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División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Departamento de Biotecnología
Licenciatura
Ingeniería Bioquímica Industrial
MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE
INGENIERÍA ENZIMÁTICA
Dr. Sergio Huerta Ochoa
Depto. Biotecnología
Prólogo del Manual
Introducción:
El manual de prácticas del laboratorio es un apoyo didáctico para la UEA Optativa
Ingeniería Enzimática de la licenciatura de Ingeniería Bioquímica Industrial.
Objetivo:
El objetivo general del laboratorio es que el alumno aplique y asimile los fundamentos
cinéticos de reacciones enzimáticas mediante la determinación de datos experimentales
obtenidos en laboratorios virtuales utilizando el software comercial “Laboratorio de
Enzimas” Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software), y el software “EnzymeLab”, este
último de acceso gratuito para fines didácticos.
Nota: Las prácticas aquí mostradas han sido adaptadas del manual del software
“Laboratorio de Enzimas” Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software) a los
requerimientos de la UEA “Ingeniería Enzimática”
PRÁCTICA No. 1
Determinación de la curva de progreso y la velocidad inicial de una
reacción enzimática
Introducción:
La pepsina y la tripsina son enzimas proteasas, lo que indica que descomponen las
moléculas de las proteínas como parte del proceso digestivo.
La pepsina se encuentra en el estómago. La tripsina es secretada del páncreas al duodeno.
Ambas se liberan en forma de cimógeno inactivo y entran en acción en el estómago y el
lumen del tracto intestinal.
Proteasa
Proteína 

 Péptidos
Objetivo:
Mediante la determinación de la curva de progreso y la velocidad inicial de la reacción de
dos proteasas, que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad inicial de
reacción enzimática y que adquiera un conocimiento cualitativo de cómo la concentración
de enzima y la de substrato afectan a dichas velocidades.
Procedimiento:
La curva de progreso puede obtenerse detectando la cantidad de sustrato que reacciona
durante el tiempo de reacción.
1. Escoja Laboratorio de investigación, haga clic en Restablecer y borre toda la
gráfica.
2. Asegúrese de que los siguientes datos pre-establecidos estén correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidos
Temperatura
pH
Proteína
Tripsina
Péptidos
Ninguno
100
15
0
0
37.0
8.0
Proteína
Pepsina
Péptidos
Ninguno
100
15
0
0
37.0
2.0
3. Haga clic en el botón de inicio y prepárese para activar el botón de pausa cuando el
experimento haya llegado a 12 minutos.
4. Registre las concentraciones de sustrato y producto en la Tabla
5. Empiece un nuevo experimento haciendo clic en Restablecer.
6. Repita los pasos 3-5 para la pepsina
7. Lleve los niveles de sustrato al Gráfico 1 y los de producto al Gráfico 2
Resultados:
Tabla 1
Tiempo
(Segundos)
Tripsina
Concentración de producto
(mM)
Pepsina
Concentración de producto
(mM)
0
30
60
90
120
150
180
Diagrame a continuación los datos de sustrato (Gráfico 1) y producto (Gráfico 2) de la
Tabla 1 para cada una de las proteasas y calcule la velocidad inicial de la reacción,
mediante la determinación de la tangente a la curva de progreso al inicio de la reacción.
Gráfico 1. Curva de progreso
Substrato vs tiempo
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
Gráfico 2. Curva de progreso
Producto vs tiempo
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
PRÁCTICA No. 2
Determinación de los parámetros cinéticos (KM, Vmax y kcat)
Introducción:
Michaelis y Menten en 1913, para explicar la relación observada entre la velocidad inicial y
la concentración inicial de sustrato propusieron que las reacciones catalizadas
enzimáticamente presentan el siguiente mecanismo:
E   S 
k1


k 1
ES  kE   P
cat
En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo
enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre. Este
mecanismo considerando condiciones de equilibrio rápido o estado pseudo-estacionario
conduce a la expresión de velocidad:
v
Vmax S 
K M  S 
Objetivo:
Utilizando el programa EnzymeLab determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) de
una reacción enzimática para que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad
máxima de reacción (Vmax), constante de Michaelis-Menten (KM), y constante catalítica de
una reacción enzimática (kcat).
Procedimiento:
Utilizando el programa EnzymeLab determinar los parámetros cinéticos de la reacción
enzimática de la curva de velocidad de reacción versus concentración de sustrato.
1. En el primer día de trabajo determina la estrategia experimental con base en los
objetivos de la práctica.
2. Elije la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan.
3. Selecciona las condiciones de reacción a utilizar.
4. Continúa obteniendo velocidades iniciales de reacción a diferentes concentraciones
de sustrato.
5. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores de K M y Vmax que
obtiene el programa con regresión no-lineal.
6. Compara los parámetros obtenidos por un método de regresión lineal con los que da
el EnzymeLab utilizando regresión no-lineal.
Resultados:
Tabla 1.
