Download Tradicionalmente la identificación del complejo M

2015
Instituto Conmemorativo Gorgas
Laboratorio Central de Referencia en Salud Pública
Sección de Micobacteriología
Protocolo para investigación
DIAGNÓSTICO DE FENOTIPO Y GENOTIPO DEL COMPLEJO
Mycobacterium tuberculosis COMO AGENTES CAUSALES DE
TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ. AÑO 2015-16
INVESTIGADORES:
LIC. JUAN C. DOMÍNGUEZ G., LIC. JAIME E. BRAVO, LIC. SAMANTHA ROSAS, LIC.
PEDRO DEL CID. SECCIÓN DE MICOBACTERIOLOGÍA/LCRSP.
COLABORADORES:
DR. AMADOR GOODRIDGE, DR. RICARDO LLEONART, LIC. CAROLINA DE LA GUARDIA, LIC.
DILCIA SAMBRANO. INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Y SERVICIOS DE ALTA
TECNOLOGÍA (INDICASAT-AIP).
La adopción rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor diagnóstico,
tratamiento y prevención de todas las formas de TB se puede acelerar mediante la
investigación operativa específica de país y el traslado de los resultados a las
políticas y la práctica.
TABLA DE CONTENIDO
I.
II.
III.
IV.
a.
b.
b.
c.
d.
1.
2.
3.
4.
V.
ANTECEDENTES _____________________________________________________________
PROBLEMA _________________________________________________________________
JUSTIFICACIÓN _____________________________________________________________
MARCO TEÓRICO____________________________________________________________
3
6
7
8
INTRODUCCION _____________________________________________________________ 8
ETIOLOGÍA _________________________________________________________________ 8
TRANSMISIÓN Y SINTOMATOLOGÍA ____________________________________________ 9
DATOS EPIDEMIOLOGICOS __________________________________________________ 10
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DEL AGENTE __________________________________ 11
Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) _________________ 11
Spoligotyping _____________________________________________________________ 11
Reacción en cadena de la polimerasa de doble elemento repetitivo (DRE-PCR) _________ 12
Número variable de repeticiones en tándem (variable number tandem repeat, VNTR) ____ 12
OBJETIVOS ________________________________________________________________ 13
General ___________________________________________________________________ 13
Específicos _________________________________________________________________ 13
VI.
VII.
VIII.
IX.
METODOLOGÍA ____________________________________________________________
PLAN DE ANÁLISIS __________________________________________________________
REFERENCIAS _____________________________________________________________
ANEXOS ___________________________________________________________________
14
19
20
23
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
3
I. ANTECEDENTES
La tuberculosis (TB) es causada por el complejo Mycobacterium tuberculosis, una bacteria
que casi siempre afecta a los pulmones, y cuya afección es curable y se puede prevenir.
Según informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se calcula que una tercera parte
de la población mundial tiene tuberculosis latente; es decir, están infectadas por el bacilo pero
aún no han enfermado ni pueden transmitir la infección (1).
La tuberculosis afecta principalmente a los adultos jóvenes, es decir, en la edad más
productiva. Pero todos los grupos de edad están en riesgo. Más del 95% de los casos y las
muertes se registran en los países en desarrollo. En algunos países se está produciendo una
disminución considerable de los casos, pero en otros el número de casos están descendiendo
muy lentamente. En Brasil y China, por ejemplo, se cuentan entre los 22 países donde se
observó un descenso sostenido de los casos de tuberculosis en los últimos 20 años (1).
En Panamá los datos recopilados por el Departamento de Epidemiología del Ministerio de
Salud, reporta que a nivel del país las tasas de tuberculosis pulmonar se encuentran alrededor
de 45 casos por cada 100,000 habitantes, según los últimos 12 años. Varios factores
contribuyen al aumento de la tasa de infección, incluyendo el alto agrupamiento y expansión
clonal del Mycobacterium tuberculosis multidrogoresistente en nuestro país (6,22). También,
el retraso en el diagnóstico favorece la aparición de formas complicadas de TB pulmonar y
extrapulmonar en los hospitales panameños. (21)
Al inicio de la década pasada y comienzos de esta década 2000-2011 se muestra una reducción
del orden de 20%, con una tasa para el 2011 de 41.2 casos por cada 100,000 habitantes (2).
