Download Tesis - Universidad de Colima
Document related concepts
Transcript
CO LIM A AB LU TR DI TU ES A AJ A DE CH A Universidad de Colima Facultad de Medicina Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas MODIFICACIONES EN LAS PROPIEDADES BIOFÍSICAS DE LOS CANALES DE POTASIO SENSIBLES AL ATP DE NEURONAS HIPOCAMPALES EN LA DIABETES EXPERIMENTAL EN RATA Tesis Que para obtener el grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas Con especialidad en Fisiología PRESENTA M. en C. Armando Obregón Herrera Asesor Dr. Carlos Guillermo Onetti Percello Co-asesor Dr. Sergio Márquez Gamiño Colima, Col., Junio 2007 Índice Pag. Índice de Figuras 5 Índice de Tablas 6 Resumenes Español 7 Inglés 9 Introducción 11 Diabetes mellitus 11 Homeostasis de la glucosa en el cerebro 13 Neuropatía diabética 16 Daño cognoscitivo en la diabetes 20 El hipocampo, la memoria y el aprendizaje 23 Los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) 25 Hipótesis 30 Objetivos 32 Materiales y Métodos 33 Animales utilizados 33 Inducción de la diabetes 33 Obtención de rebanadas 33 Registros electrofisiológicos 34 Soluciones 36 Rebanadas delgadas para observación de la morfología celular 37 38 Resultados 1. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas control 38 Ubicación de las neuronas CA3 en rebanadas del hipocampo 38 Potenciales de acción en neuronas CA3 del hipocampo 40 Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+ 41 Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia 42 de voltaje de los canales de K+ que mostraron sensibilidad a glucosa en la condición “cell-attached” 3 Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y 46 dependencia de voltaje en condiciones de K+ isométrico Sensibilidad de los canales de K+ sensibles a glucosa al ATP 50 Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales 53 + de K sensibles al ATP 2. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas 54 Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+ 54 Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia 56 de voltaje en condiciones de K+ simétrico Sensibilidad al ATP 59 Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de 61 K+ sensibles al ATP 63 Discusión Propiedades biofísicas de los canales KATP en neuronas piramidales 63 CA3 del hipocampo. Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de 66 voltaje de los canales KATP en células piramidales CA3 del hipocampo de ratas diabéticas. Cambio en la sensibilidad al ATP de los canales KATP en neuronas 69 diabéticas. Sensibilidad a la glucosa de los canales KATP en neuronas control y 72 diabéticas. Conclusiones 75 Perspectivas 76 Bibliografía 77 4 Índice de Figuras Figura No. 1 Pag. Representación esquemática de las relaciones citológicas existentes 14 entre capilares, astrocitos (glia) y neuronas. 2 Topología de las subunidades SUR y Kir 6.X y su ensamblaje para 24 formar un canal KATP. 3 Esquema que muestra la relación entre el metabolismo de la glucosa, 26 los cambios en la proporción de ATP/ADP, la actividad de los canales KATP y la despolarización de la célula nerviosa. 4 Corte coronal de hipocampo de rata teñido visto al microscopio 28 de luz. 5 Esquema que muestra el dispositivo experimental utilizado para la 35 obtención de los registros electrofisiológicos. 6 Hipocampo de rata teñido con azul de metileno. 39 7 Potenciales de acción característicos de las neuronas piramidales 40 CA3. 8 Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a 41 glucosa en la configuración “cell-attached”. 9 Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a 43 glucosa en la configuración “cell-attached”. 10 Actividad de los canales de KATP en el estado estable y cinética 45 de su dependencia al voltaje. 11 Cinética de los tiempos de apertura y cierre para el canal de 46 potasio sensible a glucosa. 12 Actividad unitaria de los canales KATP y efecto “run down”. 47 13 Actividad unitaria de canales KATP de neuronas hipocampales CA3. 48 14 Relación corriente-voltaje de los canales KATP obtenidos de 49 neuronas hipocampales CA3. 15 Cinética de la dependencia de voltaje de los canales de KATP de 50 neuronas CA3 de hipocampo. 16 Sensibilidad de los canales membranales KATP de neuronas CA3 5 52 del hipocampo al ATP. 17 Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales 53 KATP de membrana en neuronas CA3 de hipocampo. 18 Efecto de la glucosa sobre la actividad de canales unitarios de 55 neuronas hipocampales CA3 de ratas diabéticas. 19 Actividad unitaria de canales KATP de neuronas CA3 de 56 hipocampo de rata diabética. 20 Relación corriente-voltaje de los canales KATP de neuronas 57 CA3 de rata diabética. 21 Dependencia al voltaje de la actividad de los canales KATP de 58 neuronas CA3 de hipocampo de la rata diabética. 22 Sensibilidad al ATP de los canales KATP de membranas 60 neuronales CA3 de la rata diabética. 23 Efecto de la glibenclamida en los canales KATP de membranas 61 de neuronas CA3 de la rata diabética. Índice de Tablas Tabla No. Pag. 1 Propiedades de canales KATP en distintos tejidos 29 2 Propiedades de canales KATP en cerebro. 31 3 Composición de las soluciones experimentales (mM). 36 4 Parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas CA3 de 62 hipocampo. 6 Resumen La diabetes mellitus representa actualmente uno de los principales problemas de salud pública en nuestro país. Dentro de las complicaciones de esta enfermedad la neuropatía diabética cobra especial relevancia. Consiste en el daño del sistema nervioso como resultado de la hiperglucemia y/o de la alteración en la acción de la insulina, entre otros factores. Actualmente se considera que la diabetes causa daño estructural y funcional en el sistema nervioso central, afectando la memoria y el aprendizaje. En el cerebro, los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) se encuentran ampliamente distribuidos y son de gran importancia en actividades neuronales fundamentales, acoplando el metabolismo a la excitabilidad neuronal, liberación de neurotransmisores, secreción de hormonas y citoprotección. Estas fracciones se ven alteradas en la neuropatía diabética. El objetivo de este estudio fue evaluar si en la diabetes experimental existe modificación en las propiedades biofísicas de los canales KATP presentes en la membrana de neuronas de la región CA3 del hipocampo de rata. Para ello, se utilizó la técnica de “patch clamp” en las configuraciones “cell-attached” e “inside-out” y se estudiaron los efectos de la glucosa, el trifosfato de adenosina (ATP) y la glibenclamida, sobre los canales KATP, en neuronas CA3 en rebanadas de hipocampo de ratas sanas y diabéticas inducidas experimentalmente con estreptozotocina. Los resultados muestran que la glucosa (20 mM) aplicada en el medio extracelular suprimió la actividad de los canales KATP en neuronas control. Sin embargo, hasta una concentración de 50 mM, no bloqueó la actividad del canal en las células diabéticas. En registros obtenidos en “inside-out patch-clamp”, el ATP y la glibenclamida bloquearon la actividad de los canales KATP en ambos grupos. Interesantemente, las constantes de disociación (KD) para el ATP, obtenidas usando la ecuasión de Hill, fueron de 0.25 y 0.59 mM para neuronas control y diabéticas respectivamente, indicando una disminución de la sensibilidad al ATP del canal KATP en esta última condición. La probabilidad de apertura del canal KATP fue dependiente de la concentración de ATP. En el mismo orden, controles y diabéticas, los valores del coeficiente de Hill (h) (2.4 y 2.1), de la conductancia unitaria para potenciales negativos (178.5 y 177.4 pS) y de la permeabilidad al potasio (3.74 x 10-13 y 3.84 x 10-13 cm/s) de los canales KATP fueron similares. Sin embargo, la rectificación entrante que se observó en las neuronas control no se presentó en las diabéticas. La probabilidad de apertura de los canales KATP fue dependiente de voltaje en las dos 7 condiciones de estudio. En las neuronas control los valores del potencial de membrana al 50% de activación (V1/2) y la sensibilidad al voltaje (k) fueron de 2.1 ± 0.6 y 11.1 ± 0.3 mV, respectivamente. En neuronas diabéticas los valores, en la misma secuencia fueron de 5.3 ± 0.6 y 11.2 ± 0.4 mV. La ausencia de efecto inhibitorio de la glucosa sobre los canales KATP en la diabetes podría deberse a la disminución de la sensibilidad del canal al ATP. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que la glucosa no sea transportada al citoplasma o alguna alteración en la ruta metabólica que impida la síntesis de ATP, o ambas. 8 Abstract Diabetes mellitus (DM) is at this time one of the main problems of public health in Mexico. Within DM complications, the neuropathy (DN) has a special relevance. DN is the damage of the nervous system resulting from hiperglycemia and/or alteration in the insulin effect, among other factors. It has been reported DM is a cause of structural and functional damage in the central nervous system, affecting memory and learning. In the brain, the ATP-sensitive potassium channels (KATP) are widely distributed and play a relevant role in fundamental neuronal activities matching metabolism and neuronal excitability, influencing neurotransmitters release and hormone secretion, as well as participating of the citoprotective mechanisms. All of the mentioned functions are altered in DN. This study was addressed to evaluate functional modifications of KATP channels in membranes of hippocampal CA3 neurons from experimentally induced diabetic rats. Using the patch clamp technique in both, cell-attached and inside-out configurations, glucose, adenosine triphosphate (ATP) and glibenclamide effects were studied. Glucose (20 mM) in extracellular solution suppressed the KATP channels activity in control neurons. However, even at concentrations as high as 50 mM, not channels activity blockage was observed in diabetic cells. In inside-out patches ATP and glibenclamide blocked the activity of KATP channels from both, the experimental and control groups. Interestingly, the ATP dissociation constants (KD), obtained through Hill analysis were 0.25 and 0.59 mM for control and diabetics neurons respectively. The latter indicating a KATP channel sensitivity reduction to ATP in the diabetic condition. The open probability was dependent of ATP concentrations. The control and diabetic values were similar for the Hill coefficient (h) (2.4 and 2.1), the unitary conductance at negative potentials (178.5 and 177.4 pS) and the permeability to potassium of KATP channels (3.74X10-13 and 3.84X10-13 cm/s). Nevertheless, the inward rectification observed in control neurons was not evident in the diabetic condition. The KATP channels open probability displayed voltage dependency in the two study conditions. In control neurons the half activation membrane potential (V1/2) and voltage sensitivity (k) were 2.1± 0.6 and 11.1 ± 0.3 mV, respectively. In diabetic neurons V1/2 was 5.3 ± 0.6 while k was 11.2 ± 0.4 mV. The absence of an inhibitory effect of glucose on KATP channels activity in diabetes could be due to channel sensitivity to ATP 9 reduction. This effect could either be produced by a lack of glucose transport through the cell membrane or by alterations in the metabolic route, decreasing the ATP synthesis. 10 Introducción Diabetes mellitus Es un síndrome donde se altera el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas, caracterizado por aumento anormal de la glucosa sanguínea, resultante de la secreción defectuosa de insulina o de resistencia a la acción de la misma, o ambas (The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, ECDCDM, 2003). Los síntomas de la hiperglucemia que se presentan en la diabetes mellitus (DM) incluyen poliuria, polidipsia, pérdida de peso, fatiga, algunas veces polifagia y visión borrosa (Félix, 2005). Actualmente, esta enfermedad es considerada una epidemia. Se estima que el número total de personas con diabetes en el mundo es de 173 millones y se calcula que para el año 2030 serán 350 millones. Alrededor de dos tercios de estos pacientes viven en países en vías de desarrollo (WHO, 2003). Se atribuye el aumento súbito de los últimos años en la incidencia de DM al aumento de la obesidad más que a factores genéticos (Permutt, Wasson & Cox, 2005; Lazar, 2005). En México, un país en desarrollo, la DM representa uno de los principales problemas de salud pública. En 1994, la República Mexicana ocupó el décimo lugar mundial con casi 4 millones de enfermos. Actualmente, se estima que la población afectada fluctúa entre 6.5 y 10 millones (prevalencia nacional de 10.7% en personas de 20 a 69 años), de los cuales, se estima que 2 millones de personas no han sido diagnosticadas (Federación Mexicana de Diabetes, 2007). A través del tiempo la diabetes mellitus ha tenido diversas clasificaciones, sus diferentes formas fueron redefinidas por el ECDCDM, en 2003: a) Tipo 1, conocida anteriormente como diabetes dependiente de insulina (IDDM), caracterizada por destrucción autoinmune de las células β del páncreas, conduciendo a la deficiencia de insulina. Los individuos con riesgo elevado de desarrollar este tipo de diabetes pueden ser detectados en la mayoría de los casos mediante pruebas serológicas de 11 los procesos patológicos autoinmunes que afectan a los islotes pancreáticos, asimismo por marcadores genéticos. Los portadores de DM tipo 1 requieren de tratamiento con insulina para sobrevivir, ya que sin ella se produce cetoacidosis debido al metabolismo de las grasas utilizado para sustituir la falta de glucosa dentro de las células, lo que constituye una complicación grave de la diabetes. b) Tipo 2, conocida anteriormente como diabetes no dependiente de insulina (NIDDM), se caracteriza por la combinación de resistencia de algunos tejidos a la acción de la insulina y por tanto una deficiencia relativa de la misma. El origen de este tipo de diabetes es multifactorial, usualmente ocurre en individuos obesos y está asociada con hipertensión y con aumento de grasas en sangre denominado dislipidemia. También existe una fuerte predisposición genética, aunque este factor es complejo y no está claramente definido ya que no sigue un patrón Mendeliano. Por lo que se infiere que es de origen poligénico (Nichols & Koster, 2002). Esta última posibilidad esta apoyada por estudios de mapeo genético en poblaciones ó grupos genealógicos específicos, particularmente en los indios Pima, quienes presentan prevalencia de diabetes de hasta el 40% (Schulz et al. 2006). A diferencia de la enfermedad tipo 1, en la diabetes tipo 2 la secreción de insulina puede ser estimulada por drogas, tales como las sulfonilureas (tolbutamida, glibenclamida, etc.) (Ashcroft & Ashcroft, 1992). La historia natural de la diabetes mellitus tipo 2 generalmente inicia con obesidad, los pacientes frecuentemente manifiestan el llamado síndrome metabólico o síndrome X, el cual está significativamente asociado con resistencia a la acción de la insulina, a la posterior deficiencia de la misma y a la presentación de la enfermedad con los signos y síntomas característicos (Lazar, 2005). En consecuencia se generan complicaciones entre las que destacan la retinopatía, el daño renal y las neuropatías central y periférica. c) Otros tipos de diabetes con origen específico diferente, agrupan a los asociados a defectos genéticos que afectan la función de las células β pancreáticas, como ocurre en enfermedades específicas del páncreas por disrregulación endocrina, infecciones, trauma, etc. d) La diabetes mellitus gestacional (GDM), es definida como cualquier grado de intolerancia a la glucosa con un inicio o primer reconocimiento durante el embarazo. 12 Homeostasis de la glucosa en el cerebro. En condiciones normales, la glucemia sistémica de un individuo varía entre 70 mg/dl (3.8 mM) y 120 mg/dl (6.6 mM), mientras que las concentraciones in vivo en el espacio extracelular del cerebro (en rata) oscilan entre 0.5 y 2.0 mM de glucosa (Silver & Erecinska, 1994). El consumo cerebral de energía, comparado con la pequeña proporción que este órgano representa de la masa corporal del organismo, es mucho mayor que el de otros órganos y tejidos, como el músculo (Sokoloff, 2004). Debido a que la necesidad energética en cerebro es cubierta primordialmente por la oxidación de la glucosa (Sokoloff), el organismo “asegura” niveles mínimos de ella, para que no le falte en ningún momento. En la hipoglucemia el humano pierde coordinación de movimientos, muestra debilidad, temblor, transpiración excesiva y desmayo (Félix, 2005). Ante situaciones extremas, el hígado que almacena aproximadamente 100 g de glucógeno, hidroliza a este último para librar glucosa a la sangre y elevar su concentración. El cerebro está separado de la circulación general por la barrera hematoencefálica (BHE) (Nicholls, Martin & Wallace, 1992). Sin embargo, sustratos específicos como la glucosa, el lactato y ciertas hormonas (insulina, leptina, etc.), ingresan al SNC por medio de mecanismos específicos de transporte a través de la BHE (Banks, 1997). Tomando en cuenta las evidencias encontradas sobre el metabolismo energético cerebral y sus consecuencias sobre el resto del organismo, se ha propuesto que el cerebro representa la más alta autoridad reguladora y el consumidor con la más alta prioridad por la glucosa. Durante períodos de estrés y de escasez energética, el cerebro garantiza su propio aporte aún a expensas de los demás órganos (Peters et al. 2004). En el cerebro, además de neuronas y células gliales, existen otros tipos de células como las endoteliales vasculares, que no sólo consumen energía sino que juegan un papel fundamental en el aporte de sustratos a las neuronas. La función que juegan los astrocitos como proveedores de sustratos energéticos a las neuronas activas es particularmente importante (Deitmer, 2001), formando así una relación citológica entre los capilares del cerebro, astrocitos y neuronas (Magistretti, 1999) (véase Figura 1). 13 Figura 1. Representación esquemática de las relaciones citológicas existentes entre capilares, astrocitos (glia) y neuronas. Los astrocitos rodean capilares (arriba), y cubren terminaciones neuronales (sinapsis) (abajo), lo que permite sensar la actividad sináptica y acoplarla con la captación de sustratos provenientes de la circulación e intercambiar metabolitos. Modificado de Magistretti, 1999. 