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Universidad de Colima
Facultad de Medicina
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
MODIFICACIONES EN LAS PROPIEDADES BIOFÍSICAS DE LOS
CANALES DE POTASIO SENSIBLES AL ATP DE NEURONAS
HIPOCAMPALES EN LA DIABETES EXPERIMENTAL EN RATA
Tesis
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias Fisiológicas
Con especialidad en Fisiología
PRESENTA
M. en C. Armando Obregón Herrera
Asesor
Dr. Carlos Guillermo Onetti Percello
Co-asesor
Dr. Sergio Márquez Gamiño
Colima, Col., Junio 2007
Índice
Pag.
Índice de Figuras
5
Índice de Tablas
6
Resumenes
Español
7
Inglés
9
Introducción
11
Diabetes mellitus
11
Homeostasis de la glucosa en el cerebro
13
Neuropatía diabética
16
Daño cognoscitivo en la diabetes
20
El hipocampo, la memoria y el aprendizaje
23
Los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP)
25
Hipótesis
30
Objetivos
32
Materiales y Métodos
33
Animales utilizados
33
Inducción de la diabetes
33
Obtención de rebanadas
33
Registros electrofisiológicos
34
Soluciones
36
Rebanadas delgadas para observación de la morfología celular
37
38
Resultados
1. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas control
38
Ubicación de las neuronas CA3 en rebanadas del hipocampo
38
Potenciales de acción en neuronas CA3 del hipocampo
40
Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+
41
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia
42
de voltaje de los canales de K+ que mostraron sensibilidad a
glucosa en la condición “cell-attached”
3
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y
46
dependencia de voltaje en condiciones de K+ isométrico
Sensibilidad de los canales de K+ sensibles a glucosa al ATP
50
Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales
53
+
de K sensibles al ATP
2. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas
54
Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+
54
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia
56
de voltaje en condiciones de K+ simétrico
Sensibilidad al ATP
59
Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de
61
K+ sensibles al ATP
63
Discusión
Propiedades biofísicas de los canales KATP en neuronas piramidales
63
CA3 del hipocampo.
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de
66
voltaje de los canales KATP en células piramidales CA3 del
hipocampo de ratas diabéticas.
Cambio en la sensibilidad al ATP de los canales KATP en neuronas
69
diabéticas.
Sensibilidad a la glucosa de los canales KATP en neuronas control y
72
diabéticas.
Conclusiones
75
Perspectivas
76
Bibliografía
77
4
Índice de Figuras
Figura No.
1
Pag.
Representación esquemática de las relaciones citológicas existentes
14
entre capilares, astrocitos (glia) y neuronas.
2
Topología de las subunidades SUR y Kir 6.X y su ensamblaje para
24
formar un canal KATP.
3
Esquema que muestra la relación entre el metabolismo de la glucosa,
26
los cambios en la proporción de ATP/ADP, la actividad de los
canales KATP y la despolarización de la célula nerviosa.
4
Corte coronal de hipocampo de rata teñido visto al microscopio
28
de luz.
5
Esquema que muestra el dispositivo experimental utilizado para la
35
obtención de los registros electrofisiológicos.
6
Hipocampo de rata teñido con azul de metileno.
39
7
Potenciales de acción característicos de las neuronas piramidales
40
CA3.
8
Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a
41
glucosa en la configuración “cell-attached”.
9
Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a
43
glucosa en la configuración “cell-attached”.
10
Actividad de los canales de KATP en el estado estable y cinética
45
de su dependencia al voltaje.
11
Cinética de los tiempos de apertura y cierre para el canal de
46
potasio sensible a glucosa.
12
Actividad unitaria de los canales KATP y efecto “run down”.
47
13
Actividad unitaria de canales KATP de neuronas hipocampales CA3.
48
14
Relación corriente-voltaje de los canales KATP obtenidos de
49
neuronas hipocampales CA3.
15
Cinética de la dependencia de voltaje de los canales de KATP de
50
neuronas CA3 de hipocampo.