Las áreas comarcales presentaron las tasas más altas de tuberculosis según informe 2011 del
Departamento de Epidemiologia del Ministerio de Salud, este comportamiento puede estar
asociado a las condiciones de vida de la población, ya que su población vive en condiciones
de pobreza extrema en un 68.5% (2), seguido por las provincias de Bocas del Toro (95.0),
Colón (67.1) y Panamá (41.7).
En Panamá a través del Programa de Control de la Tuberculosis se está aplicando la estrategia
del tratamiento acortado estrictamente supervisado (TAES) desde el año 2000 donde se
empezaron a incorporar las primeras regiones de salud, completando ya para el año 2005 una
cobertura del 100% del tratamiento supervisado a los pacientes con tuberculosis. Su
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
4
implantación ha permitido considerables avances en la detección y tratamiento de los casos
de tuberculosis.
Anteriormente se ha trabajado estudios epidemiológicos a través de caracterización molecular
por medio de pruebas como DRE-PCR en pacientes con tuberculosis multidrogorresistente
(TB-MDR) (6) y MIRU-VNTR (7) como una herramienta en la eficacia en el tratamiento y
mejorar la estrategia TAES.
En el estudio de Samantha Rosas y colaboradores, los resultados en pacientes TB-MDR
mostraron que 37 de 231 aislados desde 2002 a 2004 (16%) resultaron resistentes a lsoniacida
(INH) y a Rifampicina (RFP) o a más drogas del tratamiento. El 40.5% de los pacientes con
TB-MDR en el estudio presentaron el perfil de resistencia INH, RFP y SM. Por medio de la
caracterización molecular fueron obtenidos 15 diferentes patrones de DRE-PCR agrupados en
6 grupos o clúster de 2-8 bandas en promedio. El 91.8% (34/37) de los aislados fue agrupado
dentro de un clúster, mientras que solo el 12% (3/37) presento patrones únicos. Los patrones
obtenidos por DRE-PCR fueron confirmados por la técnica de referencia 1S6110-RFLP a
excepción del clúster A donde 2 aislado miembros de éste clúster pasaron a formar parte de
un nuevo clúster. Los clúster identificados fueron distribuidos en un 91.8 % en las regiones
de salud de Colon, Chiriquí y Panamá. (6)
Más reciente, en 2014 Dilcia Sambrano y colaboradores han realizado trabajos de
investigación en base a la caracterización molecular del Complejo M. tuberculosis. En este
estudio se determinó una diversidad genética de M. tuberculosis en paciente de consulta
externa en una instalación de salud de la ciudad de Panamá. Un total de 62 aislados de M.
tuberculosis fueron genotificados por la metodología de Unidades repetitivas intercaladas
micobacterianas-número variable de repeticiones en tándem (MIRU-VNTR, siglas en inglés)
y Spoligotyping: 45 de los aislados mostraron genotipos únicos de MIRU-VNTR y 13 de los
aislados fueron agrupados en 4 clúster. 4 aislados mostraron genotipos policlonales de MIRUVNTR. El análisis con Spoligotyping reveló 16 familias de M. tuberculosis incluyendo la
familia de Latinoamericana y Mediterraneo (LAM), Harlem y Beijing. Los resultados
sugieren una amplia diversidad genética de los aislados de M. tuberculosis. (7)
Al concluir dichos estudios se recomienda la realización de estudios de caracterización
molecular con un muestreo más amplio para confirmar la existencia de una cepa que ejerce
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dominio regional en Panamá, la cual es objetivo de este estudio.
5
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
6
II. PROBLEMA
El complejo Mycobacterium tuberculosis está formado por 9 especies: M. tuberculosis, M.
microti, M. africanum, M. bovis, y más recientemente aparecen dentro del grupo M. canetti
(1997), M. caprae (1999), M. pinnipedii (2003), M. mungi (2010) y M. orygis (2012) (3). La
mayoría de las micobacterias de este complejo tienen relación zoonótica, es decir que afectan
tanto a humanos como animales, como es el caso de M. bovis. Y a nivel clínico y diagnóstico
tienen mucha similitud, por lo que la diferenciación de las especies dentro del complejo por
técnicas fenotípicas no es de gran ayuda, por lo que se recurre a la biología molecular como
técnica diagnóstica.
La Tuberculosis se ha convertido en un problema de salud pública importante en Panamá, con
casos de tuberculosis en las áreas comarcales y áreas marginales (condicionadas por la pobreza
y asinamientos), tuberculosis infantil y sobre todo con los aumentos de casos de tuberculosis
resistentes, atribuidos principalmente a prescripciones médicas inadecuadas y al