14 El tejido cerebral necesita de grandes cantidades de energía para su funcionamiento normal, la cual se encuentra almacenada principalmente en las moléculas de ATP. Esa energía le permite regular y operar las conexiones sinápticas, algunos canales iónicos, así como la síntesis, transportación, almacenamiento y liberación de diversas sustancias (neurotransmisores, enzimas, etc.). Esencialmente, el consumo energético alto (75%) ocurre debido a vias de señalización y el resto (25%) es utilizado para la actividad celular que no involucra dichas vias de señalización, como son las actividades celulares básicas y los potenciales de acción, receptores postsinápticos, potencial de reposo, reciclamiento del glutamato, etc. (Mc. Kenna, Gruetter, Sonnewald, Waagepetersen & Schousboe, 2006). En condiciones normales, cuando la concentración extracelular de glucosa sobrepasa a la intracelular (Pfeuffer, Tkac & Gruetter, 2000), esta hexosa se transporta al interior de la célula vía difusión facilitada por transportadores específicos (GLUTs), ya en el interior de la célula se fosforila por una glucocinasa que cataliza su conversión a glucosa-6-fosfato. El primer paso de la glucólisis juega un papel crítico en la homeostasis de la glucosa en muchos tipos celulares incluyendo a las neuronas (Nichols & Koster, 2002). La continuación de esa primera fase anaeróbica ocurre en el citoplasma y lleva a la producción de ácido pirúvico, ácido láctico y dos moléculas de ATP. Después, en una fase aeróbica mitocondrial, el ácido pirúvico es transformado en 36 moléculas de ATP, CO2 y agua. Esta transformación ocurre a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y de la cadena respiratoria. Se ha propuesto que el lactato formado durante el metabolismo de la glucosa en las células gliales también puede ser usado por neuronas cerebrales activas como fuente de energía bajo condiciones metabólicas especiales, por ejemplo, después de actividad neural, cuando la función glucolítica está disminuida. También podría ser utilizado durante la recuperación de una patología. Subrayando que la utilización directa de la glucosa por las neuronas durante la actividad parece ser predominante (Chih, Lipton & Roberts, 2001). En la DM la disponibilidad de glucosa para los tejidos es inadecuada, pues aunque el nivel extracelular se incrementa (Silver & Erecinska, 1994), existe un déficit del metabolito en el interior celular. Bajo esas condiciones, el exceso de glucosa eventualmente deriva a rutas metabólicas alternativas que, como consecuencia, producen daño a diferentes órganos (Sheetz & King, 2002). También, estudios recientes han esclarecido un mecanismo de patogénesis que involucra cambios activos en la expresión génica, como el aumento de vasopresina en neuronas del SNC, que desencadena en daño renal (Klein & Waxman, 15 2003). Otros mecanismos de adaptación operan en las células (neuronas), ante la imposibilidad de metabolizar la glucosa permitiendo la utilización de otros metabolitos como los cuerpos cetónicos, como fuente de energía (Makar, Hungund, Cook, Kashfi & Cooper, 1995), originando trastornos metabólicos. Neuropatía diabética Es una complicación de la diabetes mellitus que consiste en daño al sistema nervioso como resultado de la hiperglicemia y/o de la alteración en la acción de la insulina, entre otros factores. La neuropatía simétrica distal es la más frecuentemente asociada a la diabetes mellitus (Vinik et al. 1992; Dyck et al. 1993). Los pacientes refieren una sensación o conjunto de sensaciones anormales, especialmente hormigueo, adormecimiento o ardor en la piel, que afecta principalmente a las extremidades inferiores. Durante el examen neurológico tanto de pacientes diabéticos sintomáticos como asintomáticos, se detecta pérdida de sensación distal y disminución o pérdida del reflejo del tobillo (Vinik et al. 1992; Dyck et al. 1993). Los exámenes electrofisiológicos generalmente muestran disminución de la velocidad de conducción en nervios motores y sensoriales (Arezzo, 1997). Un segundo grupo, las neuropatías asimétricas focales y multifocales, resultan de un daño repentino a un nervio o grupo de nervios en cualquier parte del cuerpo (cráneo, tronco, etc.) causando debilidad muscular o dolor. En este caso el daño es dirigido preferentemente a los nervios motores más que a los sensoriales (Funk, 2003). En años recientes se ha encontrado evidencia en humanos y modelos experimentales de animales diabéticos, que vincula hiperglucemia e hipoglucemia con alteraciones del sistema nervioso central con daño cognitivo consecuente (Stewart & Liolitsa, 1999; Izumi, Yamada, Matsukawa, & Zorumski, 2003; Sima, Kamiya, & Li, 2004; Li, Zhang, & Sima, 2005) A este tipo de neuropatía (encefalopatía) se le ha atribuido actualmente gran importancia médica. A pesar de que la neuropatía diabética central no ha sido suficientemente estudiada, se han observado anormalidades en el cerebro de pacientes diabéticos. Entre ellas, se ha descrito 16 degeneración severa de las materias blanca y gris en estudios neuropatológicos y de resonancia magnética, lo que hace suponer substrato orgánico para la encefalopatía diabética (Gispen & Biessels, 2000). La diabetes causa complicaciones primarias y secundarias del SNC, con daño tanto a su integridad estructural como funcional (Sima et al. 2004; Li et al. 2005). La encefalopatía diabética primaria es causada directamente por hiperglucemia y/o alteración en la acción de la insulina; mientras que la secundaria es causada por eventos cerebrovasculares derivados de la enfermedad vascular diabética o por tratamientos hipoglucemiantes intensos, que potencialmente pueden producir daño cerebral por hipoglucemia (Li & Sima, 2004; Sima et al. 2004). En humanos, no se conoce con exactitud cuando inicia el daño nervioso asociado a esta entidad fisiopatológica. Lo que se atribuye a la carencia de una buena definición del cuadro clínico de inicio y de los métodos usados para su detección. Varios estudios muestran evidencias de que la neuropatía diabética empieza a desarrollarse hasta 10 años antes de que se confirme el diagnóstico clínico de la diabetes (ECDCDM, 2003, TrujilloHernández, Huerta, Pérez-Vargas, Trujillo, & Vásquez, 2003). En modelos experimentales de diabetes en ratas, en los que se induce la metabolopatía con estreptozotocina (STZ), se reporta daño al SNC, específicamente en células granulares del giro dentado del hipocampo, apenas 5 días después de la aplicación de la droga (Jackson-Guilford, Leander, & Nisenbaum, 2000). La STZ, un antibiótico obtenido de la bacteria del suelo Streptomyces achromogenes, químicamente es nitrosourea de glucosamina. Este agente destruye selectivamente a las células β pancreáticas (Szkudelski, 2001). Muchos de los conocimientos actuales de los posibles mecanismos patogénicos de la neuropatía central provienen de estudios en ratas tratadas con STZ (Greene, Stevens, & Feldman, 1999). La STZ es captada por las células β vía el transportador de glucosa GLUT-2, el cual es expresado abundantemente en las células productoras de insulina de los islotes pancreáticos (Schnedl, Ferber, Johnson & Newgard, 1994). Hasta ahora, no se tienen referencias del paso directo de la STZ al cerebro, debido a la ausencia de transportadores GLUT-2 en la barrera hematoencefálica (Kumagai, 1999). Aunque el modelo de diabetes experimental inducido en animales con STZ ha sido muy útil para el estudio de los efectos de la hiperglucemia y/o de las 17 alteraciones en la acción de la insulina, debe subrayarse que sus formas endocrinológicas pudiesen no necesariamente reflejar los tipos 1 ó 2 de la diabetes (Gispen & Biessels, 2000). A pesar de lo anterior, ratas diabéticas inducidas con STZ, es un modelo aceptado para el estudio de las complicaciones de la diabetes en humanos (Wei et al. 2003). Por otra parte, existen roedores con diabetes tipo 2 genéticamente determinada, por ejemplo las ratas Zucker fa/fa. Aunque esos modelos imitan razonablemente bien los signos y ciertos aspectos endocrinológicos de la diabetes tipo 2, la mayoría de sus características no han sido suficientemente estudiadas (Gispen & Biessels, 2000). Por ello, el método de inducción experimental con STZ ha sido el modelo más utilizado. Debido a que la hiperglucemia en la diabetes mellitus tipo 2 causa trastornos microvasculares y puede además contribuir a trastornos macrovasculares, la diabetes no diagnosticada es una condición de riesgo para enfermedades del corazón: coronariopatías, infartos, hipertensión, etc.; así como para enfermedad cerebral (ECDCDM, 2003). La fisiopatología de la neuropatía diabética se ha investigado en varias vertientes, como se describe a continuación: Los altos niveles de glucosa pueden afectar varias rutas metabólicas en células nerviosas y en otros tejidos, produciendo daño en los mismos. Parte de la glucosa es metabolizada a sorbitol por la aldosa reductasa. El sorbitol, a su vez, es oxidado a fructuosa por la sorbitol deshidrogenasa (Evans, Goldfine, Maddux, & Grodsky, 2002; Stevens, Obrosova, Feldman & Greene, 2000), también produce aumento en la osmolaridad celular, disminución del mioinositol intracelular y alteraciones en la bomba Na+/K+-ATPasa retrasando la conducción nerviosa, lo que a su vez produce daño tisular (Greene, Sima, Stevens, Feldman, & Lattimer, 1992). Igualmente, se ha estudiado la asociación entre sorbitol y óxido nítrico, que se sabe dilata los vasos sanguíneos por aumento en la producción de GMP cíclico, en el músculo liso vascular. En ratas diabéticas genéticamente propensas se demostraron cambios importantes en el flujo endoneural, que hacen suponer que en personas con diabetes, los bajos niveles de óxido nítrico podrían ocasionar constricción vascular, disminuyendo la irrigación de las células nerviosas (Zochodne, Ho & Alison, 1994) reduciendo el aporte de glucosa y oxígeno, con el consecuente daño celular de las mismas (Zochodne, Verge, Cheng, Sun & Johnston, 2001). 18 Por otro lado, se ha estudiado el efecto de la diabetes en la cascada de transducción de señales intracelulares en regiones cerebrales discretas, encontrando relación de la diabetes con la atenuación del metabolismo de diacilglicerol, inositoltrifosfato, fosfolipasa C y fosfolipasa A2, paralelamente con incremento de la actividad de las cAMP/proteina cinasas A y C (Bhardwaj, Sandhu, Sharma & Kaur, 1999). Se atribuye a estos hechos un papel en el desarrollo de la neuropatía central. La activación de la proteína cinasa C puede producir deterioro en los vasos sanguíneos de la retina, riñón y tejido nervioso, así como daño vascular con aumento de la permeabilidad, adhesión leucocitaria y alteración en el flujo sanguíneo (Wautier & Guillauseau, 2001). Asociados a fisiopatología de la neuropatía diabética, se presentan la isquemia del tejido nervioso y el estrés oxidativo como otros factores involucrados en la génesis de esta patología (Tuck, Schmelzer, & Low, 1984). Se sabe que con la isquemia ocurre hiperpolarización y disminución de la excitabilidad celular en miocitos cardiacos y en neuronas, reduciendo sus demandas metabólicas (Ashcroft & Ashcroft, 1990; Allen & Brown, 2004; Ballanyi, 2004). Es posible que este efecto de protección isquémica se vea disminuído en el corazón de los sujetos diabéticos (Del Valle, Lascano, & Negroni, 2002). Rusell, Sullivan, Windebank, Hermann & Feldman (1999) sugirieron que el estrés oxidativo puede promover cambios mitocondriales en neuronas y en cultivos neuronales de animales diabéticos y conducir a la activación de la vía de las caspasas y de la muerte celular programada. En el SNC, en diferentes zonas del cerebro de ratas diabéticas inducidas con STZ se ha demostrado que el sistema “neutralizador” de los radicales libres formados por el estrés oxidativo mitocondrial es desregulado, lo cual conduce al aumento intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), que activan procesos que producen daño al DNA y muerte neuronal (Singh, Jain & Kaur, 2004). Otra área de investigación se refiere a la glucosilación no enzimática de proteínas, proceso que altera la estructura y función de células nerviosas y vasculares (Brownlee, 1994). La hiperglucemia presente en la diabetes per se causa autooxidación de lípidos y glucosilación de proteínas como albumina, lipoproteínas de baja densidad e inmunoglobulina G, las que pueden quedar unidas por enlaces covalentes al colágeno de la membrana basal del endotelio, disminuyendo el lumen del vaso sanguineo y dificultando la circulación 19 (Gugliucci, 2000; Wolff, Jiang & Hunt, 1991; Wolff, 1993), lo que es de particular interés en el cerebro (Nickander, McPhee, Low & Tritschler, 1996). También ha sido explorado el campo concerniente a las deficiencias relativas de factores de crecimiento neural en la polineuropatía diabética, ya que se sabe que estas sustancias participan en la reparación y regeneración de nervios periféricos (Hellweg & Hartung, 1990). Recientemente, Calcutt et al. (2003) reportaron que en ratas diabéticas está disminuida la expresión de proteínas “desert hedgehod” (DHh), esenciales para el desarrollo del sistema nervioso periférico tanto en el estado normal como en el patológico. Al tratar a los animales diabéticos con una proteína de fusión hedgehog-IgG se revirtieron los efectos de la neuropatía diabética, lo que sugiere su potencial uso terapéutico. La actividad de las vías metabólicas afectadas en la diabetes y/o en la hiperglucemia no depende de la actividad eléctrica neuronal, por tanto constituye una respuesta neural electrofisiológicamente “pasiva”. Aunque los mecanismos asociados a la sobrecarga de glucosa que afectan pasivamente a las vías metabólicas son los principales responsables de la patología neural diabética, investigaciones recientes sugieren un segundo mecanismo “activo” (Aragno et al, 2002; Klein, Craner, Cummins, Black & Waxman, 2002). El estado diabético induce cambios en la transcripción genética neuronal en el hipocampo e hipotálamo (Aragno et al.; Klein et al.; Klein & Waxman, 2003). Daño cognoscitivo en la diabetes La manifestación de desórdenes cerebrales diabéticos ha sido evidenciada a nivel cognoscitivo, estructural, electrofisiológico, y neuroquímico (Biessels, Kapelle, Bravenboer, Erkelens & Gispen, 1994; Di Mario, Morano, Valle & Pozzessere, 1995; Helkala, Niskanen, Viinamaki, Partanen & Uusitupa, 1995; McCall, 1992; Kamal, Biessels, Duis & Gispen, 2000). En relación al daño cognoscitivo, estudios en pacientes diabéticos tipo 2 durante episodios de hiperglucemia aguda (glucemia ≥ 300 mg/dl ó 6.5 mmol/l) después de 5.9 años de duración conocida de la enfermedad, muestran alteración de la capacidad de conocer y 20 deterioro en el estado de ánimo. Se considera que estos hallazgos son de importancia práctica debido a que la hiperglucemia crónica o intermitente es común en individuos con diabetes tipo 2 y puede interferir con sus actividades diarias (Sommerfield, Deary & Frier, 2004). Varias áreas del cerebro parecen contribuir al déficit cognoscitivo asociado a la diabetes mellitus (Heijer et al. 2003). Sin embargo, las tareas dependientes del hipocampo parecen ser particularmente sensibles a la hiperglucemia (Li et al. 2005; Gold et al.). Las pruebas de cognición en ratones y ratas con diabetes inducida por estreptozotocina, han revelado resultados similares. Ratones diabéticos muestran déficit significativo en la retención de la memoria y en tareas de evocación activa dependiente de hipocampo, reversible con la administración de insulina (Flood, Mooradian & Morley, 1990). También se observó en ratas adultas despues de 2,4,6 y 8 semanas de inducción de la diabetes, deficiencia en la realización o en el rendimiento en tareas de memorización y aprendizaje espacial. Estas deficiencias se agudizaron conforme aumentó la complejidad de las tareas (Popovic, Biessels, Isaacson & Gispen, 2001). En participantes jóvenes, con diabetes tipo 2, relativamente bien controlada, Gold et al. (2007) encontraron una reducción en el volumen cerebral restringida al hipocampo respecto a sujetos controles no diabéticos, estudiados con imagenes de resonancia magnética. Paralelamente les detectaron déficit en el rendimiento de memoria hipocampal. Hallazgos similares habían sido previamente descritos en adultos mayores, por lo que no se consideraban observaciones suficientemente claras, ya que los efectos podrían asociarse a otras patologías concomitantes, v. gr. insuficiencia vascular o al mismo proceso de envejecimiento (van Harten et al. 2007). Este último reportó una correlación entre el daño cognositivo y el tiempo de evolución de la DM. El aprendizaje asociativo, la memoria y la evocación se han relacionado con cambios a largo plazo en la eficacia sináptica entre neuronas hipocampales. Las alteraciones en la señalización involucrada en estas funciones han sido estudiadas en modelos animales de diabetes. Los defectos en la memoria declarativa (recuerdo de experiencias personales, uso y acumulación del conocimiento), dependiente del hipocampo, parecen ser el resultado de los efectos deletéreos de la hiperglucemia. En ratas diabéticas existe deterioro progresivo de la plasticidad sináptica y del aprendizaje (Kamal et al. 2000). Las alteraciones en la plasticidad sináptica asociadas con deficiencia 21 en el aprendizaje de tareas espaciales se previenen con la aplicación de insulina, pero no se revierten una vez que el déficit en la ejecución de la tarea o en la LTP se han instalado (Biessels et al. 1998). Asimismo, las ratas diabéticas muestran deficiencia en la retención y en la recuperación de la información almacenada (Biessels et al. 1996). Se desconoce el mecanismo por el que se dañan estas habilidades en la diabetes, se ha propuesto que la diabetes inducida con STZ actúa como un estresor endógeno que induce cambios estructurales en la región CA3 del hipocampo, particularmente retracción y simplificación de las dendritas apicales. Dichos cambios son parcialmente coincidentes con los que se producen como efecto del estrés exógeno ó de la administración de glucocorticoides. Además, se ha demostrado que la diabetes experimental acelera los cambios producidos por el estrés ambiental en ciertas regiones del hipocampo (Magariños & McEwen, 2000). En otras palabras, la concentración de glucosa es importante para la plasticidad sináptica y por lo tanto en la habilidad para aprender (Tekkok & Krnjevic, 1999). Evidencias muestran que el proceso de neurogénesis (proliferación celular, sobrevivencia, migración y diferenciación) continúa en el humano adulto (Gould, Tanapat, Hastings & Shors, 1999). Sin embargo, en humanos con diabetes hay daño estructural demostrado como degeneración severa de materia blanca y gris (Gispen & Biessels, 2000). Como fue mencionado previamente, un estudio muestra que la proliferación celular disminuye dramáticamente en el giro dentado del hipocampo de ratas diabéticas a los pocos días de haber inducido la metabolopatía (Jackson-Guilford et al. 2000). Por otra parte, se han evidenciado alteraciones electrofisiológicas, en células CA1 de hipocampo de ratas diabéticas hay un incremento en la duración del potencial de acción cuando se compara con la de animales control (Kamal, Artola, Biessels, Gispen & Ramakers, 2003). Los autores señalan que estos potenciales de acción son similares a los registrados en tejidos provenientes de ratas viejas. En la explicación se involucran alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular. Sin embargo, no se demuestran diferencias en el potencial de membrana en reposo, la resistencia de entrada, ni en la constante de tiempo respecto a los controles. También se han reportado incrementos en la sensibilidad en neuronas CA1, medida como aumento en la amplitud y en el número de espigas, secundario al aumento de potasio extracelular. Asimismo, como cambios en la velocidad de conducción. Ambos casos 22 estudiados en rebanadas de hipocampo de ratas diabéticas y comparadas con neuronas control (Candy & Szatkowski, 2000a & 2000b). Los autores mencionan que estas alteraciones podrían ocurrir como una consecuencia de daño en la actividad de la enzima Na+,K+-ATPasa. Es de subrayarse que se ha comprobado una interacción funcional entre esta enzima y los canales KATP en neuronas del SNC bajo condiciones experimentales de isquemia cerebral (Akaike, Jin & Koyama, 1997). De lo cual se infiere que los canales KATP en el SNC podrían verse afectados en otros trastornos metabólicos como la diabetes. El hipocampo, la memoria y el aprendizaje El hipocampo esta formado por el doblez interno de los lóbulos temporales del cerebro, tiene forma de “C” y presenta 3 zonas: giro dentado, asta de Ammon y subículo. El asta de Ammon se ha dividido en varios campos CA1, CA2, CA3 y CA4 (véase Figura 2). Está involucrado en las funciones cerebrales de consolidación de la memoria y el aprendizaje, sin embargo los mecanismos celulares que soportan esta asociación no están completamente esclarecidos (Jackson-Guilford, et al. 2000). La asociación de la memoria y el aprendizaje con la estructura hipocampal quedó establecida a partir de casos en los cuales el daño a estas funciones se asoció con lesiones bilaterales confinadas al hipocampo (Scoville & Milner, 1957). Una lesión en esta zona produce amnesia anterógrada o disminución de la habilidad para adquirir información nueva o formación de nueva memoria, pero no afecta al aprendizaje de nuevas capacidades o habilidades. Por ejemplo, una persona podría aprender a montar en bicicleta después de la lesión, pero no recordaría haber visto nunca una bicicleta. Tales observaciones hacen suponer que los cambios duraderos en la eficacia de señalización entre las neuronas del hipocampo se pueden traducir en la consolidación de la memoria. Una correlación celular de los cambios a largo plazo con la eficacia sináptica (plasticidad sináptica) fue identificada por Bliss & Lomo en 1973, quienes demostraron que la estimulación breve de alta frecuencia, de la zona aferente subicular del hipocampo, produjo un incremento en la amplitud del potencial sináptico excitatorio, registrado en las neuronas postsinápticas hipocampales CA1. Este efecto se prolonga por horas, días o incluso semanas en el animal intacto. 