16
Sensibilidad de los canales membranales KATP de neuronas CA3
5
52
del hipocampo al ATP.
17
Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales
53
KATP de membrana en neuronas CA3 de hipocampo.
18
Efecto de la glucosa sobre la actividad de canales unitarios de
55
neuronas hipocampales CA3 de ratas diabéticas.
19
Actividad unitaria de canales KATP de neuronas CA3 de
56
hipocampo de rata diabética.
20
Relación corriente-voltaje de los canales KATP de neuronas
57
CA3 de rata diabética.
21
Dependencia al voltaje de la actividad de los canales KATP de
58
neuronas CA3 de hipocampo de la rata diabética.
22
Sensibilidad al ATP de los canales KATP de membranas
60
neuronales CA3 de la rata diabética.
23
Efecto de la glibenclamida en los canales KATP de membranas
61
de neuronas CA3 de la rata diabética.
Índice de Tablas
Tabla No.
Pag.
1
Propiedades de canales KATP en distintos tejidos
29
2
Propiedades de canales KATP en cerebro.
31
3
Composición de las soluciones experimentales (mM).
36
4
Parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas CA3 de
62
hipocampo.
6
Resumen
La diabetes mellitus representa actualmente uno de los principales problemas de
salud pública en nuestro país. Dentro de las complicaciones de esta enfermedad la
neuropatía diabética cobra especial relevancia. Consiste en el daño del sistema nervioso
como resultado de la hiperglucemia y/o de la alteración en la acción de la insulina, entre
otros factores. Actualmente se considera que la diabetes causa daño estructural y funcional
en el sistema nervioso central, afectando la memoria y el aprendizaje. En el cerebro, los
canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) se encuentran ampliamente distribuidos
y son de gran importancia en actividades neuronales fundamentales, acoplando el
metabolismo a la excitabilidad neuronal, liberación de neurotransmisores, secreción de
hormonas y citoprotección. Estas fracciones se ven alteradas en la neuropatía diabética. El
objetivo de este estudio fue evaluar si en la diabetes experimental existe modificación en
las propiedades biofísicas de los canales KATP presentes en la membrana de neuronas de la
región CA3 del hipocampo de rata.
Para ello, se utilizó la técnica de “patch clamp” en las configuraciones “cell-attached” e
“inside-out” y se estudiaron los efectos de la glucosa, el trifosfato de adenosina (ATP) y la
glibenclamida, sobre los canales KATP, en neuronas CA3 en rebanadas de hipocampo de
ratas sanas y diabéticas inducidas experimentalmente con estreptozotocina.
Los resultados muestran que la glucosa (20 mM) aplicada en el medio extracelular
suprimió la actividad de los canales KATP en neuronas control. Sin embargo, hasta una
concentración de 50 mM, no bloqueó la actividad del canal en las células diabéticas. En
registros obtenidos en “inside-out patch-clamp”, el ATP y la glibenclamida bloquearon la
actividad de los canales KATP en ambos grupos. Interesantemente, las constantes de
disociación (KD) para el ATP, obtenidas usando la ecuasión de Hill, fueron de 0.25 y 0.59
mM para neuronas control y diabéticas respectivamente, indicando una disminución de la
sensibilidad al ATP del canal KATP en esta última condición. La probabilidad de apertura
del canal KATP fue dependiente de la concentración de ATP. En el mismo orden, controles
y diabéticas, los valores del coeficiente de Hill (h) (2.4 y 2.1), de la conductancia unitaria
para potenciales negativos (178.5 y 177.4 pS) y de la permeabilidad al potasio (3.74 x 10-13
y 3.84 x 10-13 cm/s) de los canales KATP fueron similares. Sin embargo, la rectificación
entrante que se observó en las neuronas control no se presentó en las diabéticas. La
probabilidad de apertura de los canales KATP fue dependiente de voltaje en las dos
7
condiciones de estudio. En las neuronas control los valores del potencial de membrana al
50% de activación (V1/2) y la sensibilidad al voltaje (k) fueron de 2.1 ± 0.6 y 11.1 ± 0.3
mV, respectivamente. En neuronas diabéticas los valores, en la misma secuencia fueron de
5.3 ± 0.6 y 11.2 ± 0.4 mV.