incumplimiento del tratamiento por parte del paciente; además, de los casos de doble infección
TB/VIH. Esta situación representa un problema socio-económico importante, por el costo de
los medicamentos para la terapia del paciente como así la calidad de vida de los pacientes que
se ve afectada por la enfermedad y por factores secundarios de los medicamentos.
Nuestros laboratorios actualmente realizan diagnósticos fenotípicos (pruebas bioquímicas e
inmunocromatográficas) y moleculares para la identificación del Complejo M. tuberculosis,
pero no así una caracterización genética para la agrupación en clúster o grupos como un apoyo
epidemiológico nos revele el patrón de las cepas circulantes en Panamá, sea estas propias de
la región o importadas.
Es de importancia en salud pública conocer las características genéticas de los casos por
tuberculosis humana, ya que un diagnóstico claro de la especie ayuda abordaje temprano del
paciente, tratamiento más efectivo, y mejorar la calidad de vida.
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7
III. JUSTIFICACIÓN
La utilización reciente de marcadores biológicos para caracterizar aislados de
microorganismos ha facilitado grandemente el estudio de la epidemiologia de un sin número
de enfermedades infecciosas.
Las técnicas moleculares han permitido precisar la distribución de diversas enfermedades
infecciosas dentro de la población, proporcionando la posibilidad de intervenciones más
efectivas para su control. En las últimas décadas, los avances en biología molecular han
demostrado que existen diferencias genotípicas y fenotípicas entre distintas cepas de la
misma especie, constituyéndose así en una herramienta valiosa en epidemiologia.
Diversas pruebas moleculares como secuenciación, electroforesis de campos pulsados,
reacción en cadena de la polimerasa de doble elemento repetitivo (DRE PCR),
spolygotyping, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y otros
nuevos métodos en el mercado han permitido la realización de estudios epidemiológico en
la población con el objetivo de vigilar la migración de cepas de tuberculosis alrededor del
mundo, lo que ha permitido obtener información valiosa en cada caso particular
Siendo Panamá un país de tránsito internacional de gran interés turístico y comercial, es de
gran importancia fortalecer los servicios de salud y sobretodo los datos epidemiológicos
con nuevas herramientas en busca de la prevención y control de enfermedades que pueden
afectar la salud publica tanto nacional como internacional.
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
8
IV. MARCO TEÓRICO
a.
INTRODUCCION
La emergencia de enfermedades ha sido un tema relevante durante los últimos quince años en
medicina humana.
Algunas enfermedades tradicionalmente endémicas pueden, en determinadas circunstancias
aumentar su incidencia. Así ha sucedido con la Tuberculosis (TB), de gran importancia en los
ámbitos de la salud pública y de la sanidad animal. Unos 9 millones de personas desarrollaron
tuberculosis en 2013, 500.000 casos más de lo que se había estimado previamente, según
revela un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS). (1)
La Tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa de distribución mundial, que reviste
gran importancia económica y sanitaria en los países afectados. La tuberculosis en el ser
humano se debe a Mycobacterium tuberculosis, pero también puede ser efecto de otras
micobacterias, como M. bovis, la segunda causa más común de tuberculosis en las personas.
(1)
b.
ETIOLOGÍA
El Complejo Mycobacterium tuberculosis es la denominación dada a un grupo
de micobacterias, conformado por varias especies:
1. Mycobacterium tuberculosis: agente más importante y frecuente de enfermedad en
seres humanos.
2. Mycobacterium bovis: infecta principalmente el ganado bovino, pero también causa
tuberculosis en humanos. Prácticamente es indiferenciable de M. Tuberculosis y
fenotípicamente se distingue de M. Tuberculosis por su resistencia natural a
Pirazinamida, nitrato reductasa negativo y niacina negativa. Clínicamente la
enfermedad es igual a la causada por M. Tuberculosis.
3. Mycobacterium africanum: especie causante de tuberculosis humana en el continente
africano. La enfermedad producida por M. africanum no se diferencia clínicamente de
la causada por M. Tuberculosis.
4. Mycobacterium microtti: los reservorios naturales de esta bacteria son pequeños
roedores, gatos y otros mamíferos domésticos. En humano puede afectar a