23 A B Figura 2. A. En el lado derecho se muestra un corte coronal de cerebro de rata con insertos para indicar las diferentes zonas. En el lado izquierdo se muestra un diagrama equivalente. Arriba se observan los dos lóbulos que forman al hipocampo, situados debajo de la corteza y orientados hacia cada uno de los hemisferios (Tomado de Palkovits y Brownstein, 1988). B. Corte coronal de hipocampo de rata teñido con Hematoxilina-Eosina visto al microscopio de luz. Observe las diferentes zonas del asta de Ammon (CA1, CA2, CA3 y CA4) y el giro dentado (GD) (Tomado de Téllez et al. 2003). 24 Los autores llamaron a esta respuesta, potenciación de largo-término (LTP). Se sabe que la LTP requiere tanto la liberación de glutamato como la despolarización de la célula postsináptica. Estudios posteriores mostraron que las sinapsis son diferentes dependiendo de la zona hipocampal. En CA1, la LTP tiene una acción asociativa y cooperativa. Es asociativa porque dos o más estímulos sinápticos contribuyen a una ráfaga ó a ráfagas repetidas en una neurona. Cualquier LTP resultante afecta a todas las sinapsis “asociadas”. Es cooperativa porque muchos estímulos débiles, aplicados a vías que convergen en una sóla, pueden, colectivamente despolarizar a la célula postsináptica e inducir la LTP. La zona CA3 recibe conexiones sinápticas de las fibras musgosas de las células granulares del núcleo dentado (Kapur, Yeckel, Gray & Johnston, 1998). Ahí la LTP es no asociativa, es decir, se origina por el uso repetido de un estímulo, el carácter persistente de éste en la sinapsis, acciona la entrada de calcio a la célula postsináptica (Nicholls et al. 1992). Los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) Los canales KATP son canales de potasio pertenecientes a la familia de rectificadores entrantes y estructuralmente son heteromultímeros formados por dos subunidades, una de ellas que forma el poro del canal (Kir6.x) con dos subtipos (Kir6.1 ó Kir6.2) y otra reguladora que es el receptor a sulfonilureas (SURs) con varias isoformas dependiendo del tejido (SUR1, SUR2A ó SUR 2B). Los canales KATP son llamados así porque su actividad es controlada por las concentraciones intracelulares de ATP y ADP. Los canales Kir6.x tienen dos dominios transmembranales, mientras que los receptores SUR poseen diecisiete dominios con esta característica. Ambas moléculas se ensamblan para formar un canal octamérico funcional, con una relación estequiométrica 1:1 (Clement et al. 1997). Las cuatro subunidades Kir forman el poro y las otras cuatro forman un anillo exterior que abraza o cubre al poro y regulan la apertura y cierre del canal (Campbell, Sansom, & Ashcroft, 2003). Estas últimas tienen dos dominios de enlace a nucleótidos orientados hacia la cara citosólica (Clement et al.) (véase Figura 3). 25 SURx KIR6.X N C N C NBF-1 NBF-2 x SUR K IR6.X (SURX/KIR6.X)4 Figura 3. Topología de las subunidades SURx y Kir6.X (arriba) y su ensamblaje para formar un canal KATP (abajo). NBF-1 y NBF-2 indican los sitios de unión a nucleótidos. A cada subunidad SURx se une una subunidad Kir6.X. Cuatro subunidades SURx y cuatro Kir6.X forman el canal funcional. Los canales KATP se encuentran distribuidos ampliamente en muchos tejidos y tipos celulares. Originalmente se descubrieron en células cardiacas (Noma, 1983), posteriormente se encontraron en otros tejidos y órganos, como en las células β pancreáticas (Cook & Hales, 1984), cerebro (Ashford, Sturgess, Trout, Gardner, & Hales, 1988; Amoroso, Schmid-Antomarchi, Focet & Lazdunski, 1990), músculo liso (Standen et al. 1989), músculo esquelético (Spruce, Standen & Stanfield, 1985), riñón (Hunter & Giebisch, 1988) y en células ganglionares de la raíz dorsal (Ristoiu, Pluteanu, Flonta & Reid, 2002). 26 En el cerebro, los canales KATP se encuentran ampliamente distribuidos. Se han identificado en hipotálamo (Ashford, Boden, & Treherne, 1990 a, 1990 b), interneuronas colinérgicas (Lee, Dixon, Freeman & Richardson, 1998), hipocampo (Velasco, García & Onetti, 2006; Zawar, Plant, Schirra, Konnerth & Neumcke, 1999), globo pálido y pálido ventral (Gehlert, Gackenheimer, Mais, & Robertson, 1991), sustancia nigra (Mourre, Widmann & Lazdunski, 1990; Jiang, Sigworth & Haddad, 1994) y glándula pituitaria (Bernardi et al. 1993). Funcionalmente, los canales KATP son importantes para la secreción de insulina estimulada por glucosa en las células β del páncreas (Ashcroft, 2000; Baukrowitz & Flaker, 2000). Además, la actividad de los canales KATP es crítica en la respuesta cardiovascular adaptativa al estrés metabólico como hipoxia, isquemia e inhibición metabólica cuando el ATP está disminuido (Isomoto, 2003; Jahangir & Terzic, 2005). En músculo esquelético, donde la actividad metabólica cambia dramáticamente por la contracción muscular, los canales KATP permanecen inactivos en reposo y son activados durante la fatiga. La apertura de estos canales incrementa las corrientes salientes de K+ que contribuyen al acortamiento de la duración del potencial de acción y a la protección contra la sobrecarga de calcio intracelular (Seino & Miki, 2003). Se sabe que la relajación de células de músculo liso disociadas de arterias mesentéricas es mediada por la apertura de canales KATP y estos parecen ser la conexión entre el metabolismo y la regulación del flujo sanguíneo, a través de su dependencia al ATP (Standen et al., 1989; Isomoto; Seino & Miki). Por otra parte, con base en estudios realizados en células de la membrana basolateral del túbulo contorneado proximal de riñón de conejo, se ha propuesto que el acoplamiento de los canales KATP a la bomba Na+,K+-ATPasa es un mecanismo por el cual se mantiene la reabsorción de NaCl en el estado estable (Mauerer, Boulpaep & Segal, 1998). En células nerviosas, los canales KATP actuan como sensores de la actividad metabólica. La información concerniente al estado metabólico se traduce en información eléctrica, que puede influenciar la excitabilidad de la membrana celular (Ashford et al. 1988). Como resultado del metabolismo neuronal de la glucosa, se produce un incremento en la proporción ATP/ADP que cierra los canales KATP y produce despolarización de la membrana. Por el contrario, la deficiencia de glucosa disminuye la proporción ATP/ADP, abre los canales KATP, aumenta la salida de potasio y la membrana se hiperpolariza. Si los 27 niveles de ATP son demasiado bajos la neurona se desactiva, es decir permanece silente (Aguilar-Bryan & Bryan, 1999) (véase Figura 4). También se ha relacionado a estos canales con otras actividades fisiológicas que incluyen la secreción de hormonas (Bernardi et al. 1993) y la citoprotección durante periodos de estrés isquémico (Amoroso et al. 1990; Terzic, Jahangir, & Karachi, 1995; Griesemer, Zawar & Neumcke, 2002). En este último trabajo, se reporta que los canales KATP tienen un profundo efecto en la excitabilidad de las neuronas del hipocampo, lo que implica que su activación durante la isquemia o la hipoxia disminuye la actividad de las células piramidales excitatorias a niveles por abajo de lo que ocurre en interneuronas inhibitorias (citoprotección selectiva). Figura 4. Esquema que muestra la relación entre el metabolismo de la glucosa, los cambios en la proporción de ATP/ADP, la actividad de los canales KATP y la despolarización de la célula nerviosa. Los canales KATP tienen diferentes propiedades biofísicas y farmacológicas dependiendo de el tejido donde se encuentren, se muestran la Tabla 1. la caracterización de estos ha sido reportada utilizando la técnica de “patch clamp” en sus diferentes configuraciones. 28 Tabla 1. Propiedades de canales KATP en diferentes tejidos* Tejido Subunidades Pancreático Musculo cardiaco Musculo liso SUR1/Kir6.2 SUR2A/Kir6.2 SUR2B/Kir6.2 SUR2B/Kir6.1 SUR2A/Kir6.2 Conduc tancia (pS) 50-65 80 Sensibilidad a ATP IC50 (µM) 10-20 17-100 Sensibilidad a Glibenclamida IC50 (µM) 5 nM 1.5 Potencia de KCOs 20-50 53 20 3 1-20 P=C>D D>P>C P=C Musculo 20-135 135 P=C esqueletico Nervioso SUR1/Kir6.2 26-200 100-3000 6-100 C =P>D * Tejidos de rata y ratón. Glib: glibenclamida, KCOs: activadores de los canales de potasio; D: Diazóxido, P: Pinacidil, C:Cromakalim. Modificada de: Babenko et al. 1998 y Karla Vera, 2006. Proyecto Doctoral. Las propiedades de los canales KATP de algunas regiones cerebrales representativas se muestran en la Tabla 2. También la caracterización de éstos ha sido reportada utilizando la técnica de “patch clamp” en sus distintas configuraciones, en células neocorticales por Jiang y Haddad (1997) y en neuronas del giro dentado por Pelletier, Pahapill, Pennefather y Carlen (2000). En las células neocorticales se han encontrado dos tipos de canales KATP con conductancias diferentes: Uno con un valor de 47 pS, su inhibición por ATP presenta una IC50 de 130 µM mientras que con glibenclamida varió entre 10 y 20 µM. El otro tiene una conductancia de 180 pS, es inhibido marcadamente por ATP (IC50 = 350 µM) y de manera similar por la glibenclamida. En el caso de las células del giro dentado del hipocampo el valor de conductancia del canal es de 27 pS, se inhibe por ATP y SU (20 100 µM para tolbutamida y 10 µM para glibenclamida) (Pelletier et al., 2000). Experimentos realizados en nuestro laboratorio evidenciaron, en neuronas de hipocampo de rata en cultivo primario, dos canales en la configuración “cell-attached” con conductancias de 41 y 133 pS. Además, en la configuración “inside-out” se observó otro canal con conductancia de 230 pS (Velasco et al.. 2006). Se han reportado en la literatura todos los posibles patrones de coexpresión de Kir6.1 ó Kir6.2 y SUR1 ó SUR2A en diferentes poblaciones neuronales (Babenko, Aguilar-Bryan & Bryan, 1998) y por ingeniería genética se han generado ratones cuyas células poseen canales KATP deficientes en la subunidad Kir6.2 (knockout de Kir6.2), en los cuales la respuesta a glucosa y secresión de insulina es defectuosa (Miki et al. 2001) y un daño incrementado dramáticamente en neuronas de hipocampo después de una isquemia inducida (Sun, Feng, Miki, Seino & French, 2006). 29 El efecto de la diabetes sobre la región CA3 del hipocampo, la importancia de esta estructura en la memoria y el aprendizaje, así como la participación de los canales KATP en la LTP, apoyan la relevancia de estos últimos, ya que podrían modificarse en la diabetes y constituir un factor importante en el daño cognoscitivo. Por eso, estamos interesados en el estudio de sus propiedades biofísicas en este trastorno metabólico, pues hasta ahora las alteraciones de los canales KATP en la diabetes solamente se han estudiado en corazón (Smith & Wahler, 1996; Shimoni, Light, & French, 1998) y no en neuronas del SNC. Hipótesis Las propiedades biofísicas de los canales KATP se modifican como consecuencia de la diabetes experimental en neuronas piramidales CA3 del hipocampo de rata. Tabla 2. Propiedades de canales KATP en cerebro. Región cerebral Conductancia de (pS) rata Cuerpo 44 Sensibilidad al Sensibilidad a Referencias ATP # IC50 sulfonilureas (mM) # 2 Glib: 3 estriado IC50 (µM) Tolb: 50-100 30 Lee et al. 1998 Neocorteza* Hipocampo 47 0.130# Glib: 10-20 Jiang 200 0.350# Glib: 10 Haddad, 1997 -- -- Glib. 20 Zawar Tolb. 50 1999 y et al. 41, 133 -- -- Velasco et al. 230 -- Glib. 2.59 2006 27 -- Glib: 10 Pelletier et al. Tolb: 20-100 2000 Tolb: 1000 Erdemli -- 1 y Krnjevic, 1993 Hipotálamo 146 2-3# Glib:100 Ashford et al. 1990a Sustancia nigra 220 0.135# Glib: 10 Jiang et al. 1994 Glándula 26 2# Glib:0.1(nM)▲# Bernardi et al. pituitaria 74 30# (µM) Tolb: 12.5▲# 1993 -- Wu et al. 2000 *Trabajo realizado también en cerebro humano. Glib., glibenclamida. Tolb., tolbutamida. ▲ Medidos como inhibición del enlazamiento a sitios de unión de alta afinidad de [3H]glibenclamida. Objetivo general Evaluar si en ratas diabéticas inducidas con STZ, existen cambios en las propiedades biofísicas de los canales KATP presentes en la membrana de neuronas CA3 del hipocampo. Objetivos específicos 31 1. Implementar en el laboratorio la técnica de registro electrofisiológico en rebanadas de hipocampo. 2. Estudiar las siguientes propiedades de los canales KATP en neuronas CA3 del hipocampo de rata: 2.1.Conductancia unitaria. 2.2. Permeabilidad al potasio. 2.3. Dependencia del voltaje. 2.4. Sensibilidad a la glucosa y el ATP. 3. Comparar las propiedades a que se refiere el objetivo 2 con las de los canales KATP de neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas inducida con STZ. 32 Materiales y Métodos Animales utilizados: Para el desarrollo del presente trabajo se usaron ratas macho de la cepa Wistar de 21 días de edad. Los animales se agruparon en controles e diabéticas inducidas experimentalmente. Inducción de la diabetes. Para inducir la diabetes experimental las ratas permanecieron en ayuno un periodo de 12 a 14 h, después del cual se les midió la concentración de glucosa en sangre y se les inyectó STZ vía I.P. a dosis única de 100 mg/kg de peso. La STZ se disolvió en solución amortiguadora de fosfatos salinos agitando en vortex durante 20 segundos y se ajustó el pH a 4.5 con ácido ascórbico 0.05M. Una vez inyectadas, las ratas se dejaron con alimento y agua a libre demanda. Se les midió la glucemia entre 5 y 7 días después de la inyección, colocando una gota de sangre obtenida de la cola del animal en un glucómetro digital (Accutrend, Roche Diagnostics, Inc.). Las concentraciones de glucosa en sangre fueron de 118±5 mg/dl (6.5±0.3 mM) en ratas control (n=20) y 425±80 mg/dl (23.5±4.4 mM) en ratas diabéticas (n=30). El criterio de inclusión para ratas diabéticas fue una concentración sanguínea de glucosa ≥ 250 mg/dl (13.7 mM). Obtención de rebanadas Una vez medida la concentración de glucosa, se sacrificaron las ratas. Se extrajo el cerebro y se colocó en solución Ringer (ver soluciones) a 4°C, burbujeada previamente con oxígeno. En esta condición se eliminaron el cerebelo y los polos frontales y se realizó un corte sagital. La duración de estas maniobras fue siempre menor a dos minutos. De los dos bloques hemisféricos, utilizando un vibratomo (Lancer series 1000, Technical Products International, USA), se obtuvieron cortes coronales de la zona del hipocampo, con espesores de 250 a 300 µm. Posteriormente las rebanadas se incubaron durante una hora a 25 °C en solución Ringer oxigenada, usando un baño maría con agitación continua (Julabo 33 SW 20, Julabo Labortechnik, Germany). Finalmente, las rebanadas se transfirieron a una cámara con perfusión para realizar los registros electrofisiológicos. Registros electrofisiológicos Considerando sus características morfológicas y su tamaño, se realizó la identificación de las neuronas piramidales de la zona CA3 del hipocampo de manera visual con un microscopio de luz Olympus (modelo BX50WI, Olympus Optical Co., Japan). Se utilizó un aumento total de 400X. Se seleccionaron células con un soma piramidal o semiesférico, de núcleo grande y visible. Las rebanadas fueron perfundidas todo el tiempo con solución Ringer. Todos los registros fueron hechos en la misma zona anatómica a temperatura ambiente (20-22°C). Para registrar los potenciales de acción y la actividad unitaria de los canales de potasio sensibles a ATP en las rebanadas de hipocampo, se utilizó la técnica electrofisiológica “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Las configuraciones usadas fueron célula adherida ó “cell-attached”, célula completa ó “whole-cell” y el interior de la membrana expuesto ó “inside-out”. Los potenciales de acción fueron registrados bajo condiciones de fijación de corriente en la configuración “whole-cell”. Las pipetas utilizadas fueron preparadas con capilares de vidrio borosilicato (1.5 y 0.86 mm, diámetros externo e interno respectivamente; Sutter Instruments Co., Novato, CA, USA). Las puntas fueron pulidas en una microforja (Narishige, Scientific Instrument Lab, Tokio, Japan). Al llenar las pipetas con solución de alto-K (ver soluciones) tenían una resistencia de 2-5 MΏ para la configuración de “whole cell” y de 8-10 MΩ para “cell attached” e “inside-out”. La señal se registró utilizando la pipeta de “patch” conectada a un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). A su vez, el amplificador estaba conectado a un osciloscopio a través del cual la señal fue monitoreada durante todo el experimento. Las corrientes unitarias fueron filtradas, Bessel pasabajos de 2 kHz, amplificadas y muestreadas a 10 kHz, usando un convertidor analógico-digital DigiData 1200 (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). En la Figura 5 se muestra un esquema del dispositivo experimental utilizado. La adquisición y el análisis de las corrientes unitarias se realizó por medio de una computadora Pentium utilizando el programa pClamp 8 (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). Los valores de la probabilidad de apertura (Po) en el estado estable fueron obtenidos usando el método 34 descrito por Quayle et al. (1988). Para calcular la Po se midió el tiempo (tj) correspondiente a los diferentes niveles de corriente j=1, 2, 3, …..N, para después obtener N el valor de la probabilidad mediante la fórmula PO = ∑ t jj TN j =1 , donde T es la duración del registro y N es el número de canales activos en el parche. Se usaron registros con duración de 30 y 390 segundos. Para obtener las curvas corriente-voltaje, se fijó el potencial de membrana a diferentes valores y se midió la corriente unitaria ajustando una función gaussiana a los histogramas de amplitud de la corriente, usando el método de mínimos cuadrados. Se estudió la cinética de la apertura y cierre de los canales unitarios en registros en los que se observó un solo canal activo. Las distribuciones de los tiempos de apertura y de cierre fueron ajustadas con funciones exponenciales mediante el método de máxima verosimilitud (Colquhuoun & Sigworth, 1983). Figura 5. Esquema que muestra el dispositivo experimental utilizado para la obtención de los registros electrofisiológicos. Las rebanadas de hipocampo fueron colocadas en la cámara de registro, la cual estaba conectada a tierra a través de un electrodo de Ag/AgCl2. Para el registro de los potenciales y corrientes unitarias se utilizó una micropipeta, conectada a un amplificador de “patch”, la señal amplificada se envió a un osciloscopio para ser monitoreada durante todo el experimento. A su vez la señal se enviaba a un convertidor analógico digital (A/D) y de éste a una computadora para su almacenamiento y análisis posterior. El microscopio estaba conectado a una cámara infrarroja de TV, la cual enviaba la imagen a un monitor de TV. 35 Soluciones La composición de las soluciones utilizadas en la obtención de las rebanadas de hipocampo y en las distintas configuraciones de “patch clamp” se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Composición de las soluciones experimentales (mM) Ringer alto-K+EGTA alto-K (interna) (externa) NaCl 130 - - KCl 3 140 140 CaCl2 1 - - MgCl2 1 1 1 Hepes 10 10 10 EGTA - 2 D-Glucosa 