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LABORATORIO CINCO: MICROESTIMULACIÓN RESUMEN En este laboratorio, podrás: 1. aprender a preparar la pata de una cucaracha para hacer microestimulación; 2. probar como diferentes estímulos estimulan actividad en las neuronas motoras; 3. observar la diferencia entre los patrones de espigas sensoriales y motoras; e 4. investigar cómo distintos tipos de estímulos afectan a la generación de potenciales de acción en una pata de cucaracha preparada. OBJETIVOS Antes de realizar esta práctico debes entender: cómo las neuronas se comunican con las células musculares cómo un estímulo eléctrico puede provocar una contracción muscular Después de hacer esta práctico deberás ser capaz de: explicar cómo el sistema nervioso controla el movimiento muscular describir cómo movimientos específicos son provocados por patrones específicos de espigas diseñar un experimento para mapear frecuencias ideales para estimulación MATERIALES SpikerBox con un adaptador de cable de audio Computador con Audacity instalado Cucaracha Agua con hielo o acceso a un congelador Tijeras de disección Mondadientes Electrodos de microestimulación Generador de señal eléctrica (Reproductor de iPhone o MP3) Splitter de 2 salidas (opcional) altavoz externo (opcional) INTRODUCCIÓN Mucho antes que los científicos fueran capaces de registrar espigas, podían estimular el sistema nervioso mediante uso de baterías (botellas de Leyden). Dado que los nervios utilizan electricidad para comunicarse, pueden ser manipulados por ella también. Luigi Galvani, un científico italiano del siglo XVIII, descubrió que al aplicar electricidad a los nervios de las ancas de la rana, sus músculos se contraían. Descubrimientos como este dieron lugar a debates sobre si la "electricidad animal" era diferente de la electricidad producida en las tormentas eléctricas. Galvani también experimentó con esto, colgando ancas de rana en su patio trasero durante tormentas y observando los tirones que daban las ancas. Estos resultados fueron también fuente de inspiración para "Frankenstein", de Mary Shelley: "Quizá podía reanimarse un cadáver; el galvanismo había dado prueba de tales cosas; quizás podía fabricarse las partes componentes de una criatura, ensamblarlas y dotarlas de calor vital" -Mary Shelley, Introducción de Frankenstein Eventualmente, la comunidad científica se puso de acuerdo y descubrió que si bien la electricidad es capaz de estimular el sistema nervioso y el tejido muscular, el tejido en sí genera electricidad. Esto llevó a los inicios de la neurociencia contemporánea, que es lo que estás estudiando hoy. Aprendimos acerca de los potenciales de acción (PA) y las sinapsis neurona-neurona en el Laboratorio Uno, pero las respuestas musculares galvánicas son el resultado de las sinapsis entre las neuronas motoras (NMs) y el músculo esquelético, o uniones neuromusculares. A diferencia de las conexiones convergentes en las células nerviosas centrales, una célula muscular postsináptica está usualmente inervada por una única NM presináptica en una región especializada de la membrana muscular llamada placa terminal. La acetilcolina (ACh) es liberada por el axón terminal de la NM, que derechamente abre canales iónicos de Ca+2 dependientes de voltaje en la membrana muscular, lo que permite la entrada de Ca+2 a la placa terminal con cada potencial de acción. Las neuronas motoras excitan el músculo mediante la apertura de canales iónicos en el extremo de la placa, generando un amplio potencial de placa que activa rápidamente canales de Na+ dependientes de voltaje, y produce un potencial de acción que se propaga a lo largo de la fibra muscular, generando movimiento. En otro famoso experimento en 1870, los científicos y médicos alemanes Eduard Hitzig y Fritsch Gustav aplicaron una corriente eléctrica a la corteza cerebral expuesta (la parte arrugada del cerebro) de un perro, en su propia cocina (sí, en ese tiempo también sonaba extraño) demostrando que la estimulación de partes diferentes del cerebro puede causar diferentes tipos de movimientos. De manera similar, se ha demostrado que la estimulación del cordón nervioso puede producir patrones de actividad rítmicos hacia los músculos de las piernas, denominados generadores centrales de patrones (GCP). Ya en 1911, T. Graham Brown había demostrado que estos patrones de espigas coordinados pueden inducir respuestas musculares básicas como la pisada, sin la necesidad de un comando que baje a través de la corteza. Hoy en día, estas técnicas de “estimulación central/respuesta sensorial motora” son utilizadas especialmente en pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson. Mediante la inserción de un pequeño electrodo, siempre en una parte específica del cerebro conocida como el núcleo subtalámico, es posible disminuir sacudidas y temblores asociados con la enfermedad. Sin embargo, se han descrito efectos secundarios, como una asociación a la adicción al juego y otras conductas