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Pregunta 12: consideraciones principales de los oligos al diseñar primers. Mencione al menos 4. Respuesta: Idealmente, el diseño de los primers debe ser llevado a cabo de manera de satisfacer dos cuestiones. En primer lugar, cumplir con el criterio de “especificidad”, es decir, que los primers eviten la amplificación de ARNs provenientes de genes distintos al de interés, que sean capaces de discriminar entre genes homólogos, y que el diseño les permita discriminar posibles contaminaciones remanentes de ADN genómico. En segundo lugar, se debe tomar en consideración el criterio de “eficiencia”, es decir, el diseño debe ser tal que logre la máxima eficiencia de amplificación. Para cumplir con estas cualidades, es deseable que el diseño de primers siga los siguientes lineamientos generales: -Largo: 18-30 bases. -% GC: 40-60%, con especial énfasis en mantener este porcentaje en el extremo 3’ del primer. - T melting: 57-60°C. Esta temperatura debe ser similar entre los primers directos y reversos para un mismo gen, así como también deberá ser similar entre primers de distintos genes que planeen amplificarse en paralelo. - Evitar missmatches, especialmente en el extremo 3’. - Evitar As o Ts en el extremo 3’. - Evitar reducida complejidad de secuencia, ya que esto me disminuye la especificidad. - Evitar diseños que posibiliten la formación de estructuras secundarias en el oligo. - Evitar la formación de dímeros de primers. Esto se logra verificando que no exista una posible hibridación entre los primers hacia el extremo 3’ (como regla general, se estipula que no deben hibridar más de 2 nucleótidos en los últimos 5).