La ausencia de efecto inhibitorio de la glucosa sobre los canales KATP en la diabetes podría
deberse a la disminución de la sensibilidad del canal al ATP. Sin embargo, no se descarta
la posibilidad de que la glucosa no sea transportada al citoplasma o alguna alteración en la
ruta metabólica que impida la síntesis de ATP, o ambas.
8
Abstract
Diabetes mellitus (DM) is at this time one of the main problems of public health in
Mexico. Within DM complications, the neuropathy (DN) has a special relevance. DN is the
damage of the nervous system resulting from hiperglycemia and/or alteration in the insulin
effect, among other factors. It has been reported DM is a cause of structural and functional
damage in the central nervous system, affecting memory and learning. In the brain, the
ATP-sensitive potassium channels (KATP) are widely distributed and play a relevant role in
fundamental neuronal activities matching metabolism and neuronal excitability,
influencing neurotransmitters release and hormone secretion, as well as participating of the
citoprotective mechanisms. All of the mentioned functions are altered in DN. This study
was addressed to evaluate functional modifications of KATP channels in membranes of
hippocampal CA3 neurons from experimentally induced diabetic rats. Using the patch
clamp technique in both, cell-attached and inside-out configurations, glucose, adenosine
triphosphate (ATP) and glibenclamide effects were studied. Glucose (20 mM) in
extracellular solution suppressed the KATP channels activity in control neurons. However,
even at concentrations as high as 50 mM, not channels activity blockage was observed in
diabetic cells. In inside-out patches ATP and glibenclamide blocked the activity of KATP
channels from both, the experimental and control groups. Interestingly, the ATP
dissociation constants (KD), obtained through Hill analysis were 0.25 and 0.59 mM for
control and diabetics neurons respectively. The latter indicating a KATP channel sensitivity
reduction to ATP in the diabetic condition. The open probability was dependent of ATP
concentrations. The control and diabetic values were similar for the Hill coefficient (h) (2.4
and 2.1), the unitary conductance at negative potentials (178.5 and 177.4 pS) and the
permeability to potassium of KATP channels (3.74X10-13 and 3.84X10-13 cm/s).
Nevertheless, the inward rectification observed in control neurons was not evident in the
diabetic condition. The KATP channels open probability displayed voltage dependency in
the two study conditions. In control neurons the half activation membrane potential (V1/2)
and voltage sensitivity (k) were 2.1± 0.6 and 11.1 ± 0.3 mV, respectively. In diabetic
neurons V1/2 was 5.3 ± 0.6 while k was 11.2 ± 0.4 mV. The absence of an inhibitory effect
of glucose on KATP channels activity in diabetes could be due to channel sensitivity to ATP
9
reduction. This effect could either be produced by a lack of glucose transport through the
cell membrane or by alterations in the metabolic route, decreasing the ATP synthesis.
10
Introducción
Diabetes mellitus
Es un síndrome donde se altera el metabolismo de los carbohidratos, grasas y
proteínas, caracterizado por aumento anormal de la glucosa sanguínea, resultante de la
secreción defectuosa de insulina o de resistencia a la acción de la misma, o ambas (The
Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, ECDCDM,
2003). Los síntomas de la hiperglucemia que se presentan en la diabetes mellitus (DM)
incluyen poliuria, polidipsia, pérdida de peso, fatiga, algunas veces polifagia y visión
borrosa (Félix, 2005).