compulsivas. Actualmente, algunos grupos de investigación de avanzada están diseñando pequeños chips que estimulan los nervios del ojo como una cura para la ceguera. CONFIGURACIÓN Electrodo de Microestimulación El electrodo de microestimulación actuará como un intermediario entre el generador de señal eléctrica y la cucaracha. El electrodo consistirá de un cable de audio que se conecta al generador de señal como una vía para entregar la estimulación a la cucaracha. Puedes elegir soldar pines al cable de audio, similares a los utilizados en el práctico 1, o utilizar pinzas de cocodrilo que se pueden conectar a los electrodos que vienen con tu SpikerBox. Generador de señales eléctricas (GSE) Existen muchos programas que pueden generar estímulos eléctricos ideales para este práctico. Si estás usando un iPhone o iPad, puedes encontrar las siguientes aplicaciones gratuitas en la tienda de iTunes, siguiendo estos enlaces: AudioSigGen FreqGen Si estás usando un computador, puedes utilizar este software en línea: Rhintech Adicionalmente, puedes simplemente descargar varias frecuencias como archivos MP3 y reproducirlas a través de cualquier reproductor de MP3. Aquí te indicamos un sitio web desde el que puedes descargar en forma gratuita las frecuencias apropiadas para este ejercicio: TestSounds PROCEDIMIENTO Ejercicio 1: Preparación de la pata de cucaracha para microestimulación 1. Prepara una pata de cucaracha, como se describe en el Laboratorio 1. 2. Coloca el electrodo de microestimulación. Si se utiliza el electrodo con pinzas de cocodrilo, conecta las pinzas a los electrodos de registro del SpikerBox insertados en la coxa y el fémur. Si se utiliza un electrodo directo, coloca los electrodos en la coxa y el fémur de tu pata de cucaracha. 3. Conecta el electrodo de microestimulación a un GSE, como un computador o reproductor de MP3. 4. Si eres capaz de hacerlo, programa tu SGE para producir ondas cuadradas. 5. Ajusta tu SGE a 50% de volumen (amplitud) y genera una señal con una frecuencia de 200 Hz (200 repeticiones por segundo). 6. Reproduce el tono y observa la pata de la cucaracha. Si la pata se mueve en respuesta a la estimulación, prosigue al ejercicio 2. Si la pata no se mueve, continúa con el Paso 7. 7. Si la pata no se mueve en respuesta al estímulo, asegúrate de tener el electrodo conectado a la salida de audio y que el tono se está produciendo. Debieras ser capaz de oír un tono de 200 Hz en la mitad del volumen con ALTAVOCES EXTERNOS. Si no escuchas el tono, es posible que necesite ajustar la configuración de audio. 8. Si puedes producir un tono con el GSE, asegúrate a continuación que la pata esté viva y que los electrodos estén en el lugar adecuado. Utilizando el protocolo del práctico 1: ejercicio 1, utiliza los electrodos y altavoces de tu SpikerBox para asegurarte que la pata esté generando espigas. Asegúrate de haber colocado los electrodos en la coxa y el fémur. 9. Asegúrate que la soldadura en los electrodos esté intacta y que los electrodos no se toquen entre sí. Consulta con tu profesor si sigues teniendo problemas para estimular tu pata de cucaracha. Ejercicio 2: Respuesta de NM de cucaracha a amplitud y frecuencia Ahora que tienes un aparato de microestimulación funcional, es el momento de medir las propiedades de frecuencia y amplitud en la respuesta de las neuronas motoras (NMs) de la cucaracha. Esto se logrará simplemente observando la pata mientras es estimulada con una gran variedad de tonos. 1. Empieza a estimular la pata a la frecuencia más baja (20 Hz) y menor volumen (amplitud más baja posible de su dispositivo), y siga como se muestra en la Tabla 1. Ten en cuenta que, si trataras de oír lo que produce tu GSE, no podrías ser capaz de oír un tono de 20 Hz por más que lo intentaras. El rango de audición humano oscila entre 20 Hz y 20.000 Hz (20 kHz), si bien existe variación entre los individuos. CUIDADO: NO USES AUDÍFONOS PARA ESTE EXPERIMENTO SI EL VOLUMEN DE TU GSE ESTÁ POR SOBRE 50%, YA QUE PODRÍAS CAUSAR DAÑO A TU OÍDO. UTILIZA SIEMPRE UN ALTAVOZ EXTERNO. 2. Usando la Tabla 1 como guía, prueba la capacidad de respuesta de la pata a todas las amplitudes de cada frecuencia. Marcar cada prueba con un (+) o (-) para indicar si la pata se movió en respuesta a la estimulación. Si tu GSE no produce las frecuencias que aparecen en la Tabla 1, Utiliza las frecuencias que tengas disponibles y ajusta la Tabla 1 según corresponda. Tabla 1. Respuesta según frecuencia y Amplitud Potencia ¼ ½ Frecuencia mínima Potencia Potencia 20 Hz 40 Hz 80 Hz 150 Hz 200 Hz 1000 Hz 2000 Hz 3000 Hz 5000 Hz 10,000 Hz ¾ Potencia Potencia Máxima Ejercicio 3A: Grabación y patrones de espigas de los ganglios de una cucaracha Nota: Este experimento requiere que una cucaracha sea sacrificada 1. Coloca una cucaracha en agua con hielo o en un congelador. Cuando la esté anestesiada, colócala en tu mesón de laboratorio. 2. Con tijeras de disección, decapita la cucaracha en la unión entre la cabeza y el tórax. Coloca un poco de vaselina en el corte. 