Download Detección de enterotoxinas estafilocócicas

Intoxicación estafilocócica
Instructor : M.A. Díaz Alday
La intoxicación alimentaria por estafilococo (estafiloenterotoxicosis;
estafiloenterotoxemia) es el nombre de la enfermedad causada por las enterotoxinas
que producen algunas cepas de Staphylococcus aureus.
La presentación de los síntomas en esta enfermedad es usualmente rápida (de 1 a 7
horas después de la ingestión) y en la mayoría de los casos aguda, dependiendo de la
susceptibilidad individual a la toxina, la cantidad de alimento contaminado ingerido y el
estado de salud de la persona afectada. Los síntomas más comunes son náuseas,
vómitos, dolor abdominal y postración. Algunos individuos pueden no mostrar todos los
síntomas asociados con la enfermedad. En los casos más severos puede haber dolor de
cabeza, calambres musculares y cambios transitorios en la presión sanguínea y en la
frecuencia cardíaca. Por lo general el paciente se restablece en un par de días, sin
embargo, en los casos severos esto puede llevar tres y a veces más días. La muerte por
intoxicación estafilocócica es muy rara, aunque algunos casos han ocurrido en ancianos,
niños y personas severamente debilitadas.
Los alimentos más
frecuentemente
implicados en la
intoxicación
estafilocócica son
principalmente los
proteicos (carne,
pollo, pescado,
lácteos, cremas y
natas de pastelería) y
en particular:
alimentos cocinados
que se recontaminan
posteriormente (se
ha eliminado la flora
competitiva y se
produce
contaminación postcocinado), alimentos
de Aw reducida por
adición de azúcar o
sal (cremas y natas),
productos cárnicos
curados tratados
térmicamente (jamón
cocido) y embutidos
crudos fermentados.
S. aureus está presente en el aire, polvo, agua, leche, superficies y utensilios de
trabajo de industrias alimentarias y cocinas, hombre y animales. El hombre y los
animales son el reservorio primario de este microorganismo. Los estafilococos están
presentes en las fosas nasales, garganta, piel y pelo del 50% o más de los individuos
sanos. Esta incidencia es aún mayor en aquellas personas que están en contacto con
individuos enfermos o con ambientes hospitalarios. La principal fuente de
contaminación de los alimentos son los manipuladores aunque en algunos casos
también se produce contaminación a partir del equipo.
No todas las cepas de S. aureus son capaces de producir la intoxicación estafilocócica.
Solo las cepas que producen una enterotoxina y que se conocen como S. aureus
enterotoxigénico.
La intoxicación se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado
S. aureus enterotoxigénico y ha producido toxinas en el propio alimento. Es necesario
que S. aureus enterotoxigénico se encuentre en niveles de al menos 10 6 /g para que se
produzca suficiente cantidad de toxina para provocar síntomas en el consumidor.
Estas cifras de 106 /g se alcanzan con facilidad si los alimentos una vez elaborados no
se mantienen a temperaturas adecuadas (o refrigeración o por encima de 60ºC) o bien
si se almacenan durante demasiado tiempo.
Enterotoxinas estafilocócicas
Staphylococcus aureus es una bacteria esférica (coco) que cuando se la observa
en el microscopio aparece en pares, cadenas cortas y en racimos. Estos
microorganismos son Gram-positivos. Algunas cepas son capaces de producir
unas toxinas termoestables capaces de causar la intoxicación estafilocócica.
Cuando estas enterotoxinas estafilocócicas son ingeridas por el hombre, aparecen
bruscamente náuseas, vómitos, malestar general, diarreas y en casos graves
postración, calambres y shock por caída brusca de la presión arterial. Los sitios
receptores eméticos para las toxinas que provocan esta intoxicación son las
vísceras abdominales, donde el estímulo sensorial llega al centro del vómito por
las vías aferentes parasimpáticas (vagales) y simpáticas.
Las intoxicaciones alimentarias producidas por las enterotoxinas
estafilocócicas constituyen un problema mundial y guardan
estrecha relación con los hábitos alimentarios regionales. La
ingestión de una dosis de menos de 1.0 microgramo de
enterotoxina en un alimento contaminado produce los síntomas
de la enfermedad.
Las enterotoxinas son proteínas de cadena simple no ramificada
compuestas por cantidades relativamente grandes de lisina,
tirosina, ácido aspártico y ácido glutámico. Los pesos moleculares
oscilan entre 28 000 y 35 000 daltons, son solubles en agua y
presentan una alta termoestabilidad.
