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Aislamiento de microorganismos Gram negativos y cocos Gram positivos.
Dado que un cultivo puro es aquél en el cual todos los microorganismos tienen las mismas características, la forma
más segura y fácil de obtenerlo es aislando una “clona”, es decir una población proveniente de un solo individuo.
Para ello los microorganismos deben separarse lo suficiente como para que al reproducirse, los descendientes de
cada uno se mantengan separados de los otros microorganismos; para lo cual utilizaremos la técnica de cuadrante
radial en medios de cultivo selectivos para aislar un microorganismo Gram (-) y cocos Gram (+).
Medio utilizado para toda la mesa:
Caldo para Gramnegativas.- Caldo peptona base con glucosa y manitol. El citrato de sodio y desoxicolato de sodio
actúan como agentes inhibidores, es un medio líquido para patógenos entéricos.
Cómo sólo se obtendrán microorganismos patógenos Gram (-) en una población mixta a partir del caldo para Gram
(-), queremos aislar microorganismos de la familia Enterobacteriaceae sp, los cuales son bacilos capaces de
desarrollarse en medios de cultivo como
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Agar ENDO.- Medio selectivo y diferencial. Agar 15.0g, Fucsina básica 0.5g, Fosfato dipotásico 3.5g, Lactosa
10.0g, Peptona de carne 10.0g, Sulfito de sodio 2.5g, pH=7.4. Las peptonas proporcionan los nutrientes para
el desarrollo de los microorganismos. La lactosa es el carbohidrato fermentable. El fosfato dipotásico actúa
como buffer. La selectividad del agar ENDO resulta de sodio-fucsina básica que inhibe a las bacterias Gram
(+). Los coniformes fermentan la lactosa, formando aldehído y ácido.
Agar Mac Conkey.- Medio selectivo y diferencial. Composición: peptona 17g, peptona proteasa 3g, lactosa
10g, sales biliares núm. 3 1.5g, NaCl 5g, Agar 13.5g, Rojo neutro 0.03g, Violeta cristal 0.001g, pH= 7.1. La
fermentación de la lactosa da un cambio de color del rojo neutro a rosa purpúreo: identificación de
bacterias lactosa (+) de las no fermentadoras. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de
gérmenes Gram (+)
Para el aislamiento de cocos Gram (+)
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Agar Columbia colistina-ácido nalidíxico (CNA).- Agar base Columbia con 10 mg de colistina/1, 15 mg de
ácido nalidíxico/1 y 5% de sangre de oveja.
Este medio combina las virtudes de la peptona, la tripteína, el extracto de levadura y el extracto de corazón,
que favorecen el desarrollo de microorganismos exigentes y la obtención de colonias eugónicas.
Puede ser utilizado como medio base para ser suplementado con sangre o con antimicrobianos, lográndose
así un medio más enriquecido o selectivo de acuerdo al aditivo.
Se agregan 10 mg de colistina y 15 mg de ácido nalidíxico por litro de medio de cultivo para aislar
microorganismos Gram positivos en forma selectiva, y se espera obtener streptococos ya que éstos se
desarrollan en los medios estándar que contienen sangre y sus derivados.
COLISTINA:
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La colistina sulfato es un antibiótico polipeptídico (ciclopéptido) con acción bactericida y que actúa como un
surfactante (se trata de un detergente de tipo catiónico) con propiedades anfipáticas (contiene restos
lipofílicos y lipofóbicos).
MECANISMO DE ACCIÓN
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Penetra en la membrana celular bacteriana, provocando cambios en su permeabilidad, como consecuencia
de su interacción con el componente fosfolípidico. Todo ello se traduce en una alteración de la barrera
osmótica, haciéndose la bacteria susceptible al entorno químico y facilitando su lisis definitiva.
ESPECTRO DE ACCIÓN
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El espectro de acción de la colistina abarca exclusivamente las bacterias Gram-negativas: Escherichia coli y
Salmonella.
Dentro del grupo de las bacterias Gram-negativas son resistentes a la colistina la mayoría de especies de los
géneros Proteus, Serratia y Providencia.
