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Deficiencia de Biotinidasa Generalidades La biotina, es una vitamina soluble en agua que pertenece al complejo B, actúa como una coenzima en cada uno de cuatro carboxilasas en el ser humano: piruvato carboxilasa, propionil CoA carboxilasa, b-CoA metilcrotonil carboxilasa, y acetil CoA carboxilasa. Estas enzimas tienen un papel importante en la gluconeogénesis, síntesis de ácidos grasos y el catabolismo de aminoácidos. La biotina se deriva de la dieta y desde la actividad sintética de la microflora gastrointestinal Cada una de las carboxilasas se sintetiza como una apoenzima inactiva que posteriormente es biotinilada a través de dos reacciones parciales, cada una de los cuales es catalizada por la enzima sintetasa holocarboxilasa. Acetil CoA carboxilasa cumple sus funciones principalmente en el citosol, mientras que los otros tres holocarboxylases funcionan en las mitocondrias. Estas enzimas se degradan proteolíticamente, probablemente por el sistema de autofagia lisosomal. Los productos que contienen biotina proveniente de la degradación de biocitina: (EN-biotinil-L-lisina) y péptidos biotinilados, son sustratos de la biotinidasa, que escinde el enlace amida entre la lisina y la biotina. La biotina liberada se recicla y entra en el pool de biotina libre. Biotinidasa actua sobre biocitina, para transferir a la biotina a aceptores nucleófilos, tales como histonas. El significado fisiológico de esta función aún no se ha determinado. El defecto en el ciclo de utilización de biotina en humanos da lugar a deficiencia múltiple de carboxilasa y comprende dos defectos geneticos. .1- La deficiencia de sintetasa holocarboxilasa (MIM 253270), también conocida como de inicio precoz (neonatal) que incorpora biotina a la proteina enzima 2- Deficiencia múltiple de carboxilasa , que no tine biotina disponible para su activación por falta de disponibilidad de biotina libre desde las proteinas ligadoras que la proveen como la bioticina. La deficiencia de biotinidasa (MIM 253260), también conocida como de aparición tardía (juvenil), deficiencia múltiple de carboxilasa, es un trastorno del reciclaje de la biotina Se ha descrito en aproximadamente treinta niños. La deficiencia de sintetasa holocarboxilasa Cuadro clínico Los síntomas incluyen dificultades en la alimentación y la respiración, hipotonía, convulsiones, letargo. A veces progresión de retraso en el desarrollo o estado de coma. Algunos niños presentan erupciones en la piel y alopecia, acidosis metabólica, aciduria orgánica, y de leve a moderada hiperamonemia. La aciduria orgánica incluye elevadas concentraciones de b-hidroxiisovalerato, b-methylcrotonylglycine, b-hidroxipropionato, methylcitrate, lactato y triglylglycina.. El defecto de la enzima se ha demostrado en los linfocitos, fibroblastos cultivados, y linfoblastos de los niños afectados. La holocarboxilasa sintetasa en los tejidos de la mayoría de los niños examinados muestra incremento en los valores de Km para la biotina,. La deficiencia de holocarboxilasa sintetasa se hereda como un rasgo autosómico recesivo. La enzima de mamífero normal se ha purificado y caracterizado bioquímicamente. El cDNA para sintetasa holocarboxilasa humano ha sido aislado y secuenciado. Las mutaciones múltiples en el gen de la sintetasa han sido identificadas. Dra. María Sofía Giménez 1 Algunas de estas mutaciones se producen dentro del dominio que une la biotina y es probable que determine el aumento del Km de la biotinidación, que se observa en esta enfermedad. . Los niños con deficiencia de holocarboxilasa sintetasa generalmente mejoran clínicamente siguiente la administración de 10 mg de biotina por vía oral por día. Deficiencia en la holocarboxilasa sintetasa se puede diagnosticar prenatalmente mediante la medición de la concentración de ácidos orgánicos en el líquido amniótico y / o mediante la medición y comparación de las diversas actividades decarboxilasa mitocondriales en los amniocitos cultivados con y sin biotina. El diagnóstico prenatal también es posible mediante análisis de mutaciones. Durante dos embarazos se ha realizado el tratamiento prenatal. Los niños fueron clínicamente normales al nacer y no tenían aciduria orgánica. No está claro si los niños en