Las enterotoxinas estafilocócicas son producidas por cepas muy
específicas; sin embargo, una de ellas es capaz de sintetizar más
de un serotipo de enterotoxinas. Actualmente se diferencian por
su actividad serológica no menos de 7 enterotoxinas que se
designan A, B, C1, C2, C3, D y E. La enterotoxina del serotipo A
es la que con más frecuencia aparece en los brotes de
intoxicación alimentaria y le siguen en orden decreciente las de
los serotipos C1, B, D y E.
Detección de enterotoxinas estafilocócicas
Los alimentos contaminados suelen tener altos niveles de estafilococos
enterotoxigénicos (106 UFC/g). Los alimentos involucrados deben ser análizados para
ver si el estafilococo está presente. La presencia de un número importante de
estafilococos en el alimento permite sospechar que la toxina está presente.
La prueba más concluyente es la detección de la toxina en las muestras de los
alimentos sospechosos. Se han desarrollado y utilizado con éxito en el diagnóstico de
la enfermedad varios métodos serológicos para determinar la entero-toxigenicidad de
S. aureus aislado de los alimentos, así como métodos para separar y detectar la
toxina. Para detectar residuos de la enterotoxina estafilocócica en los alimentos
supuestamente implicados en un brote de la enfermedad, la toxina debe ser separada
y concentrada antes de procederse a la identificación con el antisuero (antienterotoxina). Se han desarrollado métodos rápidos basados en anticuerpos
monoclonales (i.e., ELISA, Reverse Passive Latex Agglutination), que permiten
detectar detectar aproximadamente 1.0 nanogramo de toxina por gramo de alimento.
Uno de estos métodos es el 'Transia Plate SET'. Es un kit para la detección de
enterotoxinas totales (SETs) de Staphylococcus aureus en alimentos y sobrenadantes
de cultivos de la casa comercial Diffchamb S.A, validado por AENOR. Está basado en
un enzimoinmunoensayo (ELISA) tipo sandwich en microplaca. Es un test cualitativo y
el limite de detección de enterotoxinas totales (A, B, C1, C2, C3, D y E) es de 0.25 a
1.0 ng/g en función del tipo de alimento.
Supuesto práctico (basado en un caso real)
Durante la tarde del mismo día, 1.364 niños de 16 escuelas de Texas
presentaron infección estafilocócica (sobre un total de 5.824 que habían comido
en esas 16 escuelas). Los alimentos habían sido preparados en una cocina
central y transportados en camiones. Los estudios revelaron que el 95% de los
niños que enfermaron habían comido una ensalada de pollo. El día previo al
almuerzo los pollos congelados habían sido hervidos durante 3 horas. Después
de cocidos los pollos se deshuesaron, se enfriaron a temperatura ambiente con
aire forzado, se cortaron en pequeños trozos, se colocaron en bandejas de
aluminio de 30 cm de profundidad y se almacenaron durante la noche en un
"túnel de refrigeración" entre 5ºC y 7ºC. A la mañana siguiente se agregaron y
mezclaron los demás ingredientes de la ensalada . La comida se colocó en
contenedores térmicos y se transportó a las distintas escuelas entre las 9:30 AM
y las 10:30 AM, donde se mantuvo a temperatura ambiente hasta el momento
de ser servidos entre las 11:30 AM y el mediodía. El examen microbiológico de
la ensalada reveló la presencia de gran número de Staphylococcus aureus.
La contaminación de los pollos ocurrió probablemente durante el deshuesado. El
pollo no se enfrió lo suficientemente rápido debido a que estaba en bandejas de
30 cm de profundidad. La multiplicación de los estafilococos probablemente
ocurrió tambien cuando estuvo a temperatura ambiente previo al consumo. La
prevención de este incidente hubiera implicado la separación de los portadores
del estafilococo en la fase de deshuesado, un enfriado más rápido del pollo y
una adecuada cadena de frío entre el momento de la preparación y el consumo.
Se recogieron muestras de todos los tipos de alimentos servidos en aquella
comida para la extracción acuosa de las posibles enterotoxinas y se efectuaron
cultivos en busca de colonias de Staphylococcus aureus
1.-Análisis realizados
De cada uno de los alimentos
se hicieron dos tipos de
análisis
a) Recuento de S.aureus .