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inmunocompetentes o inmucomprometidos, y se le ha atribuido casos de enfermedad
pulmonar, abdominal y meníngea.
5. Mycobacterium caprae: aisladas de cabras con enfermedad tuberculosa diseminada.
Se ha encontrado también en cerdos salvajes y vacas.
6. Mycobacterium pinnipedii: aislado de leones marinos y focas. Se considera a los
pinnipedos como su hospedero natural, pero también produce enfermedad en roedores,
vacas y el humano. La presentación de la enfermedad es diversa, puede afectar un área
o ser diseminada.
7. Mycobacterium canetti: se conoce como la variante lisa del complejo M. Tuberculosis,
bioquímicamente idéntica a M. Tuberculosis. Los casos de tuberculosis producidos
por esta especie son de África, con sintomatología pulmonar.
8. Mycobacterium mungi: descrita en el 2010 en suricatos africanos, aun no se sabe
mucho de su ciclo biológico y manera de transmisión. La enfermedad en estos
animales afecta el tracto respiratorio superior.
9. Mycobacterium orygis: es un agente causal de tuberculosis en oryxes, gacelas,
antílopes de agua, monos rhesus del sur de Asia y los seres humanos. Descrita en el
2012 dos ramas taxonómicas adicionales del árbol filogenético del complejo, son el
bacilo dassie y oryx. Ambos son agentes de tuberculosis en especies animales. (3)
Se considera dentro de este grupo al Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG),
microorganismo a partir del cual se elabora la vacuna BCG o antituberculosa. Clínicamente
indiferenciables, cualquier organismo del Complejo Mycobacterium tuberculosis es causante
de la tuberculosis.
Las micobacterias son microorganismo en forma bacilar que se comporta como aerobio
estricto. Muy resistente al frío, la desecación y la congelación, siendo, por el contrario, muy
sensible al calor, la luz solar y la luz ultravioleta. Su crecimiento requiere oxígeno y depende
del pH del medio. Su multiplicación es muy lenta (14-24 horas) y, ante circunstancias adversas
puede entrar en un estado durmiente.
b.
TRANSMISIÓN Y SINTOMATOLOGÍA
El mecanismo más habitual de transmisión de la tuberculosis es la vía aerógena, sobre todo
con las pequeñas gotas aerosolizadas de 1-5 micras de diámetro que son producidas por el
paciente enfermo en actividades cotidianas como el habla, la risa y, sobre todo la tos; estas
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
10
pequeñas gotas cargadas con pocos bacilos (entre 1 y 5 en cada gotita) son las que llegan al
alvéolo, lugar donde encuentran las condiciones idóneas para su desarrollo. Basta con que una
persona inhale unos pocos bacilos para que dar infectada.
Se calcula que una tercera parte de la población mundial tiene tuberculosis latente; es decir,
esas personas están infectadas por el bacilo pero (aún) no han enfermado ni pueden transmitir
la infección (1). Las personas infectadas con el bacilo tuberculoso tienen a lo largo de la vida
un riesgo de enfermar de tuberculosis de un 10%. Sin embargo, este riesgo es mucho mayor
para las personas cuyo sistema inmunitario está dañado, como ocurre en casos de infección
por el VIH, malnutrición o diabetes, o en quienes consumen tabaco.
Cuando la forma activa de la enfermedad se presenta, los síntomas (tos, fiebre, sudores
nocturnos, pérdida de peso, etcétera) pueden ser leves durante muchos meses. Como resultado
de ello, en ocasiones los pacientes tardan en buscar atención médica y transmiten la bacteria
a otras personas. A lo largo de un año, un enfermo tuberculoso puede infectar a unas 10 a 15
personas por contacto estrecho. Si no reciben el tratamiento adecuado, hasta dos terceras
partes de los enfermos tuberculosos mueren. (4)
La tuberculosis NO se contagia al: darle la mano a alguien, compartir alimentos o bebidas,
tocar la ropa de cama o los inodoros, compartir el cepillo de dientes, besar. (4)
c.
DATOS EPIDEMIOLOGICOS
En Panamá los datos recopilados por el Departamento de Epidemiología, reporta que a nivel
del país las tasas de tuberculosis pulmonar se encuentran alrededor de 45 casos por cada
100,000 habitantes, según los últimos 12 años. Al inicio de la década pasada y comienzos de
esta década 2000-2011 se muestra una reducción del orden de 20%, con una tasa para el 2011
de 41.2 casos por cada 100,000 habitantes. Las provincias más afectadas para el año 2011 son
la comarca de Guna Yala en primer lugar con una tasa de 163,3; seguida en un segundo lugar
por la comarca Ngäbe Bugle con una tasa de 85,3; en tercer lugar la provincia de Bocas del
Toro con una tasa de 95,0 y en un cuarto lugar la provincia de Colón con una tasa de 67,1. (2)