Actualmente, esta enfermedad es considerada una epidemia. Se estima que el número total
de personas con diabetes en el mundo es de 173 millones y se calcula que para el año 2030
serán 350 millones. Alrededor de dos tercios de estos pacientes viven en países en vías de
desarrollo (WHO, 2003). Se atribuye el aumento súbito de los últimos años en la
incidencia de DM al aumento de la obesidad más que a factores genéticos (Permutt,
Wasson & Cox, 2005; Lazar, 2005).
En México, un país en desarrollo, la DM representa uno de los principales problemas de
salud pública. En 1994, la República Mexicana ocupó el décimo lugar mundial con casi 4
millones de enfermos. Actualmente, se estima que la población afectada fluctúa entre 6.5 y
10 millones (prevalencia nacional de 10.7% en personas de 20 a 69 años), de los cuales, se
estima que 2 millones de personas no han sido diagnosticadas (Federación Mexicana de
Diabetes, 2007).
A través del tiempo la diabetes mellitus ha tenido diversas clasificaciones, sus diferentes
formas fueron redefinidas por el ECDCDM, en 2003:
a) Tipo 1, conocida anteriormente como diabetes dependiente de insulina (IDDM),
caracterizada por destrucción autoinmune de las células β del páncreas, conduciendo a la
deficiencia de insulina. Los individuos con riesgo elevado de desarrollar este tipo de
diabetes pueden ser detectados en la mayoría de los casos mediante pruebas serológicas de
11
los procesos patológicos autoinmunes que afectan a los islotes pancreáticos, asimismo por
marcadores genéticos. Los portadores de DM tipo 1 requieren de tratamiento con insulina
para sobrevivir, ya que sin ella se produce cetoacidosis debido al metabolismo de las
grasas utilizado para sustituir la falta de glucosa dentro de las células, lo que constituye una
complicación grave de la diabetes.
b) Tipo 2, conocida anteriormente como diabetes no dependiente de insulina (NIDDM), se
caracteriza por la combinación de resistencia de algunos tejidos a la acción de la insulina y
por tanto una deficiencia relativa de la misma. El origen de este tipo de diabetes es
multifactorial, usualmente ocurre en individuos obesos y está asociada con hipertensión y
con aumento de grasas en sangre denominado dislipidemia. También existe una fuerte
predisposición genética, aunque este factor es complejo y no está claramente definido ya
que no sigue un patrón Mendeliano. Por lo que se infiere que es de origen poligénico
(Nichols & Koster, 2002). Esta última posibilidad esta apoyada por estudios de mapeo
genético en poblaciones ó grupos genealógicos específicos, particularmente en los indios
Pima, quienes presentan prevalencia de diabetes de hasta el 40% (Schulz et al. 2006). A
diferencia de la enfermedad tipo 1, en la diabetes tipo 2 la secreción de insulina puede ser
estimulada por drogas, tales como las sulfonilureas (tolbutamida, glibenclamida, etc.)
(Ashcroft & Ashcroft, 1992).
La historia natural de la diabetes mellitus tipo 2 generalmente inicia con obesidad, los
pacientes frecuentemente manifiestan el llamado síndrome metabólico o síndrome X, el
cual está significativamente asociado con resistencia a la acción de la insulina, a la
posterior deficiencia de la misma y a la presentación de la enfermedad con los signos y
síntomas característicos (Lazar, 2005). En consecuencia se generan complicaciones entre
las que destacan la retinopatía, el daño renal y las neuropatías central y periférica.
c) Otros tipos de diabetes con origen específico diferente, agrupan a los asociados a
defectos genéticos que afectan la función de las células β pancreáticas, como ocurre en
enfermedades específicas del páncreas por disrregulación endocrina, infecciones, trauma,
etc.
d) La diabetes mellitus gestacional (GDM), es definida como cualquier grado de
intolerancia a la glucosa con un inicio o primer reconocimiento durante el embarazo.
12
Homeostasis de la glucosa en el cerebro.