Concentración
de sustrato
(Unidades)
Velocidad
inicial de
reacción
(Unidades)
Diagrame a continuación los datos de la Tabla 1 (Gráfico 1), determine manera gráfica y
con un método de regresión lineal el valor de Vmax y KM.
Grafico 1.
Velocidad de reacción vs concentración de sustrato
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
20
40
60
80
100
PRÁCTICA No. 3
Determinación de la constante de inhibición (KI) de una reacción
enzimática para inhibición competitiva, no-competitiva o mixta
Introducción:
Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes
tales como los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces iónicos.
Las enzimas en una ruta metabólica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de
sus respectivas rutas. La inhibición reversible puede ser descrita cuantitativamente en
términos de la unión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos
en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis-Menten, una
enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES), y este
complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). En la catálisis enzimática
en presencia de un inhibidor (I), este puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las
constantes de disociación KI o KI', respectivamente, afectando la velocidad de la reacción.
Objetivo:
Determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) en presencia y ausencia de un inhibidor,
para que el alumno aplique y asimile los conceptos de inhibición de reacción enzimática,
pueda identificar el tipo de inhibición que se presenta y su constante de inhibición (KI).
Procedimiento:
Utilizando el programa EnzymeLab determina la cinética tipo Michaelis-Menten un
ausencia y presencia de inhibidor para la enzima que elijas determinando la velocidad de
reacción a diferentes concentraciones de sustrato.
1.
2.
3.
Escoja la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan.
En el primer día de trabajo determina la cinética tipo Michaelis-Menten en ausencia del
inhibidor. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores de K M y Vmax
que obtiene el programa con regresión no-lineal.
En el segundo día de trabajo realiza el mismo procedimiento agregando una cierta
concentración de inhibidor y mantenla constante durante los ensayos. Al final del día
'
realiza el análisis cinético y anota los valores de K M' y V max
que obtiene el programa
4.
con regresión no-lineal.
Compara los parámetros obtenidos en ausencia y presencia del inhibidor para
determinar el tipo de inhibidor.
5.
Calcula la(s) constante(s) de inhibición ( K I ).
PRÁCTICA No. 4
Efecto del pH en una reacción enzimática
Introducción:
El pH del medio ocasiona protonación o desprotonación de los aminoácidos del sitio activo
provocando cambios en la tasa de reacción. Cada enzima tiene un pH óptimo, el cual está
entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas.
Objetivo:
Determinar el efecto del pH en la actividad enzimática.
Procedimiento:
Utilizando el programa EnzymeLab determina la cinética tipo Michaelis-Menten al pH
óptimo, posteriormente determina el efecto del pH sobre la velocidad máxima, utiliza el
siguiente procedimiento:
1. Escoge la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan.
2. En el primer día de trabajo determina la cinética tipo Michaelis-Menten al pH que
indica la ficha técnica. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores
de K M y Vmax que obtiene el programa con regresión no-lineal.
3. Calcula la concentración de sustrato a condiciones de saturación, [S] = 25 KM.
4. En el segundo día de trabajo realiza experimentos a una concentración de sustrato
de [S] = 25 KM a diferentes pH iniciales.
5. Registre las velocidades de reacción a diferentes pH.
6. Lleva los datos a un gráfico y con la metodología vista en clase determina los pK’s
más importantes del sitio activo y discuta los resultados observados.
PRÁCTICA No. 5
Efecto de la temperatura en una reacción enzimática
Introducción:
La maltasa (α-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.20) es una enzima que convierte la
maltosa (disacárido) en las dos glucosas de las que está compuesta. Está presente en
intestino delgado, en el borde de cepillo de las vellosidades intestinales. Pertenece a la
familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan de romper los disacáridos
en los monosacáridos que los forman.
Maltosa maltasa
 Glucosa
Objetivo:
Determinar el efecto de la Temperatura en la actividad enzimática.
Procedimiento:
Primero, fijar la concentración de sustrato donde la enzima está en condiciones de
saturación (v ≈ Vmax).
1. Escoja Laboratorio de investigación, haga clic en Restablecer y borre toda la
gráfica.
2. Asegúrese de que los siguientes datos pre-establecidos estén correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidor
Temperatura
pH
Maltosa
Maltasa
Glucosa
Ninguno
100
15
0
0
37
7.0
3. Haga clic en el botón de inicio y deje llevar a cabo la reacción durante 2 minutos
tome la lectura de la velocidad de la reacción.
4. Registre las velocidades de reacción a diferentes Temperaturas en la Tabla 1
5. Lleve los datos al Gráfico 1 y discuta los resultados observados.
6. Determine la energía de activación (Ea) de la enzima.
Resultados:
Registre los datos cinéticos de la velocidad de reacción enzimática a diferentes
temperaturas.
Tabla 1.
Temperatura
(°C)
20
25
30
35
40
45
50
60
70
Velocidad de reacción
(Unidades)
Diagrame a continuación los datos de la Tabla 1 (Gráfico 1)
Gráfico 1.
Velocidad de reacción vs Temperatura
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
30
35
40
Determine la Energía de Activación (Ea).
45
50
55
60