situación de riesgo el tratamiento con biotina inmediatamente después del nacimiento son necesarios. La deficiencia de biotinidasa se ha descrito en más de 120 niños sintomáticos. Las características clínicas comúnmente incluyen convulsiones, hipotonía, ataxia, problemas respiratorios, pérdida de la audición, atrofia óptica, retraso en el desarrollo, erupción cutánea y alopecia. Otros síntomas son las infecciones de conjuntivitis y hongos, que son probablemente debido a las anormalidades en la inmunorregulación. La expresión clínica de la enfermedad es muy variable. La edad de inicio de los síntomas varia de varias semanas a varios años, la edad media de inicio son 3 y 5 meses, pero el inicio de los síntomas se ha producido en fecha tan tardía como a los 10 años de edad. La mayoría, pero no todos, los niños sintomáticos presentan acidosis metabólica y orgánica cetolactico aciduria. La aciduria orgánica comúnmente se manifiesta en las concentraciones elevadas de b-hidroxiisovalerato, lactato, b-methylcrotonylglycine, b-hidroxipropionato, y methylcitrate La deficiencia de biotinidasa se diagnostica mediante la demostración de la actividad de la enzima deficiente en el suero. Loa niños sintomáticos tienen deficiencia de biotinidasa profunda (<10 por ciento de actividad media del suero normal). También se ha identificado a niños recién nacidos con deficiencia parcial de biotinidasa (10-30 por ciento de la actividad normal ). El suero normal contiene al menos nueve isoformas de biotinidasa, cuatro mayores y cinco menores entre pH 4,5 y 4, La enzima de plasma ha sido purificado hasta la homogeneidad. La enzima es una monómero glicosilado. El cDNA para biotinidasa de suero humano ha sido aislado y secuenciado. La estructura genómica y la organización de la enzima humana también se han determinado. Más de 24 mutaciones se han encontrado en los niños sintomáticos con profunda deficiencia de biotinidasa. Hay al menos dos mutaciones comunes que se producen entre los niños con profunda deficiencia de biotinidasa identificados por cribado neonatal. Deficiencia de biotinidasa parcial es generalmente debido a una combinación de un alelo con una mutación puntual, que se traduce en una enzima que tiene aproximadamente 50 por ciento de la actividad normal y se encuentra en alrededor del 4 por ciento de la población en general. Dra. María Sofía Giménez 2 Los individuos con deficiencia de biotinidasa no pueden reciclar biotina endógena y no se puede liberar biotina -unida a proteínas. El cerebro puede ser incapaz de reciclar de manera adecuada y biotina puede depender de la transferida a través de la barrera hematoencefálica Esto puede resultar en disminución de la actividad de piruvato carboxilasa en el cerebro y en la acumulación de lactato. La acidosis láctica localizada puede causar la temprana aparición de síntomas neurológicos. La deficiencia de biotinidasa se hereda como un rasgo autosómico recesivo. Los heterocigotos puede determinarse en 95 por ciento de los casos, demostrando que la actividad enzimática en el suero es intermedio entre el de los individuos normales y deficientes. El diagnóstico prenatal de la deficiencia de biotinidasa por determinación de la actividad enzimática enzimática y análisis de la mutación es posible Actividad biotinidasa se puede determinar en el mismo empapado en sangre de papel de filtro utilizado en la mayoría de los programas de diagnóstico neonatal Los niños con deficiencia de la enzima identificada a través de los programas de diagnóstico neonatal han sido tratados con biotina y se han mantenido asintomáticos. El método utilizado en la evaluación del recién nacido también ofrece una medio sencillo y rápido para el médico para evaluar la actividad de biotinidasa en los individuos sospechosos de tener el trastorno Los niños con deficiencia de biotinidasa han sido tratados con éxito con entre 5 y 20 mg por vía oral de biotina (en forma libre no ligada,) por día. Todos los pacientes con la deficiencia deben responder a la terapia de la biotina. Si el niño permanece sin diagnosticar durante mucho tiempo o experimenta compromiso metabólico severo, algunos de los problemas neurológicos, como pérdida de audición, atrofia óptica, o retraso del desarrollo, no se puede resolver. Las