20 La solución Ringer se ajustó a un pH de 7.4 con NaOH. La solución alto-K+EGTA y alto-K se ajustaron con KOH a un pH de 7.2 y 7.4, respectivamente. Las soluciones experimentales fueron preparadas siempre inmediatamente antes de ser utilizadas. Todas las soluciones fueron filtradas a través de un filtro millipore de 0.22 µm. Todos los experimentos fueron hechos con perfusión continua de las rebanadas con solución Ringer. Para estudiar la sensibilidad del canal a la glucosa, ésta fue eliminada de la solución de baño. Las soluciones se perfundieron con un sistema de perfusión provisto de una válvula electrónica de tres vías, a través del cual el volumen de la cámara de registro se mantenía constante. La velocidad de recambio fue de 0.75-1 ml/min. Para el registro de las corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, después de hacer el sello en “cell-attached”, la solución Ringer con glucosa era cambiada por la solución alto-K+EGTA para obtener concentraciones de potasio simétricas ([Ki] = [Ke] = 140 mM), (véase tabla 3). Posteriormente se retiró la pipeta de la célula dejando ahora la 36 parte interna de la membrana expuesta a la solución de alto-K+EGTA. El ATP y la glibenclamida se disolvieron en solución de alto-K+EGTA. Para los experimentos dosis-respuesta se utilizó un sistema de superfusion DAD-12 (ALA Scientific Instruments, Inc., USA) el cual consta de 12 válvulas que desembocan en una micropipeta de cuarzo, la cual tiene un diámetro interno de 100 µm. Este sistema se controla con una microcomputadora laptop, permitiendo programar una secuencia que controla la presión y la duración de la perfusión con cada solución. La pipeta de cuarzo se colocó en un área muy cercana al parche, permitiendo bañar el parche de manera directa, de tal manera que el efecto de cualquier solución se lleva a cabo en fracciones de segundo, sin requerir el recambio total de la cámara. El parche era bañado por la parte interna de la membrana de manera directa con las soluciones experimentales, mientras que las rebanadas eran bañadas todo el tiempo con la solución Ringer. Para experimentos de la curva dosis-respuesta se preparó una solución madre de ATP en solución alto-K+EGTA a una concentración de 10 mM, el pH se ajustó a 7.2 con KOH. De esta solución se hicieron diluciones a concentraciones finales de 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 3 mM de ATP, en volúmenes de 5 ml. Para los experimentos con glibenclamida se preparó una solución madre de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO), de la cual se hizo una dilución en solución alto-K+EGTA para tener un volumen de 5 ml a una concentración de 100 µM (pH= 7.2). Todas las sustancias y fármacos fueron obtenidos de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA. Rebanadas delgadas para observación de la morfología celular Con el propósito de observar a mayor detalle las características morfológicas y la preservación de la zona de interés (CA3 de hipocampo), así como comparar forma y tamaño de las células piramidales con las de las células gliales en la misma zona, se realizaron cortes de 150 µm en el vibratomo y de 40 a 50 µm en un criotomo (Leica CM 1800, Leica Microsystems, Inc. Depew, NY USA). Estos cortes se tiñeron con azul de metileno al 1 % en agua durante 2 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se lavaron con agua desionizada, se observaron al microscopio de luz y se fotografiaron (véase Figura 6). 37 Resultados En este trabajo se presentan los resultados del estudio de las propiedades biofísicas de los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) en neuronas de la zona CA3 del hipocampo de ratas con diabetes inducida, comparadas con las propiedades de neuronas de ratas sanas (control). Para ello se realizaron series de experimentos para: 1. Identificar las neuronas CA3 de hipocampo por medio de su morfología y del patrón de descarga de potenciales de acción en neuronas de ratas sanas. 2. Estudiar los siguientes aspectos de la actividad de los canales KATP en neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas y sanas: 2.1. Efecto de la glucosa. 2.2. Permeabilidad al potasio y conductancia unitaria. 2.3. Dependencia de voltaje. 2.4. Sensibilidad al ATP. 2.5. Efecto de la glibenclamida. 1. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas control Ubicación de las neuronas CA3 en rebanadas del hipocampo. Como un control de la calidad de las rebanadas obtenidas de hipocampo de rata y para garantizar que el procedimiento de obtención fue el adecuado para tener una buena preservación neuronal, se obtuvieron rebanadas de hipocampo, las cuales se tiñeron con azul de metileno, se lavaron con agua desionizada para quitar el exceso de colorante y se observaron al microscopio de luz. La Figura 6 muestra un corte coronal de cerebro de rata teñido con azul de metileno, exponiendo el hipocampo y sus distintas zonas. Una amplificación de la zona CA3 permitió ver con mayor detalle las células presentes (véase Figura 6). En ella, se observan células de forma piramidal o semiesférica con el soma de diámetro mayor entre 24 y 28 µm, en algunas se aprecia el núcleo. También se observan otras células de menor tamaño (8-12 µm) que corresponden a las células gliales. 38 A 500 µm B 50 µ m Figura 6. Hipocampo de rata teñido con azul de metileno. A. Corte coronal de hipocampo de 150 µm de espesor, mostrando las distintas zonas del hipocampo. B. Región CA3 en la que se observan neuronas piramidales y células gliales. En este caso el espesor del corte fue de 40 µm para mejor visualización. 39 Potenciales de acción en neuronas CA3 del hipocampo. La siguiente serie de experimentos se centró en la obtención de registros de potenciales de acción para observar el patrón de descarga propio de neuronas piramidales CA3 del hipocampo de ratas. Esto permite asegurar que las células selecciondas correspondan a neuronas piramidales y no a otro tipo de neuronas ubicadas en el hipocampo o a células gliales. Para ello, los registros se realizaron con la técnica “wholecell” “patch-clamp” en el modo fijación de corriente usando Ringer como solución extracelular y la solución alto-K para llenar las pipetas (veáse Tabla 3). Se encontró que el potencial de membrana en reposo fue de -55 ± 5 mV (n=3). En la Figura 7 se muestran registros representativos de potenciales de acción espontáneos (véase Figura 7 A) y provocados al aplicar un pulso de corriente (véase Figura 7 B). En contraste, las células gliales mostraron potenciales de membrana en reposo más negativos, -70 ± 2 mV (n=5) y fallaron en generar potenciales de acción. A Vm (mV) 50 0 -50 -100 10 ms Vm (mV) B 50 0 -50 -100 0.2 nA 100 ms Figura 7. Potenciales de acción característicos de las neuronas piramidales CA3. Potenciales de acción espontáneos (A) y ráfaga de potenciales de acción, inducida por un pulso despolarizante de corriente de 0.2 nA de intensidad (B). Los valores obtenidos fueron de 126 mV de amplitud y 0.98 ms de duración. Las rebanadas fueron perfundidas con solución Ringer-Glucosa (veáse Tabla 3). 40 Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+. En la segunda fase de experimentos, el objetivo fue determinar la presencia de canales de potasio sensibles a glucosa. Se registraron corrientes unitarias en la configuración “cellattached”. Las pipetas se llenaron con la solución alto-K. Cuando las rebanadas fueron perfundidas con solución Ringer no se observó actividad de canales unitarios (véase Figura 8, trazo superior). Sin embargo, cuando la glucosa fue removida del fluido extracelular se observó actividad de canales de potasio (véase Figura 8, trazos inferiores). Como se aprecia, existe una relación inversa entre el potencial de la pipeta y el tiempo de apertura del canal. Figura 8. Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+. Registro de corrientes unitarias de neurona CA3 del hipocampo en la configuración “cell-attached”. En el trazo superior la rebanada fue bañada con solución Ringer (glucosa 20 mM). En los trazos inferiores los registros se obtuvieron después de quitar la glucosa del medio extracelular, a diferentes potenciales de pipeta (Vp) indicados a la derecha de cada trazo. Las probabilidades de apertura (Po) y los niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal están indicados a la izquierda. La pipeta se llenó con la solución alto-K. 41 Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje de los canales de K+ que mostraron sensibilidad a glucosa en la condición “cell-attached”. Usando la configuración “cell-attached” se observaron corrientes unitarias con diferente amplitud y probabilidad de apertura al variar el potencial de la pipeta. El análisis estadístico permitió caracterizar la actividad de los canales unitarios registrados en cada una de las condiciones experimentales. También se caracterizó la actividad de los canales de acuerdo a su conductancia. Esta última se determinó midiendo la amplitud media de las corrientes a potenciales de pipeta entre -100 y 40 mV, con incrementos de 20 mV. Los valores obtenidos se ajustaron a una línea recta. La relación IK-V fue lineal en el rango mencionado. Un histograma representativo de la amplitud de la corriente se muestra en la Figura 9 A. El valor de la conductancia unitaria fue de 170 ± 3 pS (n=7) (véase Figura 9 B). La relación IK-V obtenida se describe por la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz: I K = PK F 2 VP [K]o e FVP RT - [K]i RT e FVP RT - 1 (1) Donde PK es la permeabilidad del canal a los iones K+ y VP el potencial de la pipeta; R es la constante de los gases R=8.314 J/molK, T la temperatura absoluta y F la constante de Faraday. El valor de la permeabilidad (PK) obtenido por ajuste de los datos experimentales a la ecuación (1) fue de 3.86x10-13 cm/s. 42 Número de Observaciones A 200 150 100 50 0 8 10 12 14 16 Amplitud (pA) B -100 IP(pA) -80 -60 -40 5 -20 20 -5 40 VP(mV) -10 -15 -20 Figura 9. Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a glucosa en la configuración “cell-attached”. A. Histograma representativo de la amplitud de la corriente y el ajuste de los datos a la ecuación de Gauss (VP = -40 mV). Construido a partir de los registros mostrados en la Figura 8. B. Relación corriente-voltaje para el canal. La línea recta representa el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de GoldmanHodgkin-Katz. La pendiente determina la conductancia del canal (170 pS). Los datos son presentados como media ± error estándar (n=7). 43 Uno de los parámetros electrofisiológicos que se estudiaron para el canal de potasio sensible a glucosa en estudio fue su dependencia al voltaje. Al registrar las corrientes unitarias se observó que la actividad del canal es mayor a potenciales de pipeta positivos que a potenciales negativos, por lo que se determinó la relación entre la actividad del canal y el potencial de la pipeta. Para ello se ajustaron los valores experimentales de Po, obtenidos a diferentes potenciales de pipeta, con la ecuación de Boltzmann, empleada comúnmente para describir la sensibilidad de los canales iónicos al voltaje (Jiang et al, 1994): ( Po = 1 + e ) (V1/2 − VP ) k −1 (2) Recordando, Po es el valor de la probabilidad de apertura obtenido experimentalmente a un potencial de pipeta (Vp). V1/2 es el valor del potencial de la pipeta al cual Po alcanza el 50% de su valor máximo y k es una medida de la sensibilidad al voltaje (el número de e-veces que Po se incrementa). Los parámetros obtenidos para este canal fueron: El potencial de activación medio (V1/2) = -79±1 mV y el valor de k = 11.9±0.7 mV (véase Figura 10). Obsérvese que Po se incrementa cuando el voltaje en la pipeta aumenta. Además, se construyeron histogramas de apertura y cierre del canal a diferentes potenciales de pipeta y se ajustaron a una ecuación exponencial (véase Figura 11 A). A partir de los ajustes se obtuvieron las constantes de tiempo de apertura y cierre del canal en función del potencial de la pipeta (véase Figura 11 B). Este resultado muestra que el aumento en la probabilidad de apertura con la despolarización se debe al aumento del tiempo de permanencia en el estado abierto y a la disminución de los tiempos en el estado cerrado. 44 Figura 10. Actividad de los canales de KATP en el estado estable y cinética de su dependencia al voltaje. Probabilidad de apertura (Po) para un canal de K+ dependiente de ATP en función del potencial de la pipeta. La línea curva corresponde a los valores experimentales de Po ajustados a la ecuación de Boltzmann. 45 Figura 11. Cinética de los tiempos de apertura y cierre para el canal de potasio sensible a glucosa. A. Histogramas típicos de los tiempos de apertura y cierre (Vp = -60 mV). Las líneas curvas corresponden al ajuste de los valores experimentales a una ecuación exponencial. B. Dependencia de voltaje de las constantes de apertura y cierre. Los datos se presentan como media ± EE (n = 3). Obsérvese que el eje de las ordenadas tiene escala logarítmica. Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje en condiciones de K+ isométrico. Con el propósito de obtener los parámetros biofísicos de los canales de K+ en condiciones de K+ isométrico ([Ki] = [Ke] = 140 mM), se hizo una serie de experimentos para registrar corrientes unitarias con la técnica de “patch-clamp” en la configuración 46 “inside-out”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con la solución alto-K+EGTA. En estas condiciones en algunos sellos se presentó un fenómeno conocido como run-down ó disminución y/o desaparición temporal de la actividad de los canales de K+. En la Figura 12 se muestra un registro característico de las corrientes unitarias en un parche que presentó run-down; la actividad del canal pudo ser restablecida después de aprox. 1 min al añadir ATP a una concentración baja (50 µM) en la cara intracelular del parche de membrana, ya que el efecto del ATP depende del estado operativo del canal. Este fenómeno se debe posiblemente a los cambios en el microambiente al momento del desprendimiento del parche; se optó por analizar solamente los parches que no presentaron este fenómeno. En la Figura 13 se muestran registros típicos de corrientes unitarias a diferentes potenciales de membrana en la configuración “inside-out” en condiciones de potasio simétrico. Figura 12. Actividad unitaria de los canales KATP y efecto “run down”. Registro de corrientes unitarias de canales KATP en la configuración “cell-attached” Antes del desprendimiento la rebanada se perfundió con solución Ringer con glucosa. Nótese la pérdida de la actividad de los canales. Al desprendimiento del parche para el registro en configuración “inside-out”, se cambió a solución de alto-K+EGTA con condiciones isométricas, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna, Tabla 3). Al agregar el ATP a concentración de 0.05 mM (flecha) se observa la reaparición de la actividad del canal. Los registros fueron adquiridos con la pipeta llena con solución externa (Tabla 3) en las dos configuraciones, a un potencial de 40mV. A partir de tres registros similares a los de la Figura 13 se obtuvo la relación corrientevoltaje. Del ajuste de una recta a los valores de corriente para diferentes potenciales de membrana se obtuvo el valor para la conductancia, correspondiendo a 178.5±8.0 pS para 47 potenciales de membrana negativos (véase Figura 14). Se puede observar que la corriente mostró una rectificación entrante pequeña. Al hacer el ajuste de la ecuación de GoldmanHodgkin-Katz (veáse Ecuación 1) a los datos experimentales de la relación corrientevoltaje, se obtuvo una permeabilidad al K+ de 3.84±0.33x10-13 cm/s. Los valores de conductancia y permeabilidad fueron similares a los valores encontrados en la configuración “cell-attached”. Figura 13. Actividad unitaria de canales KATP de neuronas hipocampales CA3. Se muestran registros de corrientes unitarias obtenidos en la configuración “inside-out” a diferentes potenciales de membrana, indicados en mV a la derecha de los trazos. Los niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal se indican a la izquierda de cada registro. La rebanada se perfundió con solución de alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el potasio, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó con solución de alto-K (solución externa). 48 Figura 14. Relación corriente-voltaje de los canales KATP obtenidos de neuronas hipocampales CA3. La gráfica se construyó a partir de registros similares a los mostrados en la Figura 13. La línea continua representa el ajuste de los valores experimentales a la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Los datos fueron obtenidos de tres parches de membrana distintos. Note la ligera rectificación para los potenciales positivos. La rebanada se perfundió con solución isométrica de alto-K+EGTA, [K+]e= [ K+]i= 140 mM (solución interna). Las pipetas se llenaron con solución de alto-K (externa). Para describir la dependencia de la actividad del canal al voltaje, se ajustó la ecuación de Boltzmann (veáse Ecuación 2) a los valores experimentales de Po a diferentes potenciales de membrana obtenidos de tres parches. La relación Po-Vm y la curva ajustada se muestran en la Figura 15. En este caso el potencial de activación medio (V1/2) fue de 2.1 ± 0.6 mV y el valor de k fue de 11.1 ± 0.3 mV. 49 Figura 15. Cinética de la dependencia de voltaje de los canales de KATP de neuronas CA3 de hipocampo. Se calculó la probabilidad de apertura (Po) para los canales KATP en función del potencial de membrana. Se utilizaron registros obtenidos en la configuración “inside-out”. La curva corresponde al ajuste de los valores experimentales de Po a la ecuación de Boltzmann. La probabilidad de apertura aumenta a potenciales positivos de membrana. Los datos se obtuvieron de tres parches de membrana distintos. La rebanada se perfundió con solución de alto-K+EGTA, con condiciones isométricas, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó con alto-K (solución externa). 50 Sensibilidad de los canales de K+ sensibles a glucosa al ATP. Con la intención de tener evidencia de la sensibilidad al ATP de los canales de K+, se realizó otra serie de experimentos en rebanadas de hipocampo de ratas, diseñados para registrar corrientes unitarias con la técnica de “patch-clamp” en la configuración “insideout”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con ATP disuelto a diferentes concentraciones (0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 y 1 mM) en la solución altoK+EGTA. Se muestran registros típicos en la Figura 16 A. En todos los parches examinados, se encontró que en neuronas control la probabilidad de estado abierto bajó notablemente a la concentración de 300 µM de ATP y la actividad de los canales fue totalmente abolida a 1 mM del mismo nucleótido. Se obtuvo la relación dosis-respuesta para el bloqueo de la actividad del canal con ATP. La Po obtenida para cada una de las concentraciones de ATP se ajustó a la ecuación de Hill: Po P o max 1 = ⎞⎟ 1 + ⎛⎜ [ ATP ] KD⎠ ⎝ h (3) Donde Pomax es la probabilidad de apertura máxima; [ATP] es la concentración interna de ATP, KD es la constante de disociación, que representa la concentración a la cual la Po disminuye al 50% de la Pomax y h es el coeficiente de Hill, este valor indica el número de moléculas de ATP que se unen al canal para producir el bloqueo de la actividad. En la Figura 16 B se muestra la curva dosis-respuesta obtenida para el canal de K+ a un potencial de membrana de 40 mV y la curva ajustada con la ecuación de Hill. La concentración de ATP que induce el 50% de la inhibición de la actividad del canal (KD) fue de 0.25 ± 0.01 mM. El coeficiente de Hill (h) fue de 2.4 ± 0.2. Lo anterior sugiere que la inhibición del canal resulta del enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al canal KATP. 51 Figura 16. Sensibilidad de los canales membranales KATP de neuronas CA3 del hipocampo al ATP. A. Registros representativos de corrientes unitarias de canales KATP a diferentes concentraciones de ATP, indicadas en mM a la izquierda de los registros. El registro se obtuvo en la configuración “inside-out” a un potencial de membrana de 40 mV. Nótese el bloqueo total de la actividad a la concentración 1 mM del nucleótido. B. Relación entre la probabilidad de apertura y la concentración de ATP. La línea continua representa el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de Hill. Los datos son presentados como media ± EE (n = 3). Los parches de membrana fueron perfundidos con la solución de alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el potasio [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna) adicionada de ATP a las concentraciones indicadas. La pipeta se llenó con solución de alto-K (externa). 