En el caso de las comarcas de Guna Yala y Ngäbe Bugle se presentaron las tasas más elevadas
de todo el país. Este comportamiento puede estar asociado a las condiciones de vida de la
población, ya que su población vive en condiciones de pobreza extrema en un 68.5%. Tener
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11
acceso a la educación, a los servicios de salud, a una fuente de trabajo digno, daría a toda la
población mayor acceso a bienes y servicios sociales lo cual impactaría en la disminución de
los casos de tuberculosis en estas áreas.
d.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DEL AGENTE
Tradicionalmente la identificación del complejo M. tuberculosis se ha basado en el estudio de
métodos fenotípicos. No obstante, en los últimos años se han desarrollado numerosas técnicas
moleculares. (9) Se han desarrollado diversos métodos de tipificación que se basan en el
análisis del grado de similitud y distribución de elementos variables entre los aislamientos, en
el estudio de la presencia o ausencia de determinados fragmentos de ADN y en la comparación
del genoma completo del microorganismo. (10)
Algunos métodos de tipificación molecular de Mycobacterium tuberculosis
1. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (restriction fragment
length polymorphism, RFLP)
Es el método más utilizado y el que se considera de referencia. Se realiza siguiendo un
protocolo estandarizado (11) que analiza la secuencia IS 6110 y es una técnica muy
reproducible y útil para distinguir entre los aislamientos relacionados epidemiológicamente
de los no relacionados, de modo que se ha utilizado como indicador de transmisión reciente.
Se basa en estudiar el número de veces que el fragmento IS 6110 se repite en el genoma de la
micobacteria (generalmente entre 0 y 25 veces). Sin embargo, esta técnica presenta algunas
limitaciones, ya que no puede utilizarse si la micobacteria tiene menos de 6 copias de este
fragmento en su cromosoma. Además, requiere grandes cantidades de ADN (lo que implica
la realización de subcultivos que precisan varias semanas). (10)
2. Spoligotyping
Es un método muy utilizado por su relativa simplicidad y rapidez generalmente como
complemento del anterior. Este método estudia la presencia o ausencia de 43 fragmentos de
ADN, llamados espaciadores. Requiere menos ADN que el RFLP y, al expresarse en forma
de positivo o negativo (de cada espaciador), puede analizarse en un formato digital. Existe
una base de datos internacional con más de 11.000 patrones ("espoligotipos") de aislamientos
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
12
obtenidos en más de 90 países (12). Sin embargo, este método no reemplaza por completo al
RFLP por su menor poder discriminante. (10)
3. Reacción en cadena de la polimerasa de doble elemento repetitivo (DRE-PCR)
El método DRE-PCR se basa en la amplificación por PCR de segmentos localizados entre las
dos secuencias repetitivas del genoma de Mycobacterium tuberculosis: IS6110 y la secuencia
repetitiva rica en GC. Existiendo una variación entre cepa y cepa en la distancia entre los
elementos repetitivos y el número de copias de IS6110 y PGRS, esta variación permite obtener
diferentes tamaños del fragmento de ADN amplificado, permitiendo asi la obtención de un
único patrón de bandas en cepas de Mycobacterium tuberculosis. Es un método rápido de
subtipificacion que se puede realizar a partir de un cultivo primario de Mycobacterium
tuberculosis, teniendo el mismo poder de descriminacion que el RFLP IS6110. (14)
4. Número variable de repeticiones en tándem (variable number tandem repeat, VNTR)
El método se basa en la detección del número de veces que se repiten de forma adyacente
varias secuencias dentro del genoma de la micobacteria. El más utilizado es el mycobacterial
interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat analysis (MIRU-VNTR), que
determina las unidades repetitivas en 12, 15 o 24 loci con un método de reacción en cadena
de la polimerasa. En cada uno de los loci hay de 2 a 8 alelos, lo que da lugar a unos 20 millones
de posibles combinaciones de alelos. El MIRU-VNTR es más discriminante que el
spoligotyping y similar al basado en RFLP-IS 6110. El método de MIRU-VNTR se puede
automatizar y técnicamente es más simple. Además, existe una base de datos internacional
accesible por Internet para poder comparar los hallazgos. (10)
.
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
13
V. OBJETIVOS
General