dosis de biotina sólo ligeramente por encima de los requerimientos fisiológicos eventualmente puede ser demostrado que es suficiente para el tratamiento Las deficiencias de carboxilasas múltiples deben ser diferenciadas de otras de inicio agudo de trastornos del metabolismo y deficiencias nutricionales que se derivan de la hiperalimentación con soluciones que carecen de biotina. Debido a que tanto la deficiencia de holocarboxilasa sintetasa y la deficiencia de biotinidasa son tan susceptibles a la terapia con biotina, estos trastornos deben ser considerados en cualquier niño con síntomas neurológicos inespecíficos, sobre todo cuando están presentes las anomalías cutáneas. La pesquisa neonatal de deficiencia de biotinidasa, seguido por la pronta iniciación de la terapia en los niños deficientes, parece prevenir las consecuencias clínicas de este trastorno Biotina La biotina es una vitamina del complejo B soluble en agua y, como tal, debe ser proporcionado en la dieta de los mamíferos y las aves. Se reconoció por primera vez como un factor esencial en los sistemas vivos en 1936. La molécula de biotina consiste en un anillo heterocíclico unido a una cadena lateral alifática que termina en un groupo ácido carboxílico. En los seres humanos, la biotina está directamente involucrada en los procesos metabólicos de importancia vital de la gluconeogénesis, síntesis de ácidos grasos, y el catabolismo de aminoácidos a través de su papel como un grupo prostético en cada una de las cuatro carboxilasas Dra. María Sofía Giménez 3 El ciclo de biotina se muestra el reciclaje metabólica de biotina. Los dos principales enzimas implicadas en este ciclo son holocarboxilasa sintetasa, que une covalentemente biotina a las apocarboxylases de las diferentes holocarboxylases ,de biotinidasa, la cual hidroliza la biotina de biocitina o biotinil cortando péptidos que se forman a partir de la degradación proteolítica de holocarboxylases y posiblemente de la dieta Tres de las enzimas, la piruvato carboxilasa (CE 6.4.1.1), propionil CoA carboxilasa (CE 6.4.1.3), y b-methylcrotonoyl CoA carboxilasa (CE 6.4.1.4), son mitocondriales, y la cuarta, acetil CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2), es cytosolica,.4 piruvato carboxilasa cataliza la conversión de piruvato a oxaloacetato, un intermedio en la biosíntesis de fosfoenolpiruvato y, en última instancia, la glucosa. Acetil-CoA carboxilasa cataliza la formación de malonil-CoA en acetil CoA, el primer paso comprometido en la biosíntesis de los ácidos grasos. Propionil CoA carboxilasa está implicado en el catabolismo de varios aminoácidos de cadena ramificada y ácidos grasos de longitudes de cadena impar de carbono mediante la conversión de propionil CoA a metilmalonil CoA, que en última instancia entra en el ciclo del ácido tricarboxílico. b-CoA Methylcrotonoyl carboxilasa está implicada en el catabolismo de leucina por la conversión de b-CoA a methylcrotonoyl b-methylglutaconyl CoA. Dra. María Sofía Giménez 4 Las deficiencias de las carboxilasas y la acumulación consiguiente de altas concentraciones de intermediarios metabólicos pueden tener profundos efectos en otras vías. El paso final en la síntesis y la activación de carboxilasas que contienen biotina es la formación de la holocarboxylases activas por medio de la unión covalente de biotina a los apoenzimas diferentes. El resto biotinil está unido a través de un enlace amida a través del grupo carboxilo en su cadena lateral de un lisil e-amino de la apoenzima. Esta fijación es catalizada por holocarboxilasa synthetasa. La degradación de las carboxilasas, por escisión del grupo biotinil del e-amino grupo de lisina, es catalizada por la biotinidasa (CE 3.5.1.12) y la liberación de la biotina libre, que se recicla. Los trastornos que resultan de la deficiencia individual de cada uno de las tres carboxilasas, biotina-dependiente mitocondriales, han sido documentados Cada uno se caracteriza por un perfil anormal de ácidos orgánicos en la orina, que es atribuible a la acumulación de una o más compuestos intermedios en la sangre. Un solo caso de deficiencia de acetil-CoA carboxilasa ha sido reportado. Los niños con los trastornos de carboxilasas aislados no responden al tratamiento con biotina, y la información