3. Inserta el electrodo de registro de tu SpikerBox a través del tórax de la cucaracha en el ganglio metatoráxico. Trata de colocar el electrodo ligeramente a un lado del ganglio. Inserta el electrodo de tierra en el tórax, donde la cabeza solía estar. 4. Conecta tu SpikerBox a tu computador, enciéndelo, y abre Audacity. Comienza la grabación en el ganglio metatoráxico. Ajusta el eje Y de la grabación de modo de maximizar las espigas observadas. Ajuste el eje X (utilizando la herramienta de lupa que aparece en la barra de menú) para poder diferenciar ráfagas directamente relacionadas con los movimientos. 5. Supervisa la grabación durante varios minutos, y toma nota sobre como se corresponden con los movimientos de las patas metatoráxicas. Como las conexiones entre el cordón nervioso ventral (CNV) y las patas metatoráxicas están intactas, los potenciales de acción son capaces de propagarse por las neuronas motoras a los músculos. También debieras ser capaz de observar movimientos espontáneos de la cucaracha. Ten en cuenta que es probable que estés observando tres tipos de información mientras estés grabando desde el ganglio: a) información motora enviada desde el ganglio a los músculos de las patas; b) información sensorial que se envía al CNV desde las piernas; y c) información que se integra y procesa entre los ganglios a lo largo del CNV. Tu objetivo es identificar los patrones de espigas que conducen a movimientos motores. 6. Una vez que te parezca identificar una relación entre movimientos específicos de las patas y patrones específicos de espigas, anota los siguientes datos en la Tabla 2, para cinco eventos diferentes: a) el tiempo de las espigas; b) una descripción del movimiento. 7. Detén la grabación en Audacity y encuentra los patrones de espigas que anotaste en la Tabla 2. Destaca con el mouse y copia (Control-C) la pequeña sección de una serie de espigas. Abre un archivo nuevo de Audacity (Control+N) y pega el segmento de espiga que copiaste (Control-V). Realiza esto para cada uno de los 5 patrones de espigas de la Tabla 2, de modo que ahora tienes 5 nuevas ventanas de Audacity abiertas. 8. Para cada patrón de espiga, amplia la traza en efecto-amplificar en la barra de menú. Haz un boceto simple de cada patrón en la Tabla 2. Guarda cada patrón de espiga para su uso posterior. Tabla 2. Base de datos de patrones de espigas Ejercicio 3B: Estimulación del ganglio metatoráxico Ahora que tienes los patrones de espigas de actividad motora desde ganglio metatoráxico a las patas, vas a comprobar si los patrones que registraste darán lugar a los movimientos específicos que observaste. 1. Si estás usando una pinza de cocodrilo en el electrodo de microestimulación, adjunta un electrodo al electrodo de registro que ya está situado en el ganglio metatoráxico. Si estás usando un pin de electrodo conectado a un cable de audio, reemplaza el electrodo de registro con el electrodo de microestimulación. Trata de insertar el electrodo en el mismo lugar. 2. Como en el ejercicio 1, comienza a medir la eficacia de tus electrodos de microestimulación. Registra el efecto de la microestimulación en tu cucaracha preparada en términos de movimiento, en la Tabla 3. Escribe una breve descripción del movimiento en respuesta a una estimulación de 5 segundos. Tabla 3. Efecto de la frecuencia y amplitud en el movimiento Frecuencia Potencia Mínima ½ Potencia Potencia Máxima 20 Hz 80 Hz 200 Hz 1000 Hz 2000 Hz 3. Ahora, utilizando los patrones de espiga generados en el ejercicio 3A, estimula los ganglios metatoráxicos a diferentes volúmenes. Anota los resultados en la Tabla 4. Describe el movimiento que observaste (si existió), y si este movimiento es el mismo que el correspondiente movimiento registrado en la Tabla 2. Tabla 4. Efecto de los patrones de espiga y de la amplitud en el movimiento Patrón de Espiga Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Potencia Mínima ½ Potencia Potencia Máxima PREGUNTAS DE DISCUSIÓN 1. En este experimento probaste la capacidad de respuesta de las patas de cucaracha a una amplia gama de frecuencias y amplitudes. ¿Existe alguna similitud en los tipos de frecuencias y/o amplitudes que causaron la mayor capacidad de respuesta? ¿Por qué crees que podría ser? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2. ¿Fuiste capaz de identificar patrones de espiga que llevaron a movimientos motores? Si fue así, ¿cuáles fueron las características de estos patrones? ¿Qué tipos de movimientos fuiste capaz de encontrar para estos patrones? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Cuando estimulaste los ganglios metatoráxicos con los patrones de espiga que habías observado durante los movimientos de las patas, ¿pudiste generar algún movimiento en la pata? ¿Fueron estos movimientos de las piernas los mismos que observaste durante la grabación de los patrones de espiga? ¿Por qué crees que esto es así? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________