En condiciones normales, la glucemia sistémica de un individuo varía entre 70
mg/dl (3.8 mM) y 120 mg/dl (6.6 mM), mientras que las concentraciones in vivo en el
espacio extracelular del cerebro (en rata) oscilan entre 0.5 y 2.0 mM de glucosa (Silver &
Erecinska, 1994). El consumo cerebral de energía, comparado con la pequeña proporción
que este órgano representa de la masa corporal del organismo, es mucho mayor que el de
otros órganos y tejidos, como el músculo (Sokoloff, 2004). Debido a que la necesidad
energética en cerebro es cubierta primordialmente por la oxidación de la glucosa
(Sokoloff), el organismo “asegura” niveles mínimos de ella, para que no le falte en ningún
momento.
En la hipoglucemia el humano pierde coordinación de movimientos, muestra debilidad,
temblor, transpiración excesiva y desmayo (Félix, 2005). Ante situaciones extremas, el
hígado que almacena aproximadamente 100 g de glucógeno, hidroliza a este último para
librar glucosa a la sangre y elevar su concentración.
El cerebro está separado de la circulación general por la barrera hematoencefálica (BHE)
(Nicholls, Martin & Wallace, 1992). Sin embargo, sustratos específicos como la glucosa, el
lactato y ciertas hormonas (insulina, leptina, etc.), ingresan al SNC por medio de
mecanismos específicos de transporte a través de la BHE (Banks, 1997).
Tomando en cuenta las evidencias encontradas sobre el metabolismo energético cerebral y
sus consecuencias sobre el resto del organismo, se ha propuesto que el cerebro representa
la más alta autoridad reguladora y el consumidor con la más alta prioridad por la glucosa.
Durante períodos de estrés y de escasez energética, el cerebro garantiza su propio aporte
aún a expensas de los demás órganos (Peters et al. 2004).
En el cerebro, además de neuronas y células gliales, existen otros tipos de células como las
endoteliales vasculares, que no sólo consumen energía sino que juegan un papel
fundamental en el aporte de sustratos a las neuronas. La función que juegan los astrocitos
como proveedores de sustratos energéticos a las neuronas activas es particularmente
importante (Deitmer, 2001), formando así una relación citológica entre los capilares del
cerebro, astrocitos y neuronas (Magistretti, 1999) (véase Figura 1).
13
Figura 1. Representación esquemática de las relaciones citológicas existentes entre
capilares, astrocitos (glia) y neuronas. Los astrocitos rodean capilares (arriba), y cubren
terminaciones neuronales (sinapsis) (abajo), lo que permite sensar la actividad sináptica y
acoplarla con la captación de sustratos provenientes de la circulación e intercambiar
metabolitos. Modificado de Magistretti, 1999.
14
El tejido cerebral necesita de grandes cantidades de energía para su funcionamiento
normal, la cual se encuentra almacenada principalmente en las moléculas de ATP. Esa
energía le permite regular y operar las conexiones sinápticas, algunos canales iónicos, así
como la síntesis, transportación, almacenamiento y liberación de diversas sustancias
(neurotransmisores, enzimas, etc.). Esencialmente, el consumo energético alto (75%)
ocurre debido a vias de señalización y el resto (25%) es utilizado para la actividad celular
que no involucra dichas vias de señalización, como son las actividades celulares básicas y
los potenciales de acción, receptores postsinápticos, potencial de reposo, reciclamiento del
glutamato, etc. (Mc. Kenna, Gruetter, Sonnewald, Waagepetersen & Schousboe, 2006). En
condiciones normales, cuando la concentración extracelular de glucosa sobrepasa a la
intracelular (Pfeuffer, Tkac & Gruetter, 2000), esta hexosa se transporta al interior de la
célula vía difusión facilitada por transportadores específicos (GLUTs), ya en el interior de
la célula se fosforila por una glucocinasa que cataliza su conversión a glucosa-6-fosfato. El
primer paso de la glucólisis juega un papel crítico en la homeostasis de la glucosa en
muchos tipos celulares incluyendo a las neuronas (Nichols & Koster, 2002). La
continuación de esa primera fase anaeróbica ocurre en el citoplasma y lleva a la producción
de ácido pirúvico, ácido láctico y dos moléculas de ATP. Después, en una fase aeróbica
mitocondrial, el ácido pirúvico es transformado en 36 moléculas de ATP, CO2 y agua. Esta
transformación ocurre a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y de la cadena
respiratoria. Se ha propuesto que el lactato formado durante el metabolismo de la glucosa
en las células gliales también puede ser usado por neuronas cerebrales activas como fuente
de energía bajo condiciones metabólicas especiales, por ejemplo, después de actividad
neural, cuando la función glucolítica está disminuida. También podría ser utilizado durante
la recuperación de una patología. Subrayando que la utilización directa de la glucosa por
las neuronas durante la actividad parece ser predominante (Chih, Lipton & Roberts, 2001).