disponible indica que las alteraciones estructurales de las enzimas individuales son responsables de la actividad deficiente ADQUISICIÓN Y PÉRDIDA DE BIOTINA En 1916, se observaron efectos tóxicos en ratas que recibieron dietas que contenían una alta concentración de clara de huevo cruda, secada, y cuando la clara de huevo cruda fue la única fuente de proteína. Se desarrolló en ratas, un síndrome caracterizado por trastornos neuromusculares, dermatitis severa, y pérdida de. La condición era denominada lesión clara de huevo y se demostró que era evitable por calentamiento de la proteína o mediante la administración de otros alimentos como la levadura, el hígado, o un compuesto de yema de huevo que promueve el crecimiento de la levadura. Este compuesto se muestra más adelante que era biotina. El antagonista de la biotina es la glicoproteína avidina Dra. María Sofía Giménez 5 Fuentes Alimentos. Aunque la biotina se encuentra ampliamente en los productos alimenticios naturales, la concentración absoluta, incluso en las fuentes más ricas es muy baja. Hígado, riñón, yema de huevo, y algunas verduras son buenas fuentes de biotina, Microflora intestinal. Hace 40 años se asumió que la microflora intestinal sintetizaba toda la biotina requerida en los seres humanos o completaba la biotina de la dieta, de manera que la biotina estaba disponible en más de cantidades adecuadas. Hay pruebas disponibles de diversas fuentes las cuales sugieren que ni la dieta ni la microflora solo satisface la demanda real para la biotina, incluso en las personas clínicamente normales de la población. La concentración de la biotina en la orina y en las heces es mayor que la ingresada en la dieta. La biosíntesis. Los mamíferos no pueden sintetizar biotina. Más de 30 especies de bacterias son conocidas por ser capaces de sintetizar biotina, y algunas de estas bacterias se han identificado en intestino del ser humano Los antibióticos y sulfamidas alteran la flora intestinal y conducen a una reducción en la producción de biotina en las heces. Las concentraciones de biotina de alimentos, tejidos y fluidos biológicos se han medido utilizando ensayos de crecimiento en pollo y rata, los ensayos microbiológicos de crecimiento, y ensayos de unión competitiva que implican el uso de avidina y marcado de biotina. radiactivamente. Los métodos utilizados actualmente son los microbiológicos y ensayos de unión a avidina. Lactobacillus plantarum y el protozoo Ochromonas Danica son los dos microorganismos que se utilizan con mayor frecuencia para medir la biotina en extractos biológicos. La biotina en los alimentos y materiales biológicos se encuentra en diferentes formas químicas. Las verduras verdes y las frutas contienen las formas de biotina extraíbles en agua. La biotina en los productos de levadura y de los animales es abundante, pero se produce con firmeza complejos enlazados que son insolubles en agua. Semillas y nueces también contienen grandes cantidades de biotina. Biotina unida a proteína puede ser liberada o bien por hidrólisis ácida o con enzimas tales como tripsina, pero también esta sujeta a la degradación si las condiciones de hidrólisis son graves. Por ejemplo, el tratamiento con ácido N 4 sulfúrico destruye parte de la biotina en la levadura, maíz y soja y la hidrólisis con ácido clorhídrico también destruye la biotina. Las condiciones óptimas para la hidrólisis de los productos animales y vegetales parecen ser autoclave durante 2 horas a 121 ° C con 6 N y 2 ácido sulfúrico N, respectivamente. La eficiencia de liberación está negativamente correlacionada con el número de residuos de aminoácidos en un polipéptido biotinilado. Biotinidasa está presente en la mucosa intestinal de varios especies y en el jugo pancreático el que puede jugar un papel importante en la digestión y absorción de la biotina en la dieta humana .Proteolisis extensa es probablemente necesaria antes de que la biotinidasa en el intestino pueda ser útil liberando biotina a partir de péptidos biotinilados disponibles para la absorción. La absorción de la biotina es un saturable dependiente de sodio Dra. María Sofía Giménez 6 En los seres humanos, la vitamina se absorbe rápidamente por vía oral después de la carga, y son las concentraciones plasmáticas máximas de la