Prueba de enterotoxina a
colonias sopechosas
a.1) Recuento de S.aureus y
asislamiento de colonias.
a.2)Prueba de la enterotoxina
a las colonias sospechosas
aisladas (sirve para
comprobar si estas colonias
son capaces de producir
enterotoxina)
b) Prueba de la enterotoxina
a cada uno de los alimentos.
Sirve para comprobar si cada
uno de los alimentos contiene
enterotoxina
2.- Recuento de estafilococos: Método y resultados
obtenidos
a.1) Recuento de S.aureus: Se hizo por el procedimiento más habitual que consiste en
hacer diluciones decimales del alimento en agua de peptona y sembrar alícuotas de
estas diluciones en placas de agar Baird Parker. Estas placas se incuban a 37ºC
durante 24-48 horas. Pasado el tiempo de incubación se contaron y asilaron las
colonias sospechosas (negras, convexas, con brillo metálico y dos halos) .
Los recuentos dieron los siguientes resultados
Tipo de
alimento
Recuento
estafilococos
/g
Ensalada de
pollo
1,7 * 106
Macarrones
2,6 * 107
Hamburguesa
2 * 102
Tarta de
chocolate
7,3 * 102
Helado
Negativo
<100/g
a.2)Prueba de la enterotoxina a las colonias
sospechosas aisladas
Las colonias de S. aureus aisladas en Baird Parker se
subcultivaron en 10ml de caldo de cultivo 24h a
37ºC, posteriormente se centrifugaron a 3000g *
10min y el sobrenadante se recogió para detectar la
posible presencia de enterotoxinas.
b) Prueba de la enterotoxina a cada uno de los
alimentos.
Las muestras de los alimentos se mezclaron con
tampón de extracción. La mezcla se centrifugó a
3000g * 10min y el sobrenadante se recogió para
detectar la posible presencia de enterotoxinas.
Los sobrenadantes tanto de los extractos de los
alimentos como los sobrenadantes de los cultivos de
las colonias seleccionadas fueron denominados de
manera abreviada de la siguiente manera :
Tipo de
alimento
Sobrenadantes
homogeneizados
Extractos
acuosos
Sobrenadantes
cultivos
Colonias de S.
aureus
seleccionadas
Ensalada de
pollo
Ext-1
A-1, A-2, A-3, A4, A-5, A-6, A-7,
A-8, A-9
Macarrones
Ext-2
B-1, B-2, B-3, B4
Hamburguesa
Ext-3
C-1, C-2
Tarta de
chocolate
Ext-4
D-1, D-2, D-3
Helado
Ext-5
4.- Preparación de los sobrenadantes
1) Tomar una
alicuota del
sobrenadante y
filtrarla a través de
una membrana de
0.2 mm de poro.
2) El sobrenadante
filtrado se diluye y de
le añade suero
descomplementado
de conejo.
5.- Determinación de Enterotoxina: ELISA
A. Material y reactivos








Microplaca de 96 pocillos
rompibles (12 tiras x 8 pocillos )
recubiertos con anticuerpos antienterotoxinas.
Tampón de lavado
Mezcla de congugados antienterotoxinas-peroxidasa
Sustrato: peróxido de urea
Cromógeno: trimetilbenzidina
Solución Stop: ácido sulfúrico.
Control positivo: enterotoxinas
totales (tóxico)
2 Controles negativos: medio de
cultivo + suero
descomplementado de conejo.
B. Preparación de las placas
1) Cargar la microplaca
(recubierta de anticuerpos
específicos contra las enterotoxinas
totales de S. aureus) con 100 µl de
:












Pocillos A1 a A9 con
sobrenadantes de las
colonias de Ensalada de
pollo
Pocillos B1 a B4 con
sobrenadantes de las
colonias de Macarrones
Pocillos C1 y C2 con
sobrenadantes de las
colonias de Hamburguesa
Pocillos D1 a D3 con
sobrenadantes de las
colonias de Tarta chocolate
Pocillo F1 con sobrenadante
de homogeneizado de
Ensalada de pollo
Pocillo F2 con sobrenadante
de homogeneizado de
Ensalada de pollo
Pocillo F3 con sobrenadante
de homogeneizado de
Ensalada de pollo
Pocillo F4 con sobrenadante
de homogeneizado de
Ensalada de pollo
Pocillo F5 con sobrenadante
de homogeneizado de
Ensalada de pollo
Pocillo H10 con Control
positivo 1
Pocillo H11 con Control
negativo
Pocillo H12 con Control
positivo2
.