En la DM la disponibilidad de glucosa para los tejidos es inadecuada, pues aunque el nivel
extracelular se incrementa (Silver & Erecinska, 1994), existe un déficit del metabolito en el
interior celular. Bajo esas condiciones, el exceso de glucosa eventualmente deriva a rutas
metabólicas alternativas que, como consecuencia, producen daño a diferentes órganos
(Sheetz & King, 2002). También, estudios recientes han esclarecido un mecanismo de
patogénesis que involucra cambios activos en la expresión génica, como el aumento de
vasopresina en neuronas del SNC, que desencadena en daño renal (Klein & Waxman,
15
2003). Otros mecanismos de adaptación operan en
las células (neuronas), ante la
imposibilidad de metabolizar la glucosa permitiendo la utilización de otros metabolitos
como los cuerpos cetónicos, como fuente de energía (Makar, Hungund, Cook, Kashfi &
Cooper, 1995), originando trastornos metabólicos.
Neuropatía diabética
Es una complicación de la diabetes mellitus que consiste en daño al sistema
nervioso como resultado de la hiperglicemia y/o de la alteración en la acción de la insulina,
entre otros factores. La neuropatía simétrica distal es la más frecuentemente asociada a la
diabetes mellitus (Vinik et al. 1992; Dyck et al. 1993). Los pacientes refieren una
sensación
o
conjunto
de
sensaciones
anormales,
especialmente
hormigueo,
adormecimiento o ardor en la piel, que afecta principalmente a las extremidades inferiores.
Durante el examen neurológico tanto de pacientes diabéticos sintomáticos como
asintomáticos, se detecta pérdida de sensación distal y disminución o pérdida del reflejo
del tobillo (Vinik et al. 1992; Dyck et al. 1993). Los exámenes electrofisiológicos
generalmente muestran disminución de la velocidad de conducción en nervios motores y
sensoriales (Arezzo, 1997).
Un segundo grupo, las neuropatías asimétricas focales y multifocales, resultan de un daño
repentino a un nervio o grupo de nervios en cualquier parte del cuerpo (cráneo, tronco,
etc.) causando debilidad muscular o dolor. En este caso el daño es dirigido preferentemente
a los nervios motores más que a los sensoriales (Funk, 2003).
En años recientes se ha encontrado evidencia en humanos y modelos experimentales de
animales diabéticos, que vincula hiperglucemia e hipoglucemia con alteraciones del
sistema nervioso central con daño cognitivo consecuente (Stewart & Liolitsa, 1999; Izumi,
Yamada, Matsukawa, & Zorumski, 2003; Sima, Kamiya, & Li, 2004; Li, Zhang, & Sima,
2005) A este tipo de neuropatía (encefalopatía) se le ha atribuido actualmente gran
importancia médica.
A pesar de que la neuropatía diabética central no ha sido suficientemente estudiada, se han
observado anormalidades en el cerebro de pacientes diabéticos. Entre ellas, se ha descrito
16
degeneración severa de las materias blanca y gris en estudios neuropatológicos y de
resonancia magnética, lo que hace suponer substrato orgánico para la encefalopatía
diabética (Gispen & Biessels, 2000).
