Download 2016-TP 3.2 Analisis de Actividad LacZ

Genética 2016
Trabajo Práctico 3.2
Regulación de la expresión
Procariontes: el operón lactosa.
génica
en
INTRODUCCION
Los experimentos de este trabajo práctico pretenden ilustrar dos procesos genéticos
característicos de los organismos procariotas, la transformación bacteriana, como ejemplo
de un mecanismo de intercambio de información genética del operón lactosa en
Escherichia coli. Mediremos la inducción de la expresión de la enzima ß-galactosidasa
codificada por el gen lacZ del operón lac bajo distintas condiciones experimentales.
La enzima en cuestión cataliza la ruptura de la lactosa de la siguiente forma:
Lactosa ---------> Galactosa + Glucosa
Las enzimas del operón lac son inducidas por la presencia de lactosa en el medio de
cultivo. Las bacterias que crecen en un medio sin lactosa no sintetizan ß-galactosidasa,
pero si se agrega lactosa al medio en pocos minutos el operón es activado y el cultivo
puede crecer a expensas de la lactosa agregada.
En una segunda etapa analizaremos también si otros azucares como la glucosa o la
sacarosa son capaces de inducir al operón. Asimismo, ensayaremos la capacidad de
inducción de compuestos análogos de la lactosa, no metabolizables, como el isopropil-ßtiogalactosido (IPTG).
CRONOGRAMA DEL TRABAJO PRÁCTICO
PARTE1: Preparación de una cepa bacteriana que exprese el operón lac. Se utilizará una
cepa bacteriana desprovista del gen lacZ. Mediante el proceso de transformación
bacteriana se introducirá un plásmido portador del gen faltante, restableciéndose así la
expresión del operón lac en las células transformadas. Aprendizaje de las técnicas
elementales de manejo de cultivos bacterianos.
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PARTE 2: Crecimiento e inducción de bacterias para el análisis de expresión de lacZ.
Toma de muestras para medición de actividad de β-galactosidasa.
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PARTE1:
Preparación de bacterias portadoras del operón lac
Transformación bacteriana
Objetivos:
1. Realizar la ligación del fragmento que contiene al gen β-galactosidasa.
2. Aplicar el método de transformación bacteriana con la mezcla de ligación utilizando
bacterias competentes obtenidas por el tratamiento con cloruro de calcio (Cl2Ca).
3. Detectar los clones recombinantes por medio de resistencia a antibióticos.
La transformación bacteriana es una técnica básica de laboratorio de biología molecular. El
fundamento de la técnica aprovecha la función natural de los plásmidos de servir como vectores
de información genética para la supervivencia de las bacterias. Siendo el ADN una molécula
hidrofílica, no penetra normalmente la membrana celular. Para que la bacteria pueda tomar el
plásmido, deben tener primero un estado de competencia, que consiste en formar poros en la
membrana celular mediante tratamientos físicos o químico para permitir esta transformación. En
nuestra practica se realizara utilizando cloruro de calcio.
El objetivo de introducir un plásmido recombinante dentro de las bacterias es utilizar la
maquinaria replicativa de esa bacteria para obtener grandes cantidades del ADN introducido.
Procedimiento general del trabajo practico (detallado más adelante):
1. Preparación de bacterias competentes mediante tratamiento con Cl2Ca.
2. Introducción del plásmido recombinante a las células competentes mediante shock
térmico.
3. Recuperación de las células transformadas por incubación a 37°C.
4. Siembra en una placa de los transformantes e incubación en placa selectiva (con y
sin antibiótico, en este caso será ampicilina), durante toda la noche.