biotina alcanzado 30 a 60 minutos después de administration. La biotina es transportada en el borde en cepillo de las celulas intestinales humanas mediado por un gradiente de sodio Biotina introducida en altas concentraciones in vivo puede ser absorbida por el intestino grueso, así como desde el intestino delgado en humanos. Tejido de transporte y la absorción celular. La biotina se une inespecíficamente a proteinas del suero / plasma . Estudios recientes sugieren que la biotina puede unirse covalentemente a biotinidasa a pH neutro. En el cerebro de la rata, la biotina es transportada a través de los capilares cerebrales por un proceso de baja afinidad saturable que depende de la presencia del grupo ácido carboxílico libre de la parte biotina Requerimientos de biotina La dosis recomendada. La incertidumbre sobre la contribución de la microflora intestinal ha impedido el establecimiento de un cantidad diaria recomendada de biotina para los seres humanos, Para bebés, la ingesta diaria segura se ha fijado en 35 mg de biotina; que para adultos es de 150 a 300 mg. La biotina parece ser relativamente nontoxica. La deficiencia de biotina Los síntomas clínicos más evidentes de la deficiencia de biotina en los seres humanos son la alopecia y alteraciones cutáneas tales como dermatitis, erupciones eritematosas infección periorificial, sequedad y hongos. Los síntomas neurológicos observados en los adultos incluyen la depresión leve progresando a cansancio extremo, somnolencia, dolor muscular,hiperestesia, y paresthesia.. El consumo de huevos crudos, los cuales contienen avidina, ha dado lugar a la deficiencia de biotina en varios niños y adultos. Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de biotina también se han desarrollado en pacientes que reciben a largo plazo la alimentación parenteral total, sin biotina. Estos pacientes también pueden presentar una disminución sérica de la actividad de biotinidasa, presumiblemente porque la deficiencia nutricional La terapia anticonvulsiva acelera el catabolismo de biotina. La biotinilación de Apocarboxylases En carboxilasas activas, la biotina se une covalentemente al grupo de e-amino de un residuo de lisina. La biotinilación de apoenzimas ha sido estudiada en procariotas y eukaryotes que es catalizada por la sintetasa holocarboxilasa La secuencia de aminoácidos en la región, el residuo de lisilo biotinilado de las carboxilasas (-Ala-MetMet-biocitina-) se conserva en diferentes especies. Esta región puede funcionar como un sitio de reconocimiento para la sintetasa. La carboxilasa apocarboxylases mamíferos piruvato y acetil CoA carboxilasa enzimas son homopolimérica, mientras que propionil CoA carboxilasa y b-methylcrotonoyl CoA carboxilasa son heteropolymericas. Las enzimas heteropolymericas están compuestas de subunidades A y B; biotina es unida a cada subunidad Dra. María Sofía Giménez 7 Las dos subunidades no idénticas que comprenden el hexámero de propionil CoA carboxilasa se sintetizan en el citosol con péptidos líder que facilitan su transporte en el mitocondrias. Las reacciones que implican carboxilasas dependientes de biotina Las principales vías bioquímicas y productos intermedios que afectan a las cuatro carboxilasas que contienen biotina en los seres humanos son: Acetil-CoA Carboxilasa cataliza la formación de malonil CoA a partir acetil-CoA. Malonil CoA es el principal sustrato en la síntesis y elongación de la cadena de ácidos grasos. La síntesis del ácido oxalacético a partir del piruvato es catalizada por la piruvato carboxilasa. Esta reacción proporciona un intermedio primario para el ciclo del ácido tricarboxílico, y proporciona una fuente de esqueletos de carbono para la síntesis de aspartato y glutamato. Ácido oxalacético se utiliza en el hígado y el riñón para gluconeogénesis. Propionil CoA carboxilasa cataliza la carboxilación de propionil CoA para formar metilmalonil CoA, que se somete a isomerización para succinil CoA y posteriormente entra en el ciclo del ácido tricarboxílico. B-Methylcrotonoyl-CoA carboxilasa forma b-CoA a partir methylglutaconyl b-methylcrotonoyl CoA en la ruta catabólica de la leucina. Actividad alterada de una o más de los carboxilasas provoca profundas consecuencias metabólicas. Biotinidasa Biotinidasa cataliza