGATCTCTTTAGTC
GACCTCCATTCATCATGATTCGAGTATAAACAGCCTCAGGACTTCTAGTTTCACCGGAAAAGTAGTCCTCGTCGTCGGAG
TTGACAGTTCCATCATCTGCCAGTGCCACATCAGTCTTTGTCAATTCAGCCGCCTCGTACTCCTGAAGTTCTTTCTCATCT
CTGAAGAATCTTCTTTCAAATGTTCCTTTTCCGAAGAATTCCTCCCCCAGATAACCCCCCAAAACAGACATCTCATGAGG
AGCACATGCAGCAATAACTGTTGCATTTAGGGATCTGACTTGACCCATATAACATCCAACAAAGTGAATGAGATTGAACA
CATGACCAACGGCATTTGATGAATAAGGAGA
>cepaCVS
GATGGATATATACAATCTATAGATTTCTGGGCACCCTGGTCAATCAACTCCTTATGAGTCATTCGAATACGTCTTGGTTTA
AAAATTCGGCGAATGAGTTTGGACGGGCTTGATGATTGGAACTGACTGAGACATATCTCCGTATATGAGATCTCTTCAGT
CGACCTCCATTCATCATGATTCGAGTATAGACAGCTTCTGGACTTCTGGTTTCACCAGAGAAATAGTCCTCGTCATCAGA
GTTGACGGTTCCGTCATCTGCCAGTGCCACGTCGGACTTTGTTAGTTCAGCCGCCTCATATTCTTGAAGTTCTTTCTCGT
CTCTGAAGAACCTTCTTTCAAATGTCCCTTTTCCGAAGAATTCCTCTCCCAAATAGCCCCCTAGAACAGACATCTCATGA
GGGGCACATGCAGCAATAACCGTCGCATTTAGAGATCTGACTTGACCCATGTAGCATCCAACAAAGTGAATGAGATTGA
ACACATGACCGACAGCATTCGATGAATAAGGAGA.
Variante 2
Variante 1
Variante 5
Variante 4
FIGURA No 1. Análisis filogenético de las secuencias de nucleótidos de los casos de rabia
humana. Para construir el árbol filogenético se utilizó el software Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) versión 3.1, utilizando el método de neighbor joining. La robustez o confianza del
árbol filogenético generado fue realizado utilizando un análisis de 1000 bootstraps.
10
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
La filogenia demuestra dos grupos de transmisión bien definidos. El primer grupo,
compuesto por las Variantes 4 y 5 corresponden a un ciclo de transmisión de rabia
silvestre y presentando una homología del 99.8%. Este resultado se corroboró, cuando se
realizó la comparación con secuencias reportadas en el genbank y encontrar una
identidad del 97% con reportes de aislamientos a partir de murciélago vampiro. El
segundo grupo filogenético esta compuesto por las Variantes 1 y 2, los virus fijo CVS y
PV, y también por la muestra comparativa de un can de Puno con No 37476-02. La
muestras 37476 y la Variante 1 presentan una identidad del 98.8%, incriminando al perro
como transmisor de la rabia del caso humano No 1449. La Variante 2 (No 3851) tuvo una
semejanza del 88.8% con el CVS y del 87.1% con la Variante 1. Esta Variante (No 3851)
al ser comparado con las secuencias del genbank mostró una identidad del 97% con un
aislamiento de caso humano donde el reservorio responsable fue el can. La variante 3 no
pudo ser incluida dentro del árbol filogenético debido a un alto porcentaje de
ambigüedades obtenidas en el secuenciamiento.
6. DISCUSIÓN
Los resultados de las pruebas de patogenicidad demuestran diferencias de uno a tres
logaritmos entre las cinco variantes y entre las vías de inoculación utilizadas. Sin
embargo, la Variante 5 fue la que mostró la mayor patogenicidad en las tres vías
utilizadas. Diferencias similares entre cepas caracterizadas de animales silvestres y sus
diferentes vías de inoculación han sido descritas en otro estudio (11).
Se
encontraron
algunas
diferencias
en
los
resultados
de
las
pruebas
de
seroneutralización al utilizar diferentes sueros controles (de paciente e internacional). Sin
embargo, la única variante que mostró consistencia, con una menor neutralización, en
ambas pruebas fue la Variante 5. Similares resultados fueron encontrados en cepas de
virus calle en un estudio que demostraron diferencias antigénicas con la cepa de
referencia internacional en pruebas de neutralización (10). En lo concerniente a la prueba
del Índice de neutralización del virus, las variantes menos neutralizadas por el suero de
referencia fueron la 1, 2 y 5. Comparando la prueba de seroneutralización y la del índice
de virus neutralización se corrobora la variante 5 como la variante de más difícil
neutralización por el suero antirrábico.
11
ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
En el caso de las pruebas de potencia realizadas se encontró que para las Variantes 2 y
4, la vacuna antirrábica humana CRL tuvo protección menor. Sin embargo, las DL50
utilizadas fueron mayores en el desafío de estas Variantes, lo que podría estar sesgando
el resultado de estas pruebas de potencia. En Chile un trabajo preliminar realizado en el
Instituto de Salud Pública (ISP), tuvo resultados que demostraron que la vacuna
antirrábica tipo Fuenzalida-Palacios, usada de rutina para controlar la infección, no
protegía eficazmente a animales de laboratorio desafiados con aislados de virus "calle"
(10).
Los hallazgos del secuenciamiento genético indicaron dos grupos de virus claramente
diferenciados, uno de rabia urbana y otro de rabia silvestre. En el caso del grupo de rabia
urbana, se encontró que la homología de las Variantes 1 y 2 fue del 87,1% diferenciado
claramente estas dos variantes. Sin embargo, dentro del grupo de rabia silvestre, las
variantes 4 y 5, tuvieron una homología del 99.8% indicando probablemente que son una
misma variante.
CONCLUSIONES
En el estudio de patogenicidad, se estudiaron cinco variantes obtenidas de aislamientos
de virus rábico de casos humanos, encontrándose que la variante 5, perteneciente al
ciclo silvestre, es la más patógena por su corto período de incubación. Asimismo, en el
estudio de inmunogenicidad, la variante 5 también fue la que obtuvo menor neutralización
al suero antirrábico. Sin embargo, en la prueba de potencia la vacuna tuvo una buena
protección contra la Variante 5. En el estudio genético se corroboró las diferencias
genéticas entre la rabia urbana perteneciente a las variantes 1 y 2 y la rabia silvestre
pertenecientes a las variantes 4 y 5. Sin embargo, se indica que la variante 4 tiene alta
homología con el grupo de la variante 5.
RECOMENDACIONES
Se recomienda continuar con los estudios inmunológicos y genéticos de nuevos
aislamientos para obtener un árbol filogenético con mayor información y lograr un mapa
que sirva de apoyo a los estudios de epidemiología molecular del virus rábico.
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ESTUDIO INMUNOLÓGICO, GENÉTICO Y DE PATOGENICIDAD DE VARIANTES RABICAS EMERGENTES
RESPONSABLES DE CASOS HUMANOS
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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