5. Búsqueda de clones recombinantes.
Materiales necesarios
Cepa bacteriana utilizada: Escherichia coli topo
Medio LB
Bloque de hielo
Baño térmico a 42°C
Placas con medio LB + agar con ATB y sin ATB
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ESTRUCTURA GENETICA DEL SISTEMA
1- CEPA BACTERIANA (tiene una deleción que inactiva el gen lacZ)
lacI
P
O
β-lacZ
lacY
lacA
2- PLASMIDO (produce β-galactosidasa activa, aun sin ser una proteína completa)
P
O
lacZ
Al introducir plásmidos en las bacterias: ¿cómo funcionaría el sistema? ¿Esperarías ver
actividad de β-galactosidasa inducible en bacterias sin el plásmido? Cuando termines el
práctico, dibuja un diagrama con la regulación del sistema.
Transformación de la cepa bacteriana
Para introducir plásmidos (o cualquier otro elemento genético) en bacterias hay que lograr
que las mismas se vuelvan receptoras a elementos genéticos. Esto se hace mediante un
procedimiento de permeabilización que “afloja” la pared bacteriana. Estas bacterias
“sensibilizadas” se denominan bacterias competentes. Luego, mediante estrés térmico, se
induce la entrada del ADN plasmídico a través de la membrana por un mecanismo poco
conocido.
En el trabajo práctico trabajaremos con bacterias ya competentes (el proceso de
preparación lleva más tiempo que la duración del TP) y con bacterias no competentes.
Preparación de bacterias competentes
Este método, adaptado del descrito por Inoue et al (1990), alcanza una eficiencia de hasta
> 109 colonias bacterianas transformadas por cada microgramo de plásmido utilizado. El
procedimiento es el siguiente:
1- Preparar una placa de Petri con la cepa de bacterias deseada a partir de un cultivo de
modo que puedan identificarse colonias individuales. Crecer 12-18 horas a 37oC.
2- Inocular 10 colonias grandes (>2 mm) en 250 ml de medio LB en un Erlenmeyer estéril
de 2 l.
3- Crecer las bacterias hasta que OD600= 0,75
4- Poner el cultivo en hielo por 10 min.
5- Centrifugar las bacterias a 2500 xg por 10 min. a 4oC para separar el medio.
6- Resuspender el precipitado de bacterias en 80 ml de buffer TB frío e incubar en hielo
por 10 min.
7- Repetir la etapa 5.
8- Resuspender el precipitado de bacterias en 20 ml de buffer TB frío.
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9- Agregar dimetilsulfóxido (DMSO) gota a gota agitando con suavidad hasta una
concentración del 7% (1,5 ml para 20 ml)
10- Incubar en hielo por 10 min.
11- Preparar alícuotas de 0,4 ml, congelar en nitrógeno líquido y almacenar hasta su uso
a -70oC.
Transformación
1- Descongelar las bacterias competentes preparadas de acuerdo al protocolo previo.
Esto se hace a temperatura ambiente hasta que estén descongeladas y luego se
las pone inmediatamente en hielo.
2- Poner 100 ng de plásmido (aprox. 2 µl) en un tubo eppendorf y colocar en hielo.
3- Agitar! la suspensión de bacterias competentes. Agregar 25 ul al tubo eppendorf
que contiene el plásmido.
4- Incubar en hielo por 30 minutos.
5- Transferir por 1 minuto a un baño termostatizado a 42oC.
6- Transferir nuevamente a hielo por 5 min y agregar 300 µl de medio de cultivo.
7- Incubar por 30 min. a 37oC, en lo posible con agitación.
Selección de transformantes
El plásmido usado confiere resistencia a ampicilina. Por lo tanto, las bacterias
transformadas podrán seleccionarse en un medio de cultivo conteniendo 100 µg/ml de
ampicilina. Placas de Petri con y sin ampicilina serán sembradas con una alícuota del
cultivo crecido (100 l). En el práctico siguiente se analizaran las colonias formadas.
Soluciones y medios usados
Buffer TB
10 mM PIPES (pH to 6.7)
55 mM MnCl2
15 mM CaCl2
250 mM KCl
Medio de cultivo LB (Luria Bertani), por litro
Bacto triptona
10 g
Bacto Extracto de levadura 5 g
NaCl
10 g
LB agar: el mismo medio pero conteniendo 20 g/l de agar.