la escisión de la biotina de biocitina o péptidos biotinil pero no desde holocarboxylasa.intacta. Biotinidasa probablemente juega un papel en el procesamiento de las proteínas de la dieta que unen biotina. Además, biotinidasa se ha demostrado que exhiben actividad amino exopeptidasa Biotinidasa se purificó parcialmente a partir de diversas bacterias, plasma porcino, riñón, cerebro y se ha purificado hasta homogeneidad a partir suero y leche humana Biotinidasa, se ha demostrado que tiene actividad biotinil-transferasa resultante en la transferencia de biotina de biocitina a aceptores de nucleófilos, tales como histonas. La actividad transferasa se produce a pH fisiológico y en concentraciones fisiológicas de biocitina y, por tanto, puede ser la principal función de la enzima en suero y otros tejidos. Caracterización bioquímica de biotinidasa. Biotinidasa de mamíferos es detectable en la mayoría de los tejidos, pero las actividades más altas están presentes en el hígado, riñón, suero, y glándula suprarrenal. Biotinidasa humana es una glicoproteína compuesta por un solo polipéptido que tiene una masa molecular de entre 67 y 76 kDa. Contiene un tiol esencial y, un residuo de serina cerca del sitio activo Los valores de Km del sustrato artificial, biotinil p-aminobenzoato, y el sustrato natural, biocitina, son de 5 a 10 mM. Biotina es uno de los productos finales de la reacción y un inhibidor competitivo de la enzima, el Ki estar entre 225 y 1300 mM. La enzima en el suero humano tiene un pH óptimo amplio (5 a 7) utilizando biotinil p-aminobenzoato como sustrato y un pH ligeramente desplazado óptimo (4 a 6) cuando es usada biocitina. Dra. María Sofía Giménez 8 Biotinidasa es específica para el resto biotinil de diversos sustratos, sino que escinde en cualquiera de las amidas o éster. Se ha demostrado que biotinidasa de suero normal tiene al menos nueve isoformas. La enzima purificada contiene las nueve isoformas. El suero de un paciente con deficiencia de biotinidasa profunda carecía de todas las proteínas que reaccionan con el anticuerpo, lo que indica que todas las proteínas detectadas son isoformas de biotinidasa. La isoforma patrón en el plasma normal es la misma que en el suero. Biotinidasa del suero humano normal electroforéticamente muestra una banda única de aproximadamente 76,5 kDa sobre el gel de sulfato de sodio dodecil (SDS)-poliacrilamida, lo que sugiere que las diferencias relativas de masa molecular entre las isoformas son demasiado pequeñas para ser resuelto por este método. El tratamiento de biotinidasa con N-glicanasa resulta en una reducción de la masa molecular relativa, indicando que biotinidasa contiene 20 a 22 por ciento de carbohidratos en masa. Estos restos de carbohidratos están conectados mediante enlaces N-glicosídicos ya que exoglicosidasas escinden específicamente estas uniones. La reducción de la masa molecular relativa de biotinidasa después del tratamiento con neuraminidasa indica que biotinidasa contiene hasta 18 residuos de ácido siálico. La mayor parte de la microheterogeneidad observada en isoelectroenfoque es probablemente debido a diferencias en el grado de sialilación. El aumento de la actividad plasmática de biotinidasa, hasta dos y tres veces de lo normal, se ha observado en el de plasma de individuos con almacenamiento de glucógeno La etiología de este aumento no ha sido determinada. Caracterización molecular del gen de biotinidasa. El gen presenta cuatro exones y tres intrones. El cDNA que codifica para el gen normal de biotinidasa de suero humano ha sido clonado a partir de una biblioteca de hígado humano utilizando oligonucleótidos preparados a partir de las secuencias de aminoácidos de péptidos trípticos de biotinidasa (GenBank UO3274) purificada. El análisis de la secuencia del cDNA da un marco de lectura abierto de 1929 pb en relación con el primer codón ATG y el codón de terminación. Hay 332 pb de la secuencia no traducida. El cDNA codifica para una proteína de 543 residuos de aminoácidos (masa molecular de 56.661 Da), incluyendo 41 aminoácidos de un péptido señal. La expresión de ADNc clonado produce una proteína de aproximadamente 53-kDa, que reacciona con anticuerpos monoclonales preparado contra biotinidasa purificada de suero El gen está organizado