Evaluar a través de técnicas fenotípicas y genotípicas las cepas aisladas del
Complejo M. tuberculosis en Panamá .
Específicos

Identificar los patrones moleculares de las cepas aisladas del Complejo M.
tuberculosis por la metodología MIRU-VNRT.

Categorizar los patrones moleculares obtenidos de las diferentes cepas
aisladas.

Comparar los clúster de los patrones moleculares con los patrones obtenidos
en estudios anteriores en busca de nexos epidemiológicos.
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
14
VI. METODOLOGÍA
Tipo de Estudio
El proyecto de Investigación es un estudio Prospectivo/Exploratorio.
Universo
Cepas de Complejo M. tuberculosis aisladas de pacientes sintomáticos respiratorios
con baciloscopía positiva de las instalaciones de salud que realizan diagnóstico de
Tuberculosis en Panamá durante el segundo semestre de 2015 y primer semestre 2016.
Muestra
Cepas del Complejo M. tuberculosis aisladas de muestras de esputos con baciloscopía
positiva de pacientes sintomáticos respiratorios mayores de 15 años.
Criterios de Inclusión
Cepas del Complejo M. tuberculosis aisladas de muestras con baciloscopía positiva de
pacientes sintomáticos respiratorios mayores de 15 años.
Criterios de Exclusión
Cepas aisladas de muestras de esputo de pacientes sintomáticos respiratorios menores
de 15 años.
Cepas aisladas de muestras de esputos con baciloscopía negativa.
Toda muestra de paciente con características excluyentes de tuberculosis.
Variables
Procedimientos
El proyecto se basa en la caracterización fenotípica y genotípica de las cepas del Complejo M.
tuberculosis aisladas de muestras pulmonares de pacientes con una sintomatología indicativa
de la enfermedad enviada por los médicos y/o enfermeras a la región de Panamá y Colón a los
laboratorios de la Red de diagnóstico de Tuberculosis incluyendo el LCRSP.
Actualmente el Programa Nacional de Tuberculosis a través de la Red de Laboratorio en el
diagnóstico de la Tuberculosis (Anexo 1), como parte de la “Vigilancia Epidemiológica”,
realiza la prueba de baciloscopía a todo paciente captado sea este por el médico o la enfermera
en las diferentes regiones, y posteriormente esta muestra se envía para realizar cultivo por
Micobacterias, en especial a las muestras cuyas baciloscopía se observa BAAR. Toda muestra
de esputo o cepas aisladas se envían a los diferentes laboratorios de diagnóstico con su
respectivo formulario de Solicitud de Examen por Micobacterias (Anexo 2) donde se deberá
llenar todos los datos pertinentes del paciente y sus antecedentes epidemiológicos.
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
15
Pruebas diagnósticas realizadas por la Red de laboratorios en el diagnóstico de la
Tuberculosis:
Baciloscopía. La tinción de Zeehl-Neelsen o Kinyoun es la prueba de diagnóstico
inicial para detectar la presencia o no de bacilos alcohol ácido resistentes (BARR) en
la muestra de pacientes con tuberculosis infecciosa. La baciloscopía se realiza en todas
las instalaciones de salud con capacidad para realizar la misma, y luego la muestra con