52 Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de K+ sensibles al ATP. Se realizó otra serie de experimentos registrando corrientes unitarias en parches de membrana en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara interna de la membrana con la solución alto-K+EGTA en la que se disolvió glibenclamida a concentración de 100 µM. La Figura 17, muestra el bloqueo de la actividad del canal producido por la aplicación de glibenclamida en la cara interna de la membrana. Este resultado proporciona otra evidencia de que los canales estudiados comparten propiedades con los canales KATP. 0 Gl ib 100 µM Gli b 20 pA Lavado 200 ms Figura 17. Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales KATP de membrana en neuronas CA3 de hipocampo. Se muestran los registros de corrientes unitarias de canales KATP obtenidos empleando la configuración “inside-out”. La actividad del canal en condiciones control (trazo superior) fue bloqueada después de agregar 100 µM de glibenclamida (trazo medio). Después del lavado de la sulfonilurea la actividad del canal fue recuperada (trazo inferior). El potencial de membrana fue de 40 mV. Los parches se perfundieron con soluciones isométricas de alto-K+EGTA, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna) y solución de alto-K+EGTA más glibenclamida. La pipeta se llenó con alto-K (solución externa). 53 2. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+. La siguiente parte de este trabajo consistió en indagar los diferentes parámetros biofísicos de los canales KATP, pero ahora en neuronas de ratas con diabetes inducida experimentalmente. Para conocer si la actividad de los canales de potasio también es sensible a la glucosa en condición diabética, se registraron corrientes unitarias de parches de membrana en la configuración “cell-attached”, las neuronas en las rebanadas fueron perfundidas con solución Ringer con y sin glucosa. La Figura 18 muestra registros de corrientes unitarias en parches de membranas de neuronas control (véanse Figuras 18 A y 18 C) y diabéticas (véanse Figuras 18 B y 18 D). En la Figura 18 A en la configuración “cell-attached” se puede observar que la glucosa extracelular (20 mM) suprime la actividad del canal; mientras que en la neurona diabética no se observó bloqueo del canal (véase Figura 18 B). Se aumentó la concentración de glucosa extracelular hasta 50 mM; aún así no se observó inhibición de la actividad de los canales de potasio. En estos experimentos, después de separar de la célula el parche de membrana hasta obtener la configuración “inside-out”, los canales de K+ se bloquearon al agregar ATP (1 mM) en la cara interna de la membrana en neuronas control (véase Figura 18 C) y se inhibieron en las diabéticas (véase Figura 18 D). 54 DIABETES CONTROL A B 0 mM GLUCOSA O O C C 20 mM GLUCOSA 20 mM GLUCOSA O O C C C 0 mM GLUCOSA 0 mM ATP D O O C C 1 mM ATP 0 mM ATP 1 mM ATP O C C 10 pA O 200 ms Figura 18. Efecto de la glucosa sobre la actividad de canales unitarios de neuronas hipocampales CA3 de ratas diabéticas. En neuronas de ratas control (A) y diabéticas (B) se registró la actividad unitaria de canales KATP en la configuración “cell-attached”; en ausencia (arriba) y en presencia de 20 mM de glucosa (abajo). La actividad unitaria del canal en la condición diabética no se inhibe aún en presencia de glucosa. Registros de la actividad unitaria de canales KATP en el mismo parche, pero ahora en la configuración “inside-out” obtenidos de ratas control (C) y diabética (D), en ausencia (arriba) y en presencia (abajo) de 1 mM de ATP. Obsérvese el bloqueo total de la actividad en presencia del nucleótido en el control y una inhibición en la diabética. Los parches fueron perfundidos con soluciones isométricas de alto-K+EGTA, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna), a la cual le fue adicionado el ATP. La pipeta se llenó con alto-K (solución externa) en ambas configuraciones. 55 Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje en condiciones de K+ simétrico. Con el propósito de obtener los parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas diabéticas, en condiciones de K+ simétrico ([Ki] = [Ke] = 140 mM), se registraron corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con la solución alto-K+EGTA. En la Figura 19 se muestran registros típicos de corrientes unitarias a diferentes potenciales de membrana en la configuración “inside-out” en condiciones de potasio simétrico. Se puede apreciar un aumento en la amplitud de la corriente saliente y en la apertura del canal para potenciales positivos. Figura 19. Actividad unitaria de canales KATP de neuronas CA3 de hipocampo de rata diabética. Registro de corrientes unitarias adquiridos en la configuración “inside-out” a diferentes potenciales de membrana, indicados a la derecha de los trazos. A la izquierda de los mismos se indican los niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal. La rebanada se perfundió con solución alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el potasio, 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó con solución de alto-K, (externa). 56 La relación corriente-voltaje mostró un valor de conductancia de 177.4±6.2 pS (n = 3). La Figura 20 exhibe las curvas correspondientes a neuronas control y diabéticas. Se puede observar que las corrientes salientes, a potenciales de membrana superiores a 40 mV, fueron mayores en neuronas diabéticas que en neuronas control, manteniéndose una relación lineal en el primer caso. Al hacer el ajuste de la ecuación de Goldman-HodgkinKatz (ecuación 1) a los datos experimentales de la relación corriente-voltaje, se obtuvo una permeabilidad al K+ de 3.74±0.23x10-13 cm/s para la condición diabética. Los valores de conductancia y permeabilidad fueron similares a los encontrados en la condición control. Figura 20. Relación corriente-voltaje de los canales KATP de neuronas CA3 de rata diabética. La curva I-V se construyó a partir de los registros de tres parches de membrana distintos, obtenidos en la configuración “inside-out”. La línea continua representa el ajuste de los valores experimentales a la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Destaca la ausencia de rectificación para potenciales positivos en la condición diabética. Las rebanadas se perfundieron con solución interna, [K+]i = 140 mM. La pipeta se llenó con solución externa isométrica de alto-K. 57 Para describir la dependencia a voltaje de la actividad del canal, similar a lo realizado con las preparaciones control, se ajustó la ecuación de Boltzmann (véase Ecuación 2) a los valores experimentales de Po a diferentes potenciales de membrana. La relación Po-Vm y la curva ajustada se muestran en la Figura 21. Al comparar esta curva con la condición control no hubo un cambio significativo. En este caso el potencial de activación medio (V1/2) fue de 5.3 ± 0.6 mV y k tuvo un valor de 11.02 ± 0.4 mV (n = 3). Tanto V1/2 como k fueron muy similares a los encontrados en neuronas de ratas control. Figura 21. Dependencia al voltaje de la actividad de los canales KATP de neuronas CA3 de hipocampo de la rata diabética. A partir de registros en la configuración “insideout” se obtuvo la Po en función del potencial de la membrana. La línea corresponde al ajuste de los valores experimentales de Po a la ecuación de Boltzmann. Los datos fueron obtenidos de tres parches de membrana distintos. La rebanada se perfundió con solución alto-K+EGTA en condiciones isométricas a 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó con solución de alto-K, (externa). 58 Sensibilidad al ATP. Para estudiar la sensibilidad al ATP de los canales KATP, en neuronas de ratas diabéticas se registraron corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con ATP disuelto en la solución alto-K+EGTA a diferentes concentraciones (0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 y 5 mM). Los registros de corriente a diferentes concentraciones de ATP se muestran en la Figura 22 A. En todos los parches examinados, se encontró que la probabilidad del estado abierto disminuyó notablemente a la concentración de 1 mM de ATP y que la actividad de los canales se abolió totalmente a 3 mM de ATP. La probabilidad de apertura del canal obtenida para cada una de las concentraciones de ATP se ajustó la ecuación de Hill (veáse Ecuación 3). La Figura 22 B muestra la relación dosis-respuesta de la actividad del canal. Al ajustar los valores experimentales de Po a la ecuación de Hill se encontró que la concentración de ATP que inducía el 50% de la inhibición de la actividad del canal (KD) fue de 0.59 ± 0.02 mM. El valor de la constante de disociación (KD) para los canales KATP de neuronas diabéticas aumentó aproximadamente al doble del valor obtenido para neuronas control (véase Figura 22 B). Es decir, la sensibilidad al ATP de los canales KATP resultó menor que en las neuronas control. En cambio el coeficiente de Hill (h = 2.1 ± 0.1, n = 3) en las neuronas diabéticas no fue significativamente diferente al de los controles. Lo anterior sugiere que, al igual que en ratas control, la inhibición probablemente resulta del enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al canal. 59 A ATP (mM) 0 0.3 10 pA 1 3 100 ms B 1.0 0.8 Po/Pomax 0.6 0.4 Control Diabetes 0.2 0.0 0.01 0.1 1 [ATP] mM Figura 22. Sensibilidad al ATP de los canales KATP de membranas neuronales CA3 de la rata diabética. Datos obtenidos en configuración “inside-out”. A. Registros representativos de corrientes unitarias en ausencia (trazo superior) y a diferentes concentraciones de ATP (indicadas a la izquierda de los tres trazos inferiores). El valor de potencial de membrana fue de 40 mV. Nótese el bloqueo total de la actividad a 3 mM. B. Relación entre la probabilidad de apertura y la concentración de ATP en neuronas de ratas dibéticas (S) y ratas control (O). Nótese la disminución de la sensibilidad en la condición diabética. Los datos (B) fueron obtenidos de tres parches de membrana distintos. Los parches de membrana fueron perfundidos con la solución de alto-K+EGTA (solución interna) en condiciones isométricas, [K+]e = [K+]i = 140 mM. La pipeta se llenó con solución de alto-K (externa). 60 Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de K+ sensibles al ATP. Para verificar si los canales de K+ sensibles a glucosa y ATP son sensibles a la glibenclamida en ratas diabéticas, se registraron corrientes unitarias en parches de membrana en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara interna de la membrana con la solución alto-K+EGTA en la que se disolvió glibenclamida a una concentración de 100 µM. La Figura 23, muestra el bloqueo de la actividad de los canales en un parche de membrana por este fármaco. Es decir que en la condición diabética los canales KATP son bloqueados por la glibenclamida de manera similar a como ocurrió en las neuronas control. En la Tabla 4 se muestra un resumen de los valores de los parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas de hipocampo de ratas control y diabéticas, obtenidos en la configuración “inside-out” en condiciones isométricas, [K+]e = [K+]i = 140 mM. 0 Glib 100 µM Glib 20 pA Lavado 2 00 ms Figura 23. Efecto de la glibenclamida en los canales KATP de membranas de neuronas CA3 de la rata diabética. En la configuración “inside-out” la actividad del canal (trazo superior) fue bloqueada después de agregar 100 µM de glibenclamida (trazo medio). El efecto se revirtió después del lavado de la sulfonilurea (trazo inferior). El potencial de membrana fue de 40 mV. Los parches fueron perfundidos con solución de alto-K+EGTA con condiciones isométricas para el potasio a 140 mM (solución interna), adicionada de glibenclamida cuando fue necesario. La pipeta se llenó con solución de alto-K (externa). 61 Tabla 4. Parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas CA3 de hipocampo. Dependencia de Voltaje Sensibilidad al ATP Control G pS 178.5±8.0 Rectificación entrante Sí PK 10-13 cm/s 3.84±0.33 V1/2 mV 2.1±0.6 k mV 11.1±0.3 Sensibilidad a la Glucosa Sí KD (*) mM 0.25±0.01 2.4±0.2 Diabetes 177.4±6.2 No 3.74±0.23 5.3±0.6 11.02±0.4 No 0.59±0.02 2.1±0.1 h (*) Los valores de la KD para el efecto inhibitorio del ATP sobre la actividad de los canales KATP en neuronas control y diabéticas fueron significativamente diferentes (p < 0.5). 62 Discusión En este trabajo se caracterizaron las propiedades biofísicas de canales KATP en neuronas CA3 del hipocampo de ratas sanas y los cambios en esas propiedades causados por la diabetes experimental. Los potenciales de membrana en reposo, la amplitud y la duración de los potenciales de acción, así como el patrón de descarga en las neuronas piramidales CA3, se estudió usando la configuración “whole-cell” de la técnica de “patch-clamp” (véase Figura 7). Los valores de amplitud y duración, así como la forma de los potenciales de acción fueron similares a los medidos con la técnica de electrodos intracelulares en neuronas CA1 de rebanadas de hipocampo de ratas de 3 a 4 semanas de edad (Isagai, Fujimura, Tanaka, Yamamoto & Higashi, 1999). Cabe mencionar que la duración de los potenciales de acción CA1 de ratas de una semana de edad, reportados por esos mismos autores, son a su vez similares a los registrados con la técnica de “patch clamp” en neuronas CA3, de rebanadas hipocampales de ratas de la misma edad, mantenidas en cultivo órgano-típico por 10 a 14 días (Raffaelli, Saviane, Mohajerani, Pedarzani & Cherubini, 2004). También son comparables a los de células piramidales CA1 (Zawar et al. 1999). La caracterización electrofisiológica mencionada evidenció que las células seleccionadas visualmente durante este trabajo, corresponden a neuronas piramidales y no a células gliales, ya que estas últimas no generan potenciales de acción (Zawar et al. 1999). Propiedades biofísicas de los canales KATP en neuronas piramidales CA3 del hipocampo. Las propiedades biofísicas de los canales KATP se estudiaron usando la configuración “cellattached” e “inside-out” de la técnica de “patch” antes mencionada. En particular, se determinó la conductancia unitaria, permeabilidad a K+, dependencia del voltaje y cinética, sensibilidad al ATP y glucosa y el bloqueo con glibenclamida. Esta es la primera vez que se describen estas propiedades en células piramidales CA3 en rebanadas de tejido. 63 En el sistema nervioso central se han encontrado canales KATP con diferentes conductancias en distintas regiones del cerebro, como el hipotálamo, la sustancia nigra y la neocorteza (Spanswick, Smith, Groppi, Logan & Ashford, 1997; Jiang et al. 1994; Jiang & Haddad, 1997). En hipocampo se han reportado canales KATP con conductancias de 10 y 100 pS (Tromba et al. 1992; 1994), así como de 37, 147 y 241 pS (Velasco et al. 2006), entre otros. En este trabajo se encontraron canales KATP en neuronas piramidales CA3 con una conductancia de 178 pS (véase Figura 14). La variación en las conductancias de los canales KATP puede deberse a la distinta composición de las subunidades (Kir 6.X y SURX) que conforman los canales en las diversas regiones del cerebro (Zawar et al. 1999), pues se sabe que existen distintas propiedades intrínsecas en las subunidades tanto de Kir6.X como de SURX (Yokoshiki, Sanagawa, Seki & Sperelakis, 1998). Así, cambios sutiles en la constitución de los residuos de aminoácidos pueden impactar en la función conductiva del canal. Además, se ha reportado que durante el desarrollo neuronal del hipocampo de rata se observaron canales KATP con mayor conductancia, infiriendo que esto podría contribuir a una menor resistencia de las neuronas maduras en las isquemias cerebrales (Acevedo, 2002). Los resultados de esta tesis indican que la permeabilidad de este canal a K+, en condiciones isométricas para este ión, fue de 3.84±0.33x10-13 cm/s. Hasta donde nos es posible conocer no existen datos previos en este tipo celular. Cuando se compara con la permeabilidad de otros canales de potasio, por ejemplo los descritos como BK para las neuronas del órgano X del acocil, de 2.3 x 10-13 cm/s (Lara, Acevedo & Onetti, 1999), el valor encontrado en las células piramidales es 34 % mayor e indica que es altamente selectivo para iones potasio. Se sabe que la compuerta de los canales KATP no depende del potencial de membrana, es decir es independiente de voltaje, en miocitos cardiacos (Noma & Takano, 1991) y en células β-pancreáticas (Cook & Hales, 1984; Gopalakrishnan, Janis & Triggle, 1993). Por otro lado, se han reportado canales KATP que sí son dependientes del voltaje en células de músculo esquelético (Spruce et al. 1985), en neuronas de sustancia nigra (Jiang et al. 1994) y células nerviosas hipocampales (Tromba et al. 1994). En el 2006, Velasco et al. reportaron canales KATP con conductancias de 37 y 241 pS que también fueron dependientes de voltaje y uno de 147 pS no dependiente de voltaje en neuronas hipocampales cultivadas. Los canales reportados por Jiang et al. tienen conductancias de 64 220 pS, mientras que los caracterizados por Tromba presentan 100 pS de conductancia. Los resultados presentados en este trabajo muestran que la actividad de los canales KATP de 178 pS de conductancia, son dependientes de voltaje de tal manera que la probabilidad de apertura aumenta con la despolarización del potencial de membrana aumentando el tiempo de permanencia en el estado abierto y disminuyendo los tiempos de cierre, tanto en la célula completa en la configuración de “cell-attached” (véase Figura 10) como en “insideout” (véase Figura 15). Lo anterior sugiere que pese a estar considerados como canales no dependientes de voltaje (Ashcroft, 2000) los canales KATP poseen aminoácidos cargados en la región transmembranal que podrían alterar conformacionalmente a la proteína del canal a mayor despolarización. Al estudiar la sensibilidad al ATP, utilizando la configuración “inside-out” y condiciones isométricas de potasio, se observó que el ATP bloqueó completamente la actividad de estos canales a una concentración de 1mM (véase Figura 16 A). Para medir la sensibilidad al ATP, se estudió la relación dosis-respuesta (véase Figura 16 B), en la que se encontró un una KD = 0.25 mM. Este valor ubica a los canales KATP dentro de los de tipo II de acuerdo a la clasificación propuesta por Ashcroft y Ashcroft (1990). Estos canales KATP tipo II son inhibidos por ATP a concentraciones del orden milimolar, a diferencia de los tipo I que son inhibidos por ATP a concentraciones del orden micro y nanomolar (Gopalakrishnan et al. 1993). Sin embargo, dentro de los tipo II existen diferencias en los valores de la KD para diferentes regiones del cerebro, las que van desde 0.1 hasta 10 mM de ATP (Schwanstecher & Bassen, 1997; Routh, McArdle, & Levin, 1997). Esto indica que existe variabilidad en la sensibilidad al ATP de los canales KATP, probablemente debida a la conformación del canal con diferentes subunidades y a las propiedades intrínsecas de cada una de ellas, ya que los canales KATP son sensores metabólicos y esta gama de canales es básica para la repuesta a modificaciones en el aporte de energía, incluyendo situaciones de estrés metabólico como la hiperglucemia (Gopalakrishnan et al. 1993; Tromba et al. 1994; Zawar et al. 1999). Esta bien establecido que las sulfonilureas son bloqueadores específicos de los canales KATP en células de cerebro de rata de cuerpo estriado, neocorteza, hipocampo, hipotálamo, sustancia nigra y glándula pituitaria (Lee et al. 1998; Jiang & Haddad, 1997; Zawar et al. 1999; Velasco et al. 2006; Pelletier et al. 2000; Ashford et al. 1990a; Jiang et al. 1994; Bernardi et al. 1993). La glibenclamida y la tolbutamida son los bloqueadores de elección 65 para caracterizar a los canales de K como sensibles al ATP, debido a su selectividad y a su enlace con la subunidad SUR del canal (Aguilar-Bryan & Bryan, 1999). En este trabajo la glibenclamida (100 µM) suprimió la actividad de los canales de K en neuronas CA3 de hipocampo de ratas (véase Figura 17), confirmando que efectivamente pertenecen a la familia de los canales KATP. Resultados similares se han reportado en neuronas cultivadas de hipocampo de rata (Velasco et al. 2006). Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje de los canales KATP en células piramidales CA3 del hipocampo de ratas diabéticas. Con el propósito de estudiar los posibles cambios producidos por la diabetes, se estudiaron las propiedades biofísicas de los canales KATP en células piramidales CA3 de ratas diabéticas: Conductancia unitaria, permeabilidad a K+ y dependencia del voltaje. En este trabajo no se encontró diferencia entre la conductancia del canal KATP, en la condición diabética y el valor encontrado en neuronas control. Esto sugiere que, en las condiciones experimentales utilizadas, la diabetes no afecta estructuralmente al canal KATP, al menos no de tal manera que modifique su conductancia. En la literatura existen varios reportes donde se da cuenta que modificaciones importantes del metabolismo celular tampoco se asocian a alteraciones en la conductancia de los canales KATP en células β pancreáticas, musculares ó neuronales (Branstrom, Corkey, Berggren & Larsson, 1997; Tricarico & Camerino, 1994; Murphy & Greenfield,1992), incluyendo a la diabetes entre las causales de las mencionadas modificaciones metabólicas (Smith & Wahler, 1996; Shimoni et al. 1998). La conductancia es una propiedad intrínseca del canal que depende de dos factores: la permeabilidad y la concentración de iones en las regiones vecinas al canal (Nicholls et al. 1992). Respecto a la permeabilidad, nuestros datos indican que la permeabilidad de los canales a K+ fue muy similar en las neuronas de rata diabética comparada con el valor obtenido en las neuronas de rata no diabética. En este caso se sugiere que los factores involucrados en el paso de los iones a través del canal, como son el filtro de selectividad y los aminoácidos cargados que conforman la zona del poro, no sufren modificación en las 66 neuronas de rata diabética. De tal manera que al no verse afectada la permeabilidad, tampoco se vería efecto de la diabetes en la conductancia del canal, como se discutió anteriormente. Una característica que posiblemente cambia en la condición diabética respecto al control es la ausencia de rectificación que presentan los canales KATP de neuronas de rata control. La figura 20 muestra la comparación de la curvas I-V de neuronas obtenidas de ratas con una de las dos condiciones de estudio. La rectificación entrante observada en la gráfica correspondiente a las neuronas de rata sana, no se presenta en las de rata diabética. Resultados similares han sido reportados en miocitos cardiacos de ratas diabéticas (Smith & Wahler, 1996), con la salvedad de que la subunidad SUR del canal es distinta y en otro trabajo realizado también en el tejido cardiaco no se reporta la pérdida de la rectificación (Shimoni et al. 1998). Este último autor atribuye esta discrepancia con el anterior a diferencias metodológicas entre los estudios, particularmente a la ausencia o presencia de magnesio, respectivamente. Se sabe que el magnesio es un factor clave en la regulación de la rectificación. Sin embargo, es necesario enfatizar que en los resultados que aquí se reportan, la ausencia de rectificación en la condición diabética ocurrió en presencia de magnesio. Con estas evidencias se puede descartar que el efecto pudiese deberse a una disminución en la concentración de magnesio más abajo de las condiciones fisiológicas (≈0.7 mM) como se ha propuesto en células ventriculares (Babenko, Gonzalez, AguilarBryan & Bryan, 1998). Sin embargo, no se pueden descartar efectos de largo plazo, asociados en alguna forma al nivel de magnesio, ya que se ha descrito que las personas diabéticas presentan hipomagnesemia (Sales & Pedrosa, 2006) y que algunas de las manifestaciones de la diabetes pueden ser mejoradas con el uso de este elemento de manera suplemental (Song, He, Levitan, Manson & Liu, 2006). Esta posibilidad también es apoyada por las evidencias de que la acción estimulatoria del SUR1 sobre el poro del Kir y consecuentemente sobre la probabilidad de apertura depende del nivel basal de magnesionucleótido (Babenko et al. 1998). La posible carencia de rectificación entrante observada en las células nerviosas diabéticas también podría deberse a alteración del metabolismo, específicamente en la ruta de síntesis de las poliaminas, que junto con el magnesio, son los dos factores intracelulares conocidos causantes de la rectificación entrante en esta familia de canales de K+ (Ashcroft, 2000). Las poliaminas (putrescina, espermina y espermidina) interactúan con ácidos nucleicos, 67 proteínas (canales) y otras macromoléculas, modificando su estructura y función en la célula. Las poliaminas están involucradas en la regulación del crecimiento, diferenciación celular, estabilización de membranas e importantes funciones neurofisiológicas (Morgan, 1998). La posible participación de las poliaminas en la pérdida de la rectificación entrante se sustenta por el hallazgo de que influyen la función de compuerta del canal KATP en miocitos cardíacos (Niu & Meech, 1998), se cree que a potenciales de membrana positivos, las poliaminas entran al poro del canal donde se enlazan y lentifica el paso del potasio (Aguilar-Byan & Bryan, 1999) lo cual podría también ocurrir en células nerviosas. Por otra parte, se ha reportado disminución en el contenido de poliaminas y en la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa (ODC) en embriones de 11 días de gestación en ratas diabéticas (Bengtsson, Wiberg & Eriksson, 1994). La ODC es una enzima clave en la síntesis de poliaminas en la célula, exhibe una rápida respuesta a hormonas, factores de crecimiento y otros estímulos en células de mamíferos, además tiene una tasa alta de recambio (Morgan, 1998). La reducción de la ODC en la diabetes disminuiría el nivel intracelular de poliaminas y consecuentemente la rectificación del canal, como ha sido demostrado para otros canales de K+ con rectificación entrante Kir 2.3 (Shyng, Sha, Ferrigni, Lopatin & Nichols, 1996). Mas investigaciones futuras son necesarias para confirmar e interpretar este efecto. El pH intracelular también ha sido involucrado en el control del mecanismo de rectificación mediado por poliaminas (Baukrowitz et al. 1999). Aunque una acidificación del citoplasma, resultado del estrés metabólico que excede el potencial compensatorio de la célula, también explicaría la ausencia de rectificación en neuronas de rata diabética, específicamente debido a una protonación-desprotonación del residuo intracelular de histidina H216 en la región C terminal de la subunidad Kir del canal KATP (Baukrowitz et al. 1999), nuestros resultados fueron obtenidos en condiciones similares de pH para los registros control y diabéticos, por lo que se descarta la participación de este factor. Estudios posteriores son necesarios para entender este resultado. Como se mencionó en la sección anterior, los datos en la literatura muestran que los canales KATP pueden presentar o no dependencia al voltaje. Las diferencias entre la no dependencia (Noma & Takano, 1991; Cook & Hales, 1984; Gopalakrishnan et al. 1993) y la dependencia de voltaje (Spruce et al. 1985; Jiang et al, 1994; Tromba, Salvaggio, 68 Racagni & Volterra, 1994; Velasco et al. 2006), podrían deberse a diferencias específicas entre los distintos tipos de subunidades que conforman los canales KATP presentes en las distintas zonas del cerebro. El canal estudiado en este trabajo muestra que en la condición diabética su actividad mantiene la propiedad de dependencia de voltaje, como en el control. Asimismo, la probabilidad de apertura se incrementa de manera similar a potenciales de membrana positivos en ambas condiciones (véase Figura 21). El potencial de activación medio (V1/2) y los valores de “k” fueron también similares (2.1 y 11.1 control y 5.3 y 11.02 mV diabética respectivamente). Lo que sugiere que el campo eléctrico puede tener influencia en las interacciones entre cargas eléctricas de aminoácidos en la zona del poro, pero no la tuvo en la condición diabética experimental. Cambio en la sensibilidad al ATP de los canales KATP en neuronas diabéticas. Se sabe que la hiperglucemia induce una serie de cambios muy complejos en los sistemas neuronal y vascular en modelos animales y en pacientes con diabetes, ya que la glucólisis y sus metabolitos afectan muchas de las rutas metabólicas celulares (Bhardwaj et al. 1999). Al estudiar la sensibilidad de los canales KATP de neuronas CA3 en rebanadas provenientes de ratas diabéticas al ATP, se encontró que el ATP bloqueó completamente la actividad de estos canales a concentraciones de 3 mM (véase Figura 22 A). Sin embargo, cuando se analizó la relación dosis-respuesta se evidenció una disminución en la sensibilidad al nucleótido (véase Figura 22 B). La KD de 0.59 mM (0.25 mM para el control) indica que esa disminución en la sensibilidad requiere una concentración dos veces mayor de ATP para obtener el efecto bloqueador. Resultados similares han sido encontrados en miocitos cardiacos, en los que se presenta disminución en la sensibilidad de los canales KATP al ATP, detectada a los cinco días y a las siete semanas después de la inducción de la diabetes (Shimoni et al. 1998). De acuerdo con estos autores el coeficiente de Hill (h) para neuronas de ratas control y diabéticas fue de 2.1 y 2.0 respectivamente, aunque reportan una disminución en este valor a las 7 semanas (1.75). Al comparar con los valores para el mismo coeficiente calculados en este trabajo, 2.4 y 2.1 respectivamente, podemos considerarlos similares. Esto sugiere que la inhibición probablemente resulta del enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al canal. Tanto los resultados de Shimoni como los de esta tesis difieren de los reportados por Smith y Wahler (1996), 69 quienes no encontraron diferencias significativas en la sensibilidad al ATP de los KATP en miocitos cardiacos de ratas diabéticas comparados con el control. La disminución en la sensibilidad al ATP de los canales KATP se ha observado también en diferentes patologías y tejidos (Deutsch & Weiss, 1993; Koumi, Martin & Sato, 1997; Light, Shimoni, Harbison, Giles & French, 1998). Así, podría haber alguna propiedad intrínseca del canal que cambiara en la misma dirección, es decir hacia la disminución, en una variedad de patologías, todas ellas de tipo metabólico. Se ha señalado que probablemente el estrés metabólico ocasione que algunas enzimas proteolíticas intracelulares sean liberadas, modifiquen estructuralmente al canal y reduzcan su sensibilidad al ATP (Deutsch & Weiss, 1994; Lee, Ozanne, Rowe, Hales & Ashford, 1994; Sodder, Bowie, & Cameron, 1996). Los alcances de nuestro trabajo no permiten apoyar o rechazar esas posibilidades en las neuronas hipocampales diabéticas. Existe una vía que se favorece en condiciones de estrés metabólico, la cual fosforila a una proteína de choque térmico (heat shock protein 27, HSP27) en cardiomiocitos. La sobreexpresión de HSP27 en miocitos ventriculares aislados de la rata confiere protección contra la isquemia simulada (Baines et al. 1999). La HSP27 es a su vez un regulador importante de la dinámica de actina, promoviendo la polimerización de los microfilamentos. Ya que se ha comprobado que el citoesqueleto de actina es básico para el número, distribución y actividad funcional de varios tipos de canales en la superficie celular, entre ellos precisamente los KATP. (Wang, Eldstrom, Jantzi, Moore & Fedida, 2003). La inhibición del canal KATP por ATP, resulta de la interacción de este nucleótido de trifosfato con la subunidad Kir, mientras que la activación, resulta de la interacción del nucleótido-Mg con la subunidad SUR (Nichols, 2006). Además, desde hace tiempo se ha involucrado a los fosfolípidos como una nueva clase de moléculas reguladoras de canales Kir (Baukrowitz et al. 1998). El dominio citoplásmico de cada subunidad Kir (6.2) provee los sitios de enlace para el ATP y otro para el fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2), los cuales estabilizan el estado cerrado y abierto del canal, respectivamente (Enkvetchakul & Nichols, 2003). 70 Una posible explicación para la disminución de la sensibilidad de los canales KATP de neuronas de ratas diabéticas al ATP, es considerando los sitios afines al ATP en la subunidad Kir6.2 (Ashcroft, 2000), ya que los sitios de enlace del ATP y del PIP2 se encuentran intercalados en una área en común, habría una competencia bioquímica de los dos ligandos (ATP y PIP2) por el sitio “no ocupado” en esta subunidad (Nichols, 2000). Cuando los niveles neuronales de ATP disminuyen y “aumentaría” la concentración de PIP2 en la membrana en el estado diabético (Baukrowitz & Fakler, 2000), el enlace de PIP2 al sitio de unión en la subunidad se vería favorecido y el estado activo del canal persistiría. Ante esto sería necesaria una mayor cantidad de moléculas de ATP, para competir por el sitio de unión al ATP y para finalmente bloquear el canal. Otra de las causas a las que se ha atribuido la disminución en la sensibilidad del canal al ATP son las mutaciones al azar, las que en la diabetes mellitus neonatal (NDM) causan pérdida de la función específica del canal, ya que impiden que los canales se cierren. En células pancreáticas esto inhibe la actividad eléctrica, la entrada de calcio y la secreción de insulina (Hattersley & Ashcroft, 2005). Aunque es posible que mutaciones espontáneas puedan ocurrir en las subunidades del canal en otros tejidos (nervioso), la probabilidad de que ocurran espontáneamente es baja. Que el decremento en la sensibilidad de los canales KATP pueda resultar en un fenotipo diabético abre la posibilidad de que mutantes insensibles al ATP puedan ocasionar diabetes en humanos. Se postula que el aumento sostenido de la actividad de los KATP pueda ser un factor causal importante de la diabetes mellitus (Nichols and Koster 2002). La evidencia inicial de la presencia de los canales KATP en el cerebro se obtuvo al demostrar la existencia de sitios de unión para glibenclamida (Mourre, Ben Ari, Bernardi, Fosset & Lazdunski, 1989; Karschin et al. 1997), ya que la subunidad SUR esta íntimamente relacionada y requerida para la función de los canales KATP (Aguilar-Bryan & Bryan, 1999). Se ha reportado que la diabetes (inducida con STZ) altera el enlazamiento de gliburida[H*] al sitio de alta (SUR1) y baja afinidad (SUR2) en varias zonas del cerebro de rata (Levin & Dunn-Meynell, 1998), sin embargo, en algunas zonas, como la “CA” del hipocampo (CA2) no se aprecia variación entre controles y diabéticos. En esta tesis la glibenclamida (100 µM) suprimió la actividad de los canales KATP en neuronas de ratas 71 diabéticas (véase Figura 23), confirmando con ello que, efectivamente, los estudiados son canales KATP y que no existe diferencia aparente en el bloqueo de la subunidad SUR del canal en la condición diabética comparada con el control. Sensibilidad a la glucosa de los canales KATP en neuronas control y diabéticas. Los canales de potasio estudiados fueron sensibles a la glucosa, es decir, la glucosa suprimió la actividad de estos canales (véase Figura 8). El efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales KATP, ha sido descrito previamente. La glucólisis y la fosforilación oxidativa, aumentan el ATP citosólico, incrementa el cociente ATP/ADP y consecuentemente bloquean a los canales. Se ha reportado el mismo efecto en las células β del páncreas (Ashcroft, Harrison y Ashcroft, 1984) y en neuronas del hipocampo (Tromba, Salvaggio, Racagni y Volterra, 1992; 1994; Velasco et al. 2006). Velasco et al. hallaron que en neuronas cultivadas de esta estirpe, la glucosa bloquea canales de potasio con tres diferentes conductancias. Resultados obtenidos en este trabajo muestran que en la condición diabética, la glucosa no bloqueó la actividad de los canales de potasio sensibles al ATP, es decir se observó actividad de los canales en presencia de glucosa, aún a concentraciones de 20 y 50 mM. Sin embargo, esa actividad sí fue inhibida por ATP. Una explicación a esta observación está sustentada en el hecho de que como se mencionó anteriormente en la condición diabética disminuye la sensibilidad de los canales K ATP al ATP, con respecto a lo observado en el control. Por lo tanto, la ausencia de bloqueo de los canales K ATP por glucosa podría deberse a esta disminución de la sensibilidad al ATP por estos canales en las neuronas diabéticas, es decir, que la cantidad de ATP citosólico no sea suficiente para las funciones neuronales y para bloquear los canales KATP. Aunque tampoco se descartan cualquiera de las dos posibilidades que se discuten en seguida. Otra posible explicación para la ausencia de bloqueo de los canales KATP por glucosa es que las neuronas diabéticas fuesen incapaces de transportar la glucosa al interior de la célula. Dada la importancia fisiológica de la captación de glucosa, no sorprende que la expresión de los transportadores de la misma (GLUTs) sean regulados por insulina la cual 72 atravieza la barrera hematoencefálica (Banks, 1997). Se ha reportado que existen receptores de insulina del tipo IRS-1 y predominantemente el IRS-2 en el hipocampo y otras zonas cerebrales de rata y ratón (Dou, Chen, Dufour, Alkon & Zhao, 2005; Schubert et al. 2003), y la deficiencia de ISR-2 daña el crecimiento cerebral (Schubert et al.). La posible alteración en el transporte de glucosa esta apoyado por evidencias que sostienen que debido a la disminución de insulina en la condición diabética se reduciría el desplazamiento (migración) de vesículas con los transportadores de glucosa a la membrana plasmática ó que se alteraría su expresión ó que se modificaría la estructura de la proteína canal (Marette et al. 1999; Wang & Gleichmann, 1995; Yokoshiki et al. 1998). Aunque existen reportes en la literatura que indican que otras hormonas (testosterona, glucocorticoides, ácido retinoico y hormona tiroidea) también alteran la expresión de los transportadores GLUT (Medina & Owen, 2002). Varios estudios sugieren que la insulina realiza en el cerebro las mismas acciones que en los tejidos periféricos, es decir, entre otras, facilita la entrada de glucosa a las neuronas, manteniendo así su producción energética. Uemura y West en el 2006, proponen que la insulina regula la captación de glucosa neuronal, promoviendo la translocación de transportadores GLUT3 a la membrana plasmática y que la insulina habilita a las neuronas a responder a las demandas de energía inducida por una actividad neuronal incrementada. La insulina también, estimula enzimas glucolíticas claves en la corteza cerebral (Hoyer, Prem, Sorbi & Amaducci, 1993). La insulina en el cerebro podría tener otros efectos benéficos adicionales, como favorecer el desarrollo