en cuatro exones y se extiende por al menos 23 kb. El 5 ¢-región de acompañamiento de los exón 1 contiene un elemento CCAAT, tres secuencias de iniciador, una secuencia octámero, tres metilación sitios de consenso, dos cajas de GC, pero no hay ningún elemento TATA. 600-400 nucleótidos tienen características de una isla CpG El gen de la biotinidasa gen ha sido localizado en el cromosoma 3p25.203 Formas, origen y sitios de acción de biotinidasa. Los estudios preliminares han demostrado que la actividad de biotinidasa de suero se correlaciona positivamente con la concentración de albumina de suero; las concentraciones de albúmina y las actividades de biotinidasa en sueros de pacientes con cirrosis y otras enfermedades hepáticas fueron disminuida .Esto sugiere que la biotinidasa del suero humano se origina principalmente en el hígado. La actividad Dra. María Sofía Giménez 9 sérica de biotinidasa en ratas aumenta con la edad y se correlaciona con el aumento de albumina sérica. El espacio extracelular es el sitio principal de acción de la enzima Biotinidasa en la leche humana es de menor tamaño, tiene una pI más alta, tiene una Ki superior para la biotina, Se especula que biotinidasa en la leche tiene un papel en la absorción intestinal de biotina en la infancia. La deficiencia de biotinidasa Manifestaciones clínicas y anomalías bioquímicas. La edad de inicio de los síntomas varía de una semana a años de edad de 3 y 5,5 meses, respectivamente. La pérdida aguda de la visión, la neuropatía óptica progresiva, y paraparesia espástica se han desarrollado en pacientes de 10 años, que es la edad más frecuente de aparición de síntomas neurológicos como las crisis mioclónicas e hipotonía. Varios de los pacientes mostraron ataxia retraso en el desarrollo y problemas respiratorios, tales como la hiperventilación, apnea. Los síntomas iniciales incluyen la dermatitis seborreica o atópica, la alopecia parcial o total, y conjuntivitis. Muchos individuos afectados mostraron inicialmente una combinación de estos hallazgos neurológicos y cutáneos Patología Los hallazgos post-mortem en los cerebros de tres niños con deficiencia de biotinidasa fueron similares. En el primer caso, a la edad de 3 años en el momento de la muerte, hubo degeneración cerebelosa crónica y la atrofia caracterizada por la ausencia de la capa de células de Purkinje, rarefacción de la capa granular, y la proliferación de la capa de Bergmann . Los pedúnculos cerebelosos y el tallo cerebral fueron normales. Necrosis focal con proliferación vascular y la infiltración caracterizado por los macrófagos de la mielopatía subaguda necrotizante. También se observó meningoencefalitis de todo el sistema nervioso central. En otros casos el examen patológico del cerebro reveló defectos de mielinización, áreas focales de vacuolización y gliosis en la sustancia blanca del cerebro y el cerebelo. Había lesiones esponjosas en la materia blanca del cerebro, mesencéfalo, protuberancia, bulbo raquídeo, y los núcleos del cerebelo. Histológicamente, las lesiones mostraron rarefacción y esponjosidad de neuropilo, el aumento de los pequeños vasos sanguíneos, aumento del tamaño de las células endoteliales, astrocitosis, y la pérdida de los núcleos oligodendrocíticos y vainas de mielina. Los axones de las células nerviosas y órganos se vieron menos afectados, a excepción de una disminución del número de axones en los nervios ópticos y cuerpos mamilares. Defecto enzimático. Diagnóstico En 1983, Wolf y colleagues demostrado que el defecto primario bioquímica en los pacientes con de inicio tardío deficiencia múltiple de carboxilasa fue deficiente actividad de la biotinidasa. La actividad de biotinidasa se ha determinado midiendo la liberación de la biotina de biocitina utilizando varios ensayos microbiológicos y por la liberación de compuestos amino o cromóforos fluorescentes de sustratos biotinilados. La actividad enzimática se determinó utilizando un método en el que p-aminobenzoato liberado de la artificial sustrato N-biotinil p-aminobenzoato se diazota, junto con un derivado de naftol para formar un colorante azoico, y medido colorimetricamente Este ensayo ha sido automatedo. Dra. María Sofía Giménez 10 La liberación de p-aminobenzoato también se puede monitorizar