2) Cubrir la microplaca con la
placa
C. Incubación
1) Primera incubación. Incubar
la placa a 18-25ºC durante 30'
con agitación (600 rpm) para
permitir la unión de las
enteroxinas a los anticuerpos
fijados en los pocillos
2) Lavado. Situar la placa en la
lavadora de placas y lavar los
pocillos 5 veces con solución
tampón de lavado
3) Adición de Ac marcados.
Añadir 100 µl de los anticuerpos
anti-enterotoxinas conjugados
con la enzima peroxidasa en
todos los pocillos
4) Segunda incubación.
Incubar la placa a 18-25ºC
durante 30' en cámara húmeda
para permitir la unión del
conjugado a las enterotoxinas
previamente fijadas a los
anticuerpos de los pocillos.
5) Enzima y tercera
incubación. Lavar la placa como
antes (etapa 2). Añadir a todos
los pocillos 100 µl del substrato
(peróxido de urea) / cromógeno
(trimetilbenzidina). Incubar la
placa a 18-25ºC durante otros 30
minutos para permitir que el
enzima actue sobre el sustrato
originando un compuesto
coloreado.
6) Parar la reacción añadiendo 50
µl de la solución stop (ácido
sulfúrico).
D. Lectura en Lector de Placas
12) Ponga las placas en el lector
para su lectura.
(espere hasta que el lector haya
leído todos los pocillos, haya
medido las densidades ópticas de
las reacciones en cada pocillo y
haya imprimido estas cifras en la
impresora incorporada)
6.- Resultados ELISA

Medir la absorbancia de los pocillos. Debe cumplirse que las absorbancias de los
controles positivo y negativo entén dentro de los rangos siguientes:



Absorbancia Control NEGATIVO < 0.30
Absorbancia Control POSITIVO > 0.50
Si las validaciones se cumplen comparar la absorbancia de las muestras (AbsX)
con la del control positivo:

Si AbsX > Abs control negativo + 0.10 LA MUESTRA ES POSITIVA
Los resultados positivos (mayores que los controles negativos
con un margen de ~0.1) se muestran en rojo.
6.- Interpretación de resultados y contestación preguntas
1º. Para interpretar los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en
los radiobotones de la opción correcta
2º. En el resumen comente brevemente el porqué de la respuesta dada a la pregunta 5
1.- No se ha detectado la presencia de enterotoxinas en:
a) En las colonias de los 4 alimentos estudiados
b) Ni en los extractos ni en las colonias de los macarrones, tarta de chocolate y
hamburguesas
c) En los extractos de los 5 alimentos estudiados
2.-Se ha detectado la presencia de enterotoxinas en:
a) En los extractos de las hamburguesas
b) En los extractos y en las colonias de la ensalada de pollo
c) En todos los extractos de los 5 alimentos estudiados
3.- La presencia de una colonia de Staphylococcus aureus no productora de
enterotoxinas en 4 de los alimentos investigados significa:
a) un fallo en la lectura e interpretación del test ELISA ya que todos los S.aureus
que contaminan los alimentos suelen ser enterotoxigénicos
b) que producen enterotoxinas pero en cantidades muy elevadas que escapan al
límite de detección de este método
c) Una contaminación de estos alimentos por cepas de S.aureus no
enterotoxigénicas
4.- El recuento en placas de Baird Parker de 2,6x107 UFC/g en la muestra de
macarrones y el resultado negativo en la prueba de la enterotoxina para estas cepas
indica:
a) que este alimento es sin duda causante del brote puesto que es el que tiene un
recuento más alto
b) que hubo una contaminación y posterior multiplicación de estafilococos
enterotoxigénicos
c) que hubo una contaminación y posterior multiplicación de estafilococos no
enterotoxigénicos
5.- Se identifica como alimento causante de la epidemia :
a) Tanto a la ensalada de pollo como a las hamburguesas por contener cepas
productoras de enterotoxina
b) Solamente a las hamburguesas por contener cepas productoras de
enterotoxinas y recuentos de estafilococos bajos
c) Solamente a la ensalada de pollo por contener cepas productoras de
enterotoxinas y recuentos de estafilococos altos (superiores a 10 6)