Las bacterias Gram-positivas presentan resistencia a este antibiótico debido a la dificultad del fármaco para
atravesar su pared celular.
ÁCIDO NALIDÍXICO

El ácido nalidíxico es un antibiótico del grupo de las quinolonas, activa en contra de Gram negativas. A
concentraciones menores actúa como bacteriostático, es decir, inhibe el crecimiento y reproducción
bacteriana, sin matar el organismo
MECANISMO DE ACCIÓN

El ácido nalidíxico selectiva y reversiblemente bloquea la replicación del ADN bacteriano, por medio de la
inhibición de una subunidad de la enzima girasa del ADN induciendo la formación de un complejo
enzimático ineficaz. Sus acciones también pueden causar que el empaquetamiento ultratorcional del ADN
se vea relajado, causando inestabilidad en las moléculas genéticas.
Método
1.
2.
3.
4.
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Sembrar una asada de la muestra en el medio selectivo (siembra por cuadrante radial)
Hacer una estría muy cerrada, en una parte para “descargar” el asa
Esterilizar el asa y continuar las estrías pero tomando muestra, únicamente de la zona de la descarga
Incubar las placas vertidas a la temperatura óptima del microorganismo que se desea aislar. En general se
recomienda:
Bacterias de fácil crecimiento: en aerobiosis, a 35-37 º C durante 18 a 24 horas.
Bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales: en atmósfera con 5 % de CO2, a 35-37 ºC durante 2448 horas.
Bacterias anaerobias: en anaerobiosis, a 35-37 º C durante 24-48 horas.
Al someter una mezcla de microorganismos a un método de aislamiento, no garantiza que éste se logre por lo que
es necesario verificar cuidadosamente si se ha obtenido un cultivo puro, antes de conservarlo como tal para su
utilización posterior. Para ello, es necesario hacer “pruebas de pureza” después del aislamiento. Primero se
observan las características de cultivo, para localizar las colonias suficientemente separadas, y con características
bien definidas para suponer que están puras. A partir de estas colonias, se hace una observación microscópica, con
tinción de Gram para verificar que sólo haya un tipo de microorganismo; en ese caso se consideran colonias puras y,
a partir de la colonia que fue verificada, se hacen las resiembras para conservar la cepa. Si las colonias examinadas
no están puras, es decir, si no se logró aislar, se repite el proceso a partir de la colonia con menor cantidad de
contaminantes.
Para conservar las cepas, se re siembran en –por lo menos- 2 tubos con medio de cultivo selectivo; uno de los tubos
se utiliza como cepa de trabajo, en tanto que el otro permanece como reserva. Los cultivos se almacenan
generalmente en refrigeración y se re siembran periódicamente, según el microorganismo de que se trate.
Dependiendo el material que se nos proporcione en el laboratorio de microbiología podemos utilizar los medios de
cultivo para la conservación de nuestro microorganismo aislado:
•Medio sólido en caja a 4ºC (hasta 1 semana).
•Medio de agar inclinado 4ºC (hasta 2 semanas) con sello de glicerol estéril a 4ºC (varios meses dependiendo del
microorganismo).
•Medio fluido de tioglicolato con carne molida con sello de aceite mineral estéril a temperatura ambiente (varios
meses dependiendo del microorganismo).
•En la liofilización también se emplea la leche descremada (años).
A partir de la
muestra en Agar
TSA
Técnica por
cuadrante radial con
asa bacteriológica
Gram (+):
Inoculación en caja
petri con Agar
Columbia
Inoculación con asa
bacteriológica en
Caldo para gram
negativas
Incubación a 37°C
por 48 hrs
Gram (-): Inoculación
en caja petri con
Agar ENDO o Agar
Mac Conkey
Tinción de Gram a
partir de una colonia
aislada
Incubación 37° C
durante 48 hrs
Inoculación en agar
inclinado con sello
de glicerol esteril a 4
°C
Tinción de Gram a
partir de una colonia
aislada
Inoculación en agar
inclinado con sello
de glicerol esteril a 4
°C
BIbliografia
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