fluorométricamente Otro método fluorométrico se ha desarrollado mide la liberación de 6-aminoquinolina de un sustrato diferente artificial, N-biotinil 6-aminoquinolina. Existen varios métodos de ensayo que han sido desarrollados para utilizar la biocitina, sustrato natural, para medir la actividad de biotinidasa. Otros métodos disponibles incluyen un radioensayo que mide la liberación de [14C] biotina de [14C] biocitina usando separación por cromatografía de intercambio iónico y un ensayo fluorométrico en la que la lisina liberada de biocitina está conjugada con un cromóforo después que la lisina inicialmente en la muestra es eliminada por diálisis. La actividad media biotinidasa medida por el método colorimétrico en el suero de personas sanas normales, niños y adultos fue de 7,1 nmol de p-aminobenzoato por minuto por mililitro, con un rango de 3,5 a 12,0 nmol. La actividad de biotinidasa en el suero de los niños con las características clínicas de inicio tardío de deficiencia múltiple de carboxilasa era deficiente en el intervalo de 0 a 9 por ciento de la actividad normal media. Las actividades en el suero de heterocigotos fueron intermedios entre los de los niños afectados y controles normales. Los extractos de los fibroblastos de los individuos normales tienen muy baja actividad detectable con el método colorimétrico Usando un radioensayo más sensible basado en la liberación de [14C] carboxilo paminobenzoato a partir de N-biotinil p-amino [C 14] benzoato,la actividad de biotinidasa se demostró en los extractos de leucocitos de la sangre y los fibroblastos normales de individuos.Los extractos de leucocitos de sangre periférica y fibroblastos de pacientes con deficiencia de biotinidasa suero se encontró que tenían menos de 1 por ciento de la media de la actividad normal de estas células. Las mutaciones. Se han identificado veintiún mutaciones que causan la deficiencia de biotinidasa profunda sintomática Los dos mutaciones más comunes (C.98: d7i3 y R538C) se encontraron en 31 de los 60 alelos (52 por ciento), mientras que el resto de los alelos se explica por las 19 mutaciones únicas. La mutación más común, C.98: d7i3, se produce en una región del gen que codifica el péptido señal. La segunda mutación más común, R538C, es una mutación sin sentido en un dinucleótido CpG en el exón 4 del gen de la biotinidasa. Esta mutación se encuentra en al menos un alelo de 30 por ciento de niños sintomáticos. La proteína aberrante de biotinidasa no fue detectable en extractos de fibroblastos de un niño que es homocigótico para la mutación R538C La deficiencia de biotinidasa se hereda como un rasgo autosómico recesivo. Actividad de biotinidasa es medible, tanto en el liquido amniótico y cultivo de células del liquido amniótico obtenidas por la amniocentesis en embarazos normales Diagnóstico Se dispone de un método colorimétrico de diagnóstico neonatal para la deficiencia de biotinidasa. La evaluación de la actividad de biotinidasa se hace en las mismas muestras de sangre tomadas en papel de filtro utilizada en el rastreo de la fenilcetonuria. Las muestras con una actividad normal de biotinidasa muestran un color morado característico Dra. María Sofía Giménez 11 después de la incubación con biotinil p-aminobenzoato, mientras que aquellos con poca o ninguna actividad da color color pajizo. Los resultados positivos de detección pueden ser confirmados por un ensayo cuantitativo de la actividad enzimática utilizando muestras adicionales de sangre seca o suero fresco Debido a que la actividad de la enzima en las manchas de sangre es estable durante al menos 18 meses a temperatura ambiente, las tarjetas pueden ser enviadas a un laboratorio de referencia adecuada, sin pérdida de actividad. Tratamiento. Los niños con deficiencia de biotinidasa han sido tratados con éxito con dosis farmacológicas de entre 5 y 20 mg de biotina por día, una dosis determinada empíricamente. Todos los pacientes han mejorado después del tratamiento con Las dosis farmacológicas de biotin.. Las manifestaciones cutáneas por lo general se resuelven rápidamente, y las convulsiones y ataxia por lo general se han detenido. Sin embargo,la pérdida de la audiencia y atrofia óptica parecen ser menos reversibles que los otros síntomas. Dra. María Sofía Giménez 12