La diabetes causa complicaciones primarias y secundarias del SNC, con daño tanto a su
integridad estructural como funcional (Sima et al. 2004; Li et al. 2005). La encefalopatía
diabética primaria es causada directamente por hiperglucemia y/o alteración en la acción
de la insulina; mientras que la secundaria es causada por eventos cerebrovasculares
derivados de la enfermedad vascular diabética o por tratamientos hipoglucemiantes
intensos, que potencialmente pueden producir daño cerebral por hipoglucemia (Li & Sima,
2004; Sima et al. 2004).
En humanos, no se conoce con exactitud cuando inicia el daño nervioso asociado a esta
entidad fisiopatológica. Lo que se atribuye a la carencia de una buena definición del cuadro
clínico de inicio y de los métodos usados para su detección. Varios estudios muestran
evidencias de que la neuropatía diabética empieza a desarrollarse hasta 10 años antes de
que se confirme el diagnóstico clínico de la diabetes (ECDCDM, 2003, TrujilloHernández, Huerta, Pérez-Vargas, Trujillo, & Vásquez, 2003). En modelos experimentales
de diabetes en ratas, en los que se induce la metabolopatía con estreptozotocina (STZ), se
reporta daño al SNC, específicamente en células granulares del giro dentado del
hipocampo, apenas 5 días después de la aplicación de la droga (Jackson-Guilford, Leander,
& Nisenbaum, 2000).
La STZ, un antibiótico obtenido de la bacteria del suelo Streptomyces achromogenes,
químicamente es nitrosourea de glucosamina. Este agente destruye selectivamente a las
células β pancreáticas (Szkudelski, 2001). Muchos de los conocimientos actuales de los
posibles mecanismos patogénicos de la neuropatía central provienen de estudios en ratas
tratadas con STZ (Greene, Stevens, & Feldman, 1999). La STZ es captada por las células β
vía el transportador de glucosa GLUT-2, el cual es expresado abundantemente en las
células productoras de insulina de los islotes pancreáticos (Schnedl, Ferber, Johnson &
Newgard, 1994). Hasta ahora, no se tienen referencias del paso directo de la STZ al
cerebro, debido a la ausencia de transportadores GLUT-2 en la barrera hematoencefálica
(Kumagai, 1999). Aunque el modelo de diabetes experimental inducido en animales con
STZ ha sido muy útil para el estudio de los efectos de la hiperglucemia y/o de las
17
alteraciones en la acción de la insulina, debe subrayarse que sus formas endocrinológicas
pudiesen no necesariamente reflejar los tipos 1 ó 2 de la diabetes (Gispen & Biessels,
2000). A pesar de lo anterior, ratas diabéticas inducidas con STZ, es un modelo aceptado
para el estudio de las complicaciones de la diabetes en humanos (Wei et al. 2003).
Por otra parte, existen roedores con diabetes tipo 2 genéticamente determinada, por
ejemplo las ratas Zucker fa/fa. Aunque esos modelos imitan razonablemente bien los
signos y ciertos aspectos endocrinológicos de la diabetes tipo 2, la mayoría de sus
características no han sido suficientemente estudiadas (Gispen & Biessels, 2000). Por ello,
el método de inducción experimental con STZ ha sido el modelo más utilizado.
Debido a que la hiperglucemia en la diabetes mellitus tipo 2 causa trastornos
microvasculares y puede además contribuir a trastornos macrovasculares, la diabetes no
diagnosticada es una condición de riesgo para enfermedades del corazón: coronariopatías,
infartos, hipertensión, etc.; así como para enfermedad cerebral (ECDCDM, 2003).