baciloscopía positivo se envía al laboratorio que corresponda a la región para la
realización del cultivo. La muestra se envía en un periodo no mayor a 4 horas si se
mantiene a temperatura ambiente, de lo contrario se almacena a temperatura de
refrigeración (2-8°C) por lo menos dos días para ser procesada.
Cultivo. Las muestras se le realizan cultivo en medio a base de huevo (LowensteinJensen) o medios líquidos para micobacterias (Bact-Alert y MGIT) con el objetivo de
aislar colonias de micobacterias para su identificación. Antes de sembrar las muestras
en los medios de cultivos, son sometidos a procesos de descontaminación (método de
Petroff con Hidróxido de Sodio o métodos comerciales a base de N Acetil Cisteína)
para evitar crecimiento de otras bacterias en el medio. Los medios con muestras son
cultivados en incubadora a temperatura de 37°C por un periodo de 40 días a partir del
día en que son procesados. Estos son observados semanalmente para evidenciar
crecimiento de micobacterias o posible contaminación en el medio. Toda evidencia se
anota en el libro de Registro Diario del laboratorio. De haber crecimiento en los medios
de cultivo, se realiza frotis de las colonias para evidenciar el crecimiento de
micobacterias o si se trata de bacterias contaminantes. De confirmarse crecimiento de
micobacterias, se anota sus características físicas como color, aspecto, y tiempo de
crecimiento.
Tipificación de los aislados de Micobacterias. La tipificación de las cepas aisladas
se realiza a través de pruebas bioquímicas o inmunocromatográficas para el
diagnóstico del Complejo M. tuberculosis. Todas las cepas son referidas al Laboratorio
Central de Referencia en Salud Pública (LCRSP) del Instituto Gorgas para su
confirmación.
Las pruebas Bioquímicas-Enzimáticas son un grupo de pruebas con reacción en base
a su composición enzimática, la cual hace diferenciar un grupo de otro, como las
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
16
pruebas de Niacina, Catalasa y Nitratasa. Y las pruebas inmunocromatográficas basada
en la detección de proteínas o antígenos de superficie de las micobacterias.
Pruebas para la realización del Proyecto
Caracterización molecular del Complejo M. tuberculosis. De tratarse de una cepa
del complejo M. tuberculosis¸ se hará el aislamiento para la extracción de ADN y
realizar prueba de caracterización molecular por metodología MIRU-VNTR.
El método QIAamp DNA Mini Kit será el método usado el cual se puede realizar en
M. tuberculosis aislados en medios sólidos o líquidos (15). Cuando se utiliza cultivos
líquidos, se centrífuga 1 ml durante 15 min a 13.000 rpm y el sedimento se utiliza
como material de partida.
El método utilizado ha sido adecuado para 24 tipos de locus VNTR del complejo M.
tuberculosis (15): el método se ha estandarizado para realizar PCR multiplex de 8
locus y el análisis de los tamaños de los productos de PCR en un secuenciador
automatizado o con PCR de 24 locus individuales y el análisis de los tamaños de los
productos de PCR en geles de agarosa.
Materiales, equipos y reactivos.
a. Baciloscopía