neuronal o inhibir la formación de las lesiones cerebrales constituidas por redes de neurofibrillas (Biessels & Kappelle, 2005), por lo que podría estar asociada también con funciones tan importantes como el aprendizaje y la memoria (Biessels et al.1998). Otra posibilidad para explicar la ausencia de bloqueo de los canales KATP en las neuronas hipocampales CA3 de rata diabética es que la glucosa sí entra a la célula, pero ésta es incapaz de metabolizarla para producir ATP, lo que consecuentemente afectaría la regulación de la actividad del canal K ATP y la excitabilidad neuronal (Nichols, 2006). Evidencias de daño metabólico intracelular en ratas diabéticas han sido reportadas (Makar et al.1999; Sokoloff, 2004). La enzima glucocinasa que cataliza la conversión de glucosa a glucosa-6-fosfato, la primera reacción de la glucólisis, juega un papel crítico en la homeostasis de la glucosa en muchos tejidos incluyendo neuronas (Nichols & Koster, 2002). Una forma de diabetes no dependiente de insulina conocida como MODY2 73 (maturity-onset diabetes of the young) ha sido asociada con actividad reducida de la glucocinasa (Vionnet et al. 1992), con descenso en los niveles de ATP. Consecuentemente la actividad de los canales KATP aumenta y disminuye la actividad eléctrica neuronal (Sakura, Ashcroft, Terauchi, Kadowaki y Ashcroft, 1998; Nichols & Koster, 2002). Lo anterior explicaría la ausencia de bloqueo por glucosa de los canales K ATP documentada en este trabajo en la condición diabética. Una alternativa para obtener energía por las neuronas es vía células gliales, los astrocitos pueden proveer de lactato a las neuronas, estas transformarlo a piruvato y luego a ATP, sin embargo, se ha visto que las neuronas pueden detectar y metabolizar la glucosa en ausencia completa de lactato (Dunn-Meynell, Routh, Kang, Gaspers. & Levin, 2002). Por ello el lactato no parece ser una molécula reguladora de la actividad energética sino solo un sustrato alternativo para la actividad neuronal. En la disponibilidad reducida de ATP también podría involucrarse una proteína desacopladora, que interrumpe la producción de ATP por fuga de electrones en la membrana mitocondrial; la UCP-2 (uncoupling protein-2). La expresión de UCP-2 está aumentada en células pancreáticas de roedores (Chan et al. 2001) y humanos (Brown, Tomas, Digby & Dunmore, 2002) con diabetes. Sin embargo, Moreira et al. en el 2004, reportaron el efecto de la diabetes inducida por STZ, en la función mitocondrial de cerebro de rata, sin observar cambios sustanciales respecto al control. Para recalcar la ausencia del efecto inhibitorio de la glucosa en la actividad de los canales K ATP y la importancia de esta observación, es necesario recordar también la función de neuroprotección de los canales KATP en la isquemia cerebral. Se podría suponer que, al igual que en la isquemia, en la diabetes, los canales KATP permanecen abiertos debido tal vez a una reducción del cociente ATP/ADP. La activación de los canales KATP hiperpolariza a la membrana neuronal y disminuye tanto la excitabilidad, la liberación de neurotransmisores como el consumo mismo del nucleótido, silenciando a las neuronas hipocampales (Herteaux, Lauritzen, Widmann & Lazdunski, 1995; Reshef, Sperling & Zoref-Shani, 2000). En la isquemia esto permite una mayor supervivencia celular, lo cual podría ocurrir también en el trastorno metabólico de la diabetes. Lo que sugiere que la activación de los canales KATP podría representar un mecanismo de defensa endógeno importante en el corto plazo para la viabilidad neuronal en esta patología metabólica. 74 Conclusiones Los canales KATP en neuronas CA3 de hipocampo: 1. En ratas control y diabéticas la conductancia unitaria y la permeabilidad al potasio fueron similares (178.5 y 177.4 pS; 3.74x10-13 y 3.84x10-13 cm/s respectivamente). 2. Son dependientes de voltaje tanto en neuronas de ratas control como diabética (V1/2=2.1 ± 0.6 y k=11.1 ± 0.3 mV; V1/2=5.3 ± 0.6 y k=11.2 ± 0.4 mV). 3. En ratas diabéticas los canales KATP no se opbservó rectificación entrante como ocurrió con las ratas control. 4. En ratas control y diabéticas los canales KATP son sensibles al ATP de manera dependiente de la concentración, sin embargo, en ratas diabéticas los canales mostraron disminución en la sensibilidad al ATP (KD=0.59 mM) comparada con el control (KD=0.25 mM). El coeficiente de Hill (h) prácticamente no se modificó (2.1 y 2.4 respectivamente). 5. A diferencia de las ratas control, en las diabéticas los canales KATP no se bloquearon con glucosa (hasta 50 mM). La falta de sensibilidad a la glucosa se puede deber a la disminución de la sensibilidad al ATP, aunque no se puede descartar la posibilidad de que la glucosa no entre a la célula o que la síntesis de ATP no se realice eficientemente. 6. La glibenclamida (100 µM) bloqueó los canales KATP tanto en rata diabética como en el control. 75 Perspectivas En este trabajo se encontró que en la diabetes experimental existe modificación de los parámetros biofísicos de los canales KATP presentes en las membranas de neuronas CA3 del hipocampo de rata, comparado con el control. Los resultados mostraron que la glucosa aplicada en el medio extracelular no bloqueó la actividad de los canales KATP en neuronas de rata diabética, posiblemente debido a la disminución en la sensibilidad al ATP de los canales KATP encontrada en este trabajo en la condición diabética. En cuanto al estudio de las corrientes unitarias de los canales KATP, aún falta estudiar la sensibilidad de estos canales a la glibenclamida (relación dosisrespuesta) así como el efecto del PIP2 en la actividad de estos canales en la diabetes. Además, es importante saber en que parte de la ruta glucolítica la célula ha sido dañada en esta patología, de tal manera que impide la síntesis de ATP. Lo anterior se realizaría mediante el uso de inhibidores metabólicos específicos en diferentes etapas de la glucólisis y/o fosforilación oxidativa combinada con técnicas electrofisiológícas. También podría confirmarse e investigarse la causa de la aparente ausencia de rectificación observada en los canales KATP de membranas de neuronas de ratas diabéticas. La adición exógena de poliaminas en esta condición y el comportamiento subsiguiente de la corriente de potasio por los canales KATP podría ayudar a explorar y tratar de entender mejor este resultado. Puesto que se ha demostrado la participación de los canales KATP en la unión del metabolismo con la excitabilidad celular y en el precondicionamiento isquémico, es probable que los canales KATP registrados en este trabajo, se activen durante la diabetes como un mecanismo de protección neuronal, dejando las células silentes. Todos estos resultados junto con otras investigaciones podrían ayudar a futuro, para el diseño de nuevas estrategias de tratamiento de la neuropatía diabética central y favorecer a evitar el deterioro de las funciones de la memoria y aprendizaje característico de esta enfermedad. 76 Bibliografía Acevedo Fernández, J. J. (2002). Canales de potasio sensibles al ATP y su contribución en la corriente total de las neuronas disociadas de hipocampo de ratas jóvenes. Tesis Doctoral. Universidad de Colima, Colima, México. Aguilar-Bryan, L. & Bryan, J. (1999). Molecular biology of adenosine triphosphatesensitive potassium channels. Endocr Rev, 20, 101-135. Akaike, N., Jin, Y. H. & Koyama, S. (1997). Functional interaction between Na(+)-K+ pump and KATP channels in the CNS neurons under experimental brain ischemia. Jpn J Physiol, 47, S50-S51. Allen, T. G. J & Brown, D. A. (2004). Modulation of the excitability of cholinergic basal forebrain neurones by KATP channels. J Physiol (Lond), 554, 353-370. Amoroso, S., Schmid-Antomarchi, H., Focet, M. & Lazdunski, M. (1990). Glucose, sulfonylureas, and neurotransmitter release: Role of ATP-sensitive K+ channels. Science, 247, 852-854. Aragno, M., Mastrocola, R., Brignardello, E., Catalano, M., Robino, G., Manti, R., Parola, M., Danni, O. & Boccuzzi, G. (2002). Dehydroepiandrosterone Modulates Nuclear Factor{kappa}B Activation in Hippocampus of Diabetic Rats. Endocrinology, 143, 3250-3258. Arezzo, J. C. (1997). The use of electrophysiology for the assessment of diabetic neuropathy. Neurosci Res Commun, 21, 13-23. Ashcroft, F. M., Harrison, D. E. & Ashcroft, S. J. H. (1984). Glucose induces closure of single potassium channels in isolated rat pancreatic beta-cells. Nature, 312, 446-448. Ashcroft, S. J. H. & Ashcroft, F. M. (1990). Properties and functions of ATP-sensitive K+ channels. Cell signal, 2, 197-214. Ashcroft, S. J. H. & Ashcroft, F. M. (1992). The sulfonylurea receptor. Biochim. Biophys. Acta, 1175, 45-59. Ashcroft, F. M. (2000). Inwardly rectifying K+ channels. En: Ashcroft, F. M. Ion Channels and Disease. (pp 135-159). Academic Press, London, UK. Ashford, M. L., Sturgess, N. C., Trout, N. J., Gardner, N. J. & Hales, C. N. (1988). Adenosine-5`-triphosphate-sensitive ion channels in neonatal rat cultured central neurones. Pfluegers Arch, 412, 297-304. Ashford, M. L., Boden, P. R. & Treherne, J. M. (1990a). Glucose-induced excitation of hypothalamic neurones is mediated by ATP-sensitive K+ channels. Pfluegers Arch, 415, 479-483. 77 Ashford, M. L., Boden, P. R. & Treherne, J. M. (1990b). Tolbutamide excite rat glucoreceptive ventromedial hypothalamic neuronas by indirect inhibition of ATPsensitive K+ channels. Br. J. Pharmacol, 101, 531-540. Babenko, A. P., Gonzalez, G., Aguilar-Bryan, L. & Bryan, J. (1998). Reconstituted Human Cardiac KATP Channels. Circ Res, 83, 1132-1143. Babenko, A. P., Aguilar-Bryan, L. & Bryan, J. (1998). A view of sur/Kir6.X, KATP channels. Ann Rev Physiol, 60, 667-687. Banks, W. A. (1997). Selective, Physiological Transport of Insulin Across the Blood-Brain Barrier: Novel Demonstration by Species-Specific Radioimmunoassays. Peptides, 18, 1257-1262. Baukrowitz, T., Schulte, U., Oliver, D., Herlitze, S., Krauter, T., Tucker, S. J., Ruppersberg, J. P., & Flaker, B. (1998). PIP2 and PIP as determinants for ATP inhibition of KATP channels. Science, 282, 1141-1144. Baukrowitz, T., Tucker, S. J., Schulte, U., Benndorf, K., Ruppersberg, J. P. & Fakler, B. (1999). Inward rectification in KATP Channels: a pH switch in the pore. EMBO J. 18, 847853. Baukrowitz, T. & Flaker, B. (2000). KATP channels gated by intracellular nucleotides and phospholipids. Eur.J.Biochem, 267, 5842-5848. Ballanyi, K. (2004). Protective role of neuronal KATP channels in brain hypoxia. J Exp Biol 207, 3201–3212. Bengtsson, B. O., Wiberg, K. & Eriksson, U. J. (1994). Ornithine decarboxylase activity and concentrations of polyamines in embryos of diabetic rats. Biol Neonate, 66, 230-237. Bernardi, H., De Weille, J. R., Epelbaum, J., Mourre, C., Amoroso, S., Slama, A., Focet, M. & Lazdunski, M. (1993). ATP-modulated K+ channels sensitive to antidiabetic sulfonylureas are present in adenohypophysis and are involved in growth hormone release. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 1340-1344. Bhardwaj, S. K., Sandhu, S. K., Sharma, P. & Kaur, G. (1999). Impact of diabetes on CNS: Role of signal transduction cascade. Brain Res Bull, 49, 155-162. Biessels, G. J., Kapelle, A. C., Bravenboer, B., Erkelens, D. W. & Gispen, W. H. (1994). Cerebral function in diabetes mellitus. Diabetologia, 37, 643-650. Biessels, G. J.; Kamal, A., Ramakers, G. M., Urban, I. J., Spruijt, B. M., Erkelens, D. W. & Gispen, W. H. (1996). Place learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes, 45, 1259-1266. Biessels, G. J., Kamal, A., Urban, I. J., Spruijt, B. M., Erkelens, D. W. & Gispen, W. H. (1998). Water maze learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocindiabetics rats: effects of insulin treatment. Brain Res, 800, 125-135. 78 Biessels, G. J. & Kappelle, L. J. (2005). Increased risk of Alzheimer's disease in Type II diabetes: insulin resistance of the brain or insulin-induced amyloid pathology? Biochem Soc Trans, 33, 1041–1044. Bliss, T. & Lomo, T. (1973). Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol, 232, 331-356. Branstrom, R., Corkey, B. E., Berggren, P. O. & Larsson, O. (1997). Evidence for a unique long chain acyl-CoA ester binding site on the ATP-regulated potassium channel in mouse pancreatic beta cells. J Biol Chem, 272, 17390-17394. Brown, J. E., Tomas, S., Digby, J. E. & Dunmore, S. J. (2002). Glucose induces and leptin decreases expression of uncoupling protein-2 mRNA in human islets. FEBS Lett, 513, 189192. Brownlee, M. (1994). Glycation and diabetic complications. Diabetes, 43, 836-841. Calcutt, N. A., Allendoerfer, K. L., Mizisin, A. P., Middlemas, A., Freshwater, J. D., Burgers, M., Ranciato, R., Delcroix, J. D., Taylor, F. R., Shapiro, R., Strauch, K., Dudek, H., Engber, T. M., Galdes, A., Rubin, L. L. & Tomlinson, D. R. (2003). Therapeutic efficacy of sonic hedgehog protein in experimental diabetic neuropathy. J Clin Invest, 111, 507-514. Campbell, J. D., Sansom, M .S. P. & Ashcroft, F. M. (2003). Potassium Channel regulation. EMBO Rep, 4, 1038-1042. Candy, S. M. & Szatkowski, M. S. (2000a). Chronic hyperglycemia increases neuronal sensitivity to high potassium in hippocampal slices from streptozotocin-treated diabetic rats. Neurosci Lett, 279, 105-108. Candy, S. M. & Szatkowski, M. S. (2000b). Neuronal excitability and conduction velocity changes in hippocampal slices from streptozotocin-treated diabetic rats. Brain Res, 863, 298-301. Clement, J. P. 4th., Kunkilwar, K., González, G., Schwanscheter, M., Panten, U., AguilarBryan, L. & Bryan, J. (1997). Association and stoichiometry of KATP channel subunits. Neuron, 18, 827-838. Colquhoun, D. & Sigworth, F. J. (1983). Fiting and statistical analysis of single channel records. En: B. Sackmann, y E. Neher (Eds.), Single channel recording (pp 191-264). New York, NY: Plenum Press. Cook, D. L. & Hales, C. N. (1984). Intracellular ATP directly blocks K+ channels in pancreatic β-cells. Nature, 311, 271-273. Curtis, H. y Barnes, N. S. (1989). Biology. (pp. 701-714; 841-899). New York, NY: W. H. Freeman. 79 Chan, C. B., De Leo, D., Joseph, J. W., McQuaid, T. S., Ha, X. F., Xu, F., Tsushima, R. G., Pennefather, P. S., Salapatek, A. M. F. & Wheeler, M. B. (2001). Increased Uncoupling Protein-2 Levels in β-cells Are Associated With Impaired Glucose-Stimulated Insulin Secretion: Mechanism of Action. Diabetes, 50, 1302-1310. Chih, C. P., Lipton, P. & Roberts, E. L. Jr. (2001). Do active cerebral neurons really use lactate rather than glucose? Trends Neurosci, 24, 573-578. Deitmer, J. W. (2001). Strategies for metabolic exchange between glial cells and neurons. Respir Physiol, 129, 71-81. Del Valle, F. H., Lascano, E. C. & Negroni J. A. (2002). Isquemic preconditioning protection against stunning in conscious diabetic sheep: role of glucose, insulin, sarcolemmal and mitochondrial KATP channels. Cardiovas Res, 55, 642-659. Deutsch, N. & Weiss, J. N. (1993). ATP-sensitive K+ channel modification by metabolic inhibition in isolated guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol, 465, 163-179. Deutsch, N. & Weiss, J. N. (1994). Effects of trypsin on cardiac ATP-sensitive K+ channels. Am J Physiol, 266, H613-622. Di Mario, U., Morano, S., Valle, E. & Pozzessere, G. (1995). Electrofisiological alterations of the central nervous system in diabetes mellitus. Diabetes Metab, 11, 259-277. Dou, J. T., Chen, M., Dufour, F., Alkon, D. L. & Zhao, W. Q. (2005). Insulin receptor signaling in long-term memory consolidation following spatial learning. Learn Mem, 12, 646-655. Dunn-Meynell, A. A., Routh, V. H., Kang, L., Gaspers, L. & Levin, B. E. (2002). Glucokinase is likely mediator of glucosensing in both glucose excited and glucose inhibited central neurons. Diabetes, 51, 2056-2065. Dyck, P. J., Kratz, K. M., Karnes, J. L., Litchy, W. J., Klein, R., Pach, J. M., Wilson, D. M., O'Brien, P. C., Melton, L. J. 3rd, & Service, F. J. (1993). The prevalence by staged severity of various types of diabetic neuropathy, retinopathy, and nephropathy in a population-based cohort: The Rochester Diabetic Neuropathy Study. Neurology, 43, 817824. Enkvetchakul, D. & Nichols, C. G. (2003). Gating mechanism of KATP channels: function fits form. J Gen Physiol, 122, 471-480. Erdemli, G. & Krnjevic, K. (1993). Diazoxide suppresses slowly-inactivating outward and inward currents in CA1 hippocampal neurones. Neuroreport, 5, 249-251. Evans, J. L., Goldfine, I. D., Maddux, B. A. & Grodsky, G. M. (2002). Oxidative Stress and Stress-Activated Signaling Pathways: A Unifying Hypothesis of Type 2 Diabetes. Endocr Rev, 23, 599-622. 80 The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus (ECDCDM)(2003). Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 26, S5-S20. Federación Mexicana de Diabetes, A. C. (2007). Diabetes en números: Los números de la diabetes en México. Recuperado el 23 de enero de 2007, de http://www.fmdiabetes.com/www/diabetes/dnumeros.asp Félix Calderón, A. (2005). Efectos deletéreos de la diabetes mellitus tipo 2 en el sistema nervioso central. Tesis de Maestría. Universidad de Colima, Colima, México. Flood, J., Mooradian, A. & Morley, J. (1990). Characteristics of learning and memory in streptozocin-induced diabetic mice. Diabetes, 39, 1391-1398. Funk, J. L. (2003). Trastornos del páncreas endocrino. En: McPhee, S. J., Lingappa, V. R. y Ganong, W. F. (Eds.) Fisiopatología Médica: Una introducción a la medicina clínica. (pp.). México, D.F.: Editorial El Manual Moderno. Gehlert, D. R., Gackenheimer, S. L., Mais, D. E. & Robertson, D. W. (1991). Quantitative autoradiography of the binding sites for [125I] iodoglyburide, a novel high-affinity ligand for ATP-sensitive potassium channels in rat brain. J Pharmacol Exp Ther, 257, 901-907. Gispen, W. H. & Biessels, G. J. (2000). Cognition and synaptic plasticity in diabetes mellitus.Trends Neurosci, 23, 542-549. Gold, S. M., Dziobek, I., Sweat, V., Tirsi, A., Rogers, K., Bruehl, H., Tsui, W., Richardson, S., Javier, E. & Convit, A. (2007). Hippocampal damage and memory impairments as possible early brain complications of type 2 diabetes. Diabetologia, 50, 711-719. Gopalakrishnan, M., Janis, R. A. & Triggle, D. J. (1993). ATP sensitive K+ channels: pharmacological properties, regulation and therapeutic potential. Drug Dev Res, 28, 95127. Gould, E., Tanapat, P., Hastings, N. B. & Shors, T. J. (1999). Neurogenesis in adulthood a possible role in learning. Trends Cog Sci, 3, 186-192. Greene, D. A., Sima, A. F., Stevens, M. J., Feldman, E. L. & Lattimer, S. A. (1992). Complications: neuropathy, pathogenetic considerations. Diabetes Care, 15, 1902-1925. Greene, D. A., Stevens, M. J. & Feldman, E. L. (1999). Diabetic Neuropathy: The Scope of the Syndrome. Am J Med, 107, 2S-8S. Griesemer, D., Zawar, C. & Neumcke, B. (2002). Cell-type specific depression of neuronal excitability in rat hippocampus by activation of ATP-sensitive potassium channels. Eur Biophys J, 31, 467-477. Gugliucci, A. (2000). Glycation as the glucose link to diabetic complications. J Am Osteopath Assoc, 100, 621-634. 81 Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. & Sigworth, F. J. (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch, 391, 85-100. Hattersley, A. T. & Ashcroft, F. M. (2005). Activating mutations in Kir6.2 and neonatal diabetes. Diabetes, 54, 2503-2513. Heijer, T., Vermeer, S. E., Dijk, E. J., Prins, N. D., Koudstaal, P. J., Hofman, A. & Breteler, M. B. (2003). Type 2 diabetes and atrophy of medial temporal lobe structures on brain MRI. Diabetologia, 46, 1604-1610. Helkala, E. L., Niskanen, L., Viinamaki, H., Partanen, J. & Uusitupa, M. (1995). Shortterm and long-term memory in elderly patients with NIDDM. Diabetes Care 18, 681-685. Hellweg, R. & Hartung, H. D. (1990). Endogenous levels of nerve growth factor (NGF) are altered in experimental diabetes mellitus: a possible role for NGF in the pathogenesis of diabetic neuropathy. J Neurosci Res ; 26, 258-265. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C. & Lazdunski, M. (1995). Essential role of adenosine, adenosine A1 receptors, and ATP-sensitive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proc Natl Acad Sci U S A., 92, 4666-4670. Hoyer, S., Prem, L., Sorbi, S. & Amaducci, L. (1993). Stimulation of glycolytic key enzymes in cerebral cortex by insulin. Neuroreport. 4, 991-993. Hunter, M. & Giebisch, G. (1988). Calcium activated K-channels of Amphiuma early distal tubule: Inhibition by ATP. Pflugers Arch, 412, 331-333. Isagai, T., Fujimura, N., Tanaka, E., Yamamoto, S. & Higashi, H. (1999). Membrana Dysfunction Induced by In Vitro Ischemia in Immature Rat Hippocampal CA1 Neurons. J Neurophysiol, 81, 1866-1871. Isomoto, S. (2003). Physiology, pharmacology and molecular biology of K+ ATP-sensitive channels in the cardiovascular system. Rev Soc Parag Cardiol,1, 307-312. Izumi, Y., Yamada, K. A., Matsukawa, M. & Zorumski, C. F. (2003). Effects of insulin on long-term potentiation in hippocampal slices from diabetic rats. Diabetologia, 46, 10071012. Jackson-Guilford, J., Leander, D. J. & Nisenbaum L. K. (2000). The effect of streptozotocin-induced diabetes on cell proliferation in the rat dentate gyrus. Neurosci Lett, 293, 91-94. Jahangir, A. & Terzic, A. (2005). K(ATP) channel therapeutics at the bedside. J Mol Cell Cardiol, 39, 99-112. Jiang, C., Sigworth, F. J. & Haddad, G. G. (1994). Oxygen deprivation activates an ATPinhibitable K+ channel in substantia nigra neurons. J Neurosci, 14, 5590-5602. 82 Jiang, C. & Haddad, G. G. (1997). Modulation of K+ channels by intracellular ATP in Human Neocortical Neurons. J Neurophysiol, 77, 93-102. Kamal, A., Biessels, G. J., Duis, S. E. & Gispen, W. H. (2000). Learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocin-diabetic rats: interaction of diabetes and ageing. Diabetologia, 43, 500-506. Kamal, A., Artola, A., Biessels, G. J., Gispen, W. H. & Ramakers, G. M. (2003). Increased spike broadening and slow afterhyperpolarization in CA1 pyramidal cells of streptozotocin-induced diabetic rats. Neuroscience, 118, 577-583. Kapur, A., Yeckel, M. F., Gray, R. & Johnston, D. (1998). “L-type calcium channels are required for one form of hippocampal mossy fiber LTP. J Physiol, 79, 2181-2190. Karschin, C., Ecke, C., Ashcroft, F. M. & Karschin, A. (1997). Overlapping distribution of KATP channel-forming Kir6.2 subunit and the sulfonylurea receptor SUR1 in rodent brain. FEBS Lett, 401, 59-64. Klein, J. P., Craner, M. J., Cummins, T. R., Black, J. A. & Waxman, S. G. (2002). Sodium channel expression in hypothalamic osmosensitive neurons in experimental diabetes. Neuroreport, 13, 1481-1484. Klein, J. P & Waxman, S. G. (2003). The brain in diabetes: molecular changes in neurons and their implications for end-organ damage. Lancet Neurol, 2, 548-554. Koumi, S. I., Martin, R. L., and Sato, R. (1997). Alterations in ATP-sensitive potassium channel sensitivity to ATP in failing human hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 272, H1656-H1665. Kumagai, K. (1999). Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-73. Lara, J., Acevedo, J. & Onetti, C. G. (1999). Large-Conductance Ca2+-Activated Potassium Channels in Secretory Neurons. J Neurophysiol, 82, 1317-1325. Lazar, M. A. (2005). How the obesity causes diabetes: Not a tall tale. Science, 307, 373375. Lee, K., Ozanne, S. E., Rowe, I. C., Hales, C. N. & Ashford, M. L. (1994). The effects of trypsin on ATP-sensitive potassium channel properties and sulfonylurea receptors in the CRI-G1 insuline-secreting cell-line. Mol Pharmacol, 45,176-185. Lee, K., Dixon, A. K., Freeman, T. C. & Richardson, P. J. (1998). Identification of an ATP-sensitive potassium channel current in rat striatal cholinergic interneurones. J Physiol, 10, 441-445. Levin, B. E. & Dunn-Meynell, A. (1998). Effect of Streptozotocin-induced diabetes on rat brain sulfonylurea binding sites. Brain Res Bull, 46, 513-518. 83 Li, Z. G. & Sima, A. A. (2004). C-peptide and central nervous system complications in diabetes. Exp Diabesity Res, 5, 79-90. Li, Z., Zhang, W. & Sima, A. A. (2005). The role of impaired insulin/IGF action in primary diabetic encephalopathy. Brain Res, 1037, 12-24. Light, P. E., Shimoni, Y., Harbison, S., Giles, W. R. & French, R. J. (1998). Hypothyroidism decreases the ATP-sensitivity of KATP channels from rat heart. J Membr Biol, 162, 217-223. Magariños, A. M. & McEwen, B. S. (2000). Experimental diabetes in rats causes hippocampal dendritic and synaptic reorganization and increased glucocorticoid reactivity to stress. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 11056-11061. Magistretti, P. J. (1999). Brain energy metabolism. En: Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., y Squire, L. R. (Eds.), Fundamental Neuroscience (pp. 389409). San Diego, CA: Academic Press. Makar, T. K., Hungund, B. L., Cook, G. A., Kashfi, K. & Cooper, A. J. (1995). Lipid metabolism and membrane composition are altered in the brains of type II diabetic mice. J. Neurochem, 54, 2159-2168. Marette, A., Dimitrakoudis, D., Shi, Q., Rodgers, C. D., Klip, A. & Vranic, M. (1999). Glucose rapidly decrease plasma membrane GLUT4 content in rat skeletal muscle. Endocrine, 10, 13-18. Mauerer, U. R., Boulpaep, E. L. & Segal, A. S. (1998). Regulation of an inwardly rectifying ATP-sensitive K+ channel in the basolateral membrane of renal proximal tubule. J Gen Physiol, 111, 161-180. Mc. Kenna, M. C., Gruetter, R., Sonnewald, U., Waagepetersen, H. S. & Schousboe, A. (2006). Energy metabolism of the brain. En: Siegel, G. J., Albers, R.W., Brady, S.T. & Price, D. W. Basic Neurochemistry (pp 531-557). Academic Press, San Diego, CA, USA. Medina, R. A. & Owen, G. I. (2002). Glucose transporters: expression, regulation and cancer. Biol Res, 35, 1-39. McCall, A. L. (1992). The impact of diabetes on the CNS. Diabetes, 41, 557-570. OKI Moreira, P. I., Santos, M. S., Moreno, A. M., Proenca, T., Seica, R. & Oliveira, C. R. (2004). Effect of streptozotocin-induced diabetes on rat brain mitochondria. J Neuroendocrinol, 16, 32-38. Morgan, D. (1998). Polyamines, An introduction. En: Morgan, D. M. L. (Ed.), Methods in Molecular Biology, Volume 79. Polyamine protocols (pp. 3-24). Totowa, NJ: Humana Press. Mourre, C., Ben Ari, Y., Bernardi, H., Fosset, M. & Lazdunski, M. (1989). Antidiabetic sulfonylureas: localization of binding sites in the brain and effects on the hyperpolarization induced by anoxia in hippocampal slices. Brain Research 486, 159-164. 84 Mourre, C., Widmann, C. & Lazdunski, M. (1990). Sulfonylurea binding sites associated with ATP-regulated K+ channels in the central nervous system: autoradiographic analysis of their distribution and ontogenesis, and of their localization in mutant mice cerebellum. Brain Res, 519, 29-43. Murphy, K. P. & Greenfield, S. A. (1992). Neuronal selectivity of ATP-sensitive potassium channels in guinea-pig substantia nigra revealed by responses to anoxia. J Physiol, 453, 167-183. Nichols, C. G. & Koster, J.C. (2002). Diabetes and insulin secretion: whither KATP?. Am J Physiol Endocrinol Metab, 283, 403-412. Nichols, C. G. (2006). KATP channels as molecular sensors of cellular metabolism. Nature, 440, 470-476. Nicholls, J. G., Martin, A. R. & Wallace, B. G. (1992). From neuron to Brain: A Cellular and Molecular Approach to the Function of the Nervous System. Third edition. (pp. 320328). Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc. Nickander, K. K., McPhee, B. R., Low, P. A. & Tritschler, H. (1996). Alpha-lipoic acid: antioxidant potency against lipid peroxidation of neural tissue in vitro and implications for diabetic neuropathy. Free Radic Biol Med, 21, 631-639. Niu, X. W. & Meech, R. W. (1998). The effect of polyamines on KATP channels in guineapig ventricular myocytes. J Physiol, 508, 401-411. Noma, A. (1983). ATP-regulated K+ channels in cardiac muscle. Nature, 305,147-148. Noma, A. & Takano, M. (1991). The ATP-sensitive K+ channels. Jap J Physiol, 41, 177187. Palkovits, M. & Brownstein, M. J. (1988). Maps and Guide to Microdissection of the Rat Brain. (Map No. 31, pp. 134-135). New York, NY, Elsevier Science Publishing Co. Pelletier, M. R., Pahapill, P. A., Pennefather, P. S. & Carlen, P. L. (2000). Analysis of single KATP channels in mammalian dentate gyrus granule cells. J Neurophysiol, 84, 22912301. Permutt, M. A., Wasson, J. & Cox, N. (2005). Genetic epidemiology of diabetes. J Clin Invest, 115, 1431-1439. Peters, A., Schweiger, U., Pellerin, L., Hubold, C., Oltmanns, K. M., Conrad, M., Schultes, B., Born, J. & Fehm, H. L. (2004). The selfish brain: competition for energy resources. Neurosci Biobehav Rev, 28, 143–180. Pfeuffer, J., Tkac, I. & Gruetter R. (2000). Extracellular-intracellular distribution of glucose and lactate in the rat brain assessed noninvasively by diffusion-weighted 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy in vivo. J Cereb Blood Flow Metab, 20, 736-746. 85 Popovic, M., Biessels, G.-J., Isaacson, R. L. & Gispen, W. H. (2001). Learning and memory in streptozotocin-induced diabetic rats in a novel spatial/object discrimination task. Behav Brain Res, 122, 201-207. Quayle, J. M., Nelson, M. T. & Standen, N.B. (1997). ATP-sensitive and inwardly rectifying potassium channels in smooth muscle. Physiol Rev, 77, 1165-1232. Raffaelli, G., Saviane, C., Mohajerani, M. H., Pedarzani, P. & Cherubini, E. (2004). BK potassium channels control transmitter release at CA3-CA3 synapses in the rat hippocampus. J Physiol, 15, 147-157. Reshef, A., Sperling, O. & Zoref-Shani, E. (2000). Role of K(ATP) channels in the induction of ischemic tolerance by the 'adenosine mechanism' in neuronal cultures. Adv Exp Med Biol, 486, 217-221. Ristoiu, V., Pluteanu, F., Flonta, M. L. & Reid, G. (2002). Few cultured rat primary sensory neurons express a tolbutamide-sensitive K+ current. J. Cell Mol. Med. 6, 271-274. Routh, V. H., McArdle, J. J. & Levin, B. E. (1997). Phosphorylation modulates the activity of the ATP-sensitive K+ channel in the ventromedial hypothalamic nucleus. Brain Res. 778:107-19. Russell, J. W., Sullivan, K. A., Windebank, A. J., Hermann, D. N. & Feldman, E. L. (1999). Neurons undergo apoptosis in animal and cell cultures models of diabetes. Neurobiol Dis, 6, 347-363. Sakura, H., Ashcroft, S. J., Terauchi, Y., Kadowaki, T. & Ashcroft, F. M. (1998). Glucose modulation of ATP-sensitive K-currents in wild-type, homocygous and heterocygous glucokinase knock-out mice. Diabetologia, 41, 654-659. Sales, C. H. & Pedrasa, L. de F. (2006). Magnesium and diabetes mellitus: their relation. Clin Nutr, 25, 554-562. Schubert, M., Brazil, D., Burks, D., Kushner, J., Ye, J., Flint, C., Farhang-Fallah, J., Dikkes, P., Warot, X., Rio, C., Corfas, G. & White, M. (2003). Insulin receptor substrate-2 deficiency impairs brain growth and promotes Tau phosphorylation. J Neurosc, 23, 78847892. Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H. & Newgard, C. B. (1994). STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells. Diabetes 43, 1326-1333. Schulz, L. O., Bennett, P. H., Ravussin, E., Kidd, J.R., Kidd, K. K., Esparza, J. & Valencia, M. E. (2006). Effects of traditional and western environments on prevalence of type 2 diabetes in Pima Indians in Mexico and the U.S. Diabetes Care, 29, 1866-1871. Scoville, W. B. & Milner, B. (1957). Loss of recent memory after bilateral hyppocampal lesions. J Neurol. Neurosurg Psychiatry, 20, 11-21. Seino, S. & Miki, T. (2003). Physiological and pathophysiological roles of ATP-sensitive K+ channels. Prog Biophys Mol Biol, 81, 133-176. 86 Sheetz, M. J. & King, J. L. (2002). Molecular understanding of hyperglycemia´s adverse effects for diabetic complications. JAMA, 288, 2579-2587. Shimoni, Y., Light, P. E. & French, R. J. (1998). Altered ATP sensitivity of ATPdependent K+ channels in diabetic rat hearts. Am J Physiol, 275, E568-E576. Shyng, S. L., Sha, Q., Ferrigni, T., Lopatin, A. N. & Nichols, C. G. (1996). Depletion of intracellular polyamines relieves inward rectification of potassium channels. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 12014–12019. Schwanstecher, C. & Bassen, D. (1997). KATP-channel on the somata of spiny neurones in rat caudate nucleus: regulation by drugs and nucleotides. Br J Pharmacol, 121, 193-198. Silver, I. A & Erecinska, M. (1994). Extracellular glucose concentration in mammalian brain: continuous monitoring of changes during increased neuronal activity and upon limitation in oxygen supply in normo-, hypo-, and hyperglycemic animals. J Neurosci, 14, 5068-5076. Sima, A. A., Kamiya, H. & Li, Z. G. (2004). Insulin, C-peptide, hyperglycemia, and central nervous system complications in diabetes. Eur J Pharmacol, 490, 187-197. Singh, P., Jain, A. & Kaur, G. (2004). Impact of hypoglycemia and diabetes on CNS: correlation of mitochondrial oxidative stress with DNA damage. Mol Cell Biochem, 260, 153-159. Smith, J. M. & Wahler, G. M. (1996). ATP-sensitive potassium channels are altered in ventricular myocytes from diabetic rats. Mol Cell Biochem, 158, 43-51. Sodder, V. H., Bowie, L. D. & Cameron, J. S. (1996). Trypsin alters ATP sensitivity of KATP channels in control and hypertrophied myocytes. Eur J Pharmacol, 315, 115-118. Sokoloff, L. (2004). Energy metabolism in neural tissues in vivo at rest and in functionally altered states. En: Shulman, R. G. y Rothman D. L. (Eds.), Brain Energetics and Neuronal Activity . New York, NY. John Wiley & Sons. Sommerfield, A. J., Deary, I. J. & Frier, B. M. (2004). Acute hyperglycemia alters mood state and impairs cognitive performance in people with type 2 diabetes. Diabetes Care, 27, 2335-2340. Song, Y., He, K., Levitan, E. B., Manson, J. E. & Liu, S. (2006). Effects of oral magnesium supplementation on glycaemic control in Type 2 diabetes: a meta-analysis of randomized double-blind controlled trials. Diabet Med, 10, 1050-1056. Spanswick, D., Smith, M.A., Groppi, V. E., Logan, S. D. & Ashford, M.L. (1997). Leptin inhibits hypothalamic neurons by activation of ATP-sensitive potassium channels. Nature, 390, 521-525. Spruce, A. E., Standen, N. B. & Stanfield, P. R. (1985). Voltage-dependent ATP-sensitive potassium channel of skeletal muscle membrane. Nature, 316, 736-738. 87 Standen, N. B., Quayle, J. M., Davies, N. W., Brayden, J. E, Huang, Y. & Nelson, M. T. (1989). Hyperpolarizing vasodilators activate ATP-sensitive K+ channels in arterial smooth muscle. Science, 245, 177-180. Stevens, M. J., Obrosova, I., Feldman, E. L., Greene, D. A. (2000). The sorbitol-osmotic and sorbitol-redox hypothesis. En: LeRoith, D., Taylor, S. I., Olefsky, J. M. (Eds.), Diabetes mellitus: a fundamental and clinical text (pp.972–983). Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. Stewart, R. & Liolitsa, D. (1999). Type 2 diabetes mellitus, cognitive impairment and dementia. Diabet Med, 16, 93-112. Sun, H., Feng, Z., Miki, T., Seino, S. & French, R. J. (2006). Enhanced neuronal damage after ischemic insults in mice lacking Kir6.2-containing ATP-sensitive K+ channels. Neurophysiol, 95, 2590-2601. Szkudelski, T. (2001). The mechanism of alloxan and streptozotocin action in β cells of the rat pancreas. Physiol Res, 50, 536-546. Tekkok, S. & Krnjevic, K. (1999). Diabetes mellitus preserves synaptic plasticity in hippocampal slices from middle-aged rats. Neuroscience, 91, 185-191. Terzic, A., Jahangir, A. & Kurachi, Y. (1995). Cardiac ATP-sensitive K+ channels: Regulation by intracellular nucleotides and K+ channel-opening drugs. Am J Physiol, 269, C525-C545. Tricarico, D. & Camerino, D. C. (1994). ATP-sensitive K+ channels of skeletal muscle fibers from young adult and aged rats: possible involvement of thiol-dependent redox mechanisms in the age-related modifications of their biophysical and pharmacological properties. Mol Pharmacol, 46, 754-761. Tromba, C., Salvaggio, A., Racagni, G., & Volterra, A. (1992). Hypoglycaemia-activated K+ channels in hippocampal neurons. Neurosci Lett, 143, 185-189. Tromba, C., Salvaggio, A., Racagni, G., & Volterra, A. (1994). Hippocampal hypoglycaemia-activated K+ channels: single-channel analysis of glucose and voltage dependence. Pflugers Arch, 429, 58-63. Trujillo-Hernández, B., Huerta, M., Pérez-Vargas, D., Trujillo, X. & Vásquez, C. (2003). Blink reflex alterations in recently diagnosed diabetic patients. J Clin Neurosci, 10, 306309. Tuck, R. R., Schmelzer, J. D. & Low, P. A. (1984). Endoneurial blood flow and oxygen tension in the sciatic nerves of rats with experimental diabetic neuropathy. Brain, 107, 935940. Uemura, E. & West, G. H. (2006). Insulin regulates neuronal glucose uptake by promoting translocation of glucose transporter GLUT3. Exp Neurol 198, 48-53. 88 van Harten, B., Oosterman, J., Muslimovic, D., van Loon, B. J., Scheltens, P. & Weinstein, H. C. (2007). Cognitive impairment and MRI correlates in the elderly patients with type 2 diabetes mellitus. Age Ageing, 36, 164-170. Velasco, M., García, E. & Onetti, C. G. (2006). Glucose deprivation activates diversity of potassium channels in cultured rat hippocampal neurons. Cell Mol Neurobiol, 26, 307–319. Vinik, A., Holland, M., Le Beau, J., Liuzzi, F., Stansberry, K. & Colen, L. (1992). Diabetic neuropathies. Diabetes Care, 15, 1926-1975. Vionnet, N., Stoffel, M., Takeda, J., Yasuda, K., Bell, G. I., Zouali, H., Lesage, S., Velho, G., Iris, F., Passa, P., et al. (1992).Nonsense mutation in the glucokinase gene causes earlyonset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature,356, 721-722. Wautier, J. L. & Guillauseau, P. J. (2001). Advanced glycation end products, their receptors and diabetic angiopathy. Diabetes Metab, 27, 535-542. Wei, M., Ong, L., Smith, M. T., Ross, F. B., Schmid, K., Hoey, A.J., Burstow, D. & Brown, L. (2003). The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complications of human diabetes. Heart Lung Circ,12, 44-50. Wolff, S. P. (1993). Diabetes mellitus and free radicals, transition metals and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus and complications. Br Med Bull, 49, 642-652. Wolff, S. P., Jiang, Z. Y. & Hunt, J. V. (1991). Protein glycation and oxidative stress in diabetes mellitus and ageing. Free Radic Biol Med, 10, 339-352. Wu, S. N., Li, H. F. & Chiang H. T. (2000).Characterization of ATP-sensitive potassium channels functionally expressed in pituitary GH3 cells. J Membr Biol, 178, 205-214. Wang, Z. & Gleichmann, H. (1995). Glucose transporter 2 expression: prevention of streptozotocin-induced reduction in beta-cells with 5-thio-D-glucose. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 103, 83-97. Wang, Z., Eldstrom, J. R., Jantzi, J., Moore, E. D. & Fedida D. (2004). Increased focal Kv4.2 channel expression at the plasma membrane is the result of actin depolymerization. Am J Physiol, 286, H749-H759. World Health Organization, (2003). Screening for Type 2 Diabetes. Report of a World Health Organization and International Diabetes Federation meeting. (No. de publicación WHO/NMH/MNC/03.1). Geneva, Switzerland: Publications of the World Health Organization. Yokoshiki, H., Sunagawa, M., Seki, T. & Sperelakis, N. (1998). ATP-sensitive K+ channels in pancreatic, cardiac, and vascular smooth muscle cells. Am J Physiol, 274, C25C37. 89 Zawar, C., Plant, T. D., Schirra, C., Konnerth, A. & Neumcke, B. (1999). Cell-type specific expression of ATP-sensitive potassium channels in the rat hippocampus. J Physiol, 514, 327-341. Zochodne, D. W., Ho, L.T. & Allison, J. A. (1994). Dorsal root ganglia microenviroment of female BB Wistar diabetic rats with mild neuropathy. J Neurol Sci, 127, 36-42. Zochodne, D. W., Verge, V. M., Cheng, C., Sun, H. & Johnston, J. (2001). Does diabetes target ganglion neurons? Progressive sensory neuron involvement in long-term experimental diabetes. Brain 124, 2319-2334. 90