Aplicadores de madera

Recipiente de metal para descarte de material infeccioso

Portaobjetos nuevos y limpios

Lápiz con punta de diamante o acero

Mechero de alcohol o gas

Papel toalla

Lápiz de cera o marcador con tinta indeleble para rotular las muestras
Reactivos

Lysol al 10% o desinfectante a base de fenol o hipoclorito de sodio.

Tinción Zielh- Neelsen o Kinyon.
b. Cultivo y Tipificación

Papel toalla.
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
17

Tubos de medios líquidos para Micobacterias

Tubos de medios Lowenstein Jensen

Tubos de polietileno de 50ml graduados.

Pipetas Pasteur o pipetas de plástico desechables.

Dispensador automático.

Gradillas.

Asas bacteriológicas

Incinerador bacteriológico

Solución desinfectante lysol 10%, hipoclorito de sodio u otra apropiada para
Micobacterias.
Reactivos

Hidróxido de Sodio al 4%.

Hidróxido de Sodio 2%.

Buffer fosfato 6.8

Agua destilada estéril.

Tiras de Niacina

Solución reguladora de Fosfatos M/15

Peróxido de Hidrógeno 30%

Kit de inmunocromatografia
c. Pruebas Moleculares

Microcentrifuga refrigerada para tubos de 1.5ml

Microcentrifuga para tubos de 1.5ml

Puntas para Micropipetas de 0.5ul – 10ul

Puntas para Micropipetas de 10ul – 100ul

Puntas para Micropipetas de 100ul – 11000u

Tubos de 1.5ml libres de RNAasa y DDNAasa

Baño seco a 56ºC
Reactivos

24 juegos de cebadores VNTR.

Kit HotStarTaq ADN polimerasa.
o HotStarTaq ADN polimerasa,
o PCR buffer (10x),
o Q-Solution (5x) y
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
o MgCl (25mm).

dNTP PCR

Alcohol al 70%

Clorox al 10%
Equipos Necesarios.

Microscopio binocular

Cabinas de Bioseguridad Clase II tipo A2

Centrífuga refrigerada

Incubadora 37ºC.

Refrigerador a 4°C

Congelador -20°C y -80ºC

Coagulador de medios sólidos

Balanza Analítica
Equipo de Protección Personal

Batas desechables de laboratorio.

Guantes desechables de nitrilo con polvo y sin polvo

Protectores respiratorios N-95

Protectores visuales.
Agentes Biológicos

Cepa de ATCC de M. tuberculosis H37Rv

Cepas ATCC de otras micobacterias atípicas
18
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
19
VII. PLAN DE ANÁLISIS
Los datos de los pacientes se anotarán en el libro de Baciloscopía y de Registro diario para
cultivo de los laboratorios. Se creará una base de datos en Libro Excel de las muestras que han
clasificado para el análisis y sus respectivos resultados de los cultivos (aislados).
Para el análisis de los datos desde un secuenciador automatizado hay varios programas de
software pero se consideraran;

GeneMapper (Applied Biosystems, Foster City, CA)

GeneMarker (SoftGenetics, PA, EE.UU.)
20
AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
VIII. REFERENCIAS
1
Organización Mundial de la Salud. 2014. Tuberculosis. Nota descriptiva N°104.
2
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para
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identificación
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Técnicas.
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AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
IX. ANEXO
Formulario de Solicitud para Investigación Micobacteriologica
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AGENTES CAUSALES DE TUBERCULOSIS HUMANA EN PANAMÁ
Cronograma de Actividades (Adjunto al documento)
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