La fisiopatología de la neuropatía diabética se ha investigado en varias vertientes, como se
describe a continuación:
Los altos niveles de glucosa pueden afectar varias rutas metabólicas en células nerviosas y
en otros tejidos, produciendo daño en los mismos. Parte de la glucosa es metabolizada a
sorbitol por la aldosa reductasa. El sorbitol, a su vez, es oxidado a fructuosa por la sorbitol
deshidrogenasa (Evans, Goldfine, Maddux, & Grodsky, 2002; Stevens, Obrosova, Feldman
& Greene, 2000), también produce aumento en la osmolaridad celular, disminución del
mioinositol intracelular y alteraciones en la bomba Na+/K+-ATPasa retrasando la
conducción nerviosa, lo que a su vez produce daño tisular (Greene, Sima, Stevens,
Feldman, & Lattimer, 1992). Igualmente, se ha estudiado la asociación entre sorbitol y
óxido nítrico, que se sabe dilata los vasos sanguíneos por aumento en la producción de
GMP cíclico, en el músculo liso vascular. En ratas diabéticas genéticamente propensas se
demostraron cambios importantes en el flujo endoneural, que hacen suponer que en
personas con diabetes, los bajos niveles de óxido nítrico podrían ocasionar constricción
vascular, disminuyendo la irrigación de las células nerviosas (Zochodne, Ho & Alison,
1994) reduciendo el aporte de glucosa y oxígeno, con el consecuente daño celular de las
mismas (Zochodne, Verge, Cheng, Sun & Johnston, 2001).
18
Por otro lado, se ha estudiado el efecto de la diabetes en la cascada de transducción de
señales intracelulares en regiones cerebrales discretas, encontrando relación de la diabetes
con la atenuación del metabolismo de diacilglicerol, inositoltrifosfato, fosfolipasa C y
fosfolipasa A2, paralelamente con incremento de la actividad de las cAMP/proteina cinasas
A y C (Bhardwaj, Sandhu, Sharma & Kaur, 1999). Se atribuye a estos hechos un papel en
el desarrollo de la neuropatía central. La activación de la proteína cinasa C puede producir
deterioro en los vasos sanguíneos de la retina, riñón y tejido nervioso, así como daño
vascular con aumento de la permeabilidad, adhesión leucocitaria y alteración en el flujo
sanguíneo (Wautier & Guillauseau, 2001).
Asociados a fisiopatología de la neuropatía diabética, se presentan la isquemia del tejido
nervioso y el estrés oxidativo como otros factores involucrados en la génesis de esta
patología (Tuck, Schmelzer, & Low, 1984). Se sabe que con la isquemia ocurre
hiperpolarización y disminución de la excitabilidad celular en miocitos cardiacos y en
neuronas, reduciendo sus demandas metabólicas (Ashcroft & Ashcroft, 1990; Allen &
Brown, 2004; Ballanyi, 2004). Es posible que este efecto de protección isquémica se vea
disminuído en el corazón de los sujetos diabéticos (Del Valle, Lascano, & Negroni, 2002).
Rusell, Sullivan, Windebank, Hermann & Feldman (1999) sugirieron que el estrés
oxidativo puede promover cambios mitocondriales en neuronas y en cultivos neuronales de
animales diabéticos y conducir a la activación de la vía de las caspasas y de la muerte
celular programada. En el SNC, en diferentes zonas del cerebro de ratas diabéticas
inducidas con STZ se ha demostrado que el sistema “neutralizador” de los radicales libres
formados por el estrés oxidativo mitocondrial es desregulado, lo cual conduce al aumento
intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), que activan procesos que producen
daño al DNA y muerte neuronal (Singh, Jain & Kaur, 2004).
Otra área de investigación se refiere a la glucosilación no enzimática de proteínas, proceso
que altera la estructura y función de células nerviosas y vasculares (Brownlee, 1994). La
hiperglucemia presente en la diabetes per se causa autooxidación de lípidos y glucosilación
de proteínas como albumina, lipoproteínas de baja densidad e inmunoglobulina G, las que
pueden quedar unidas por enlaces covalentes al colágeno de la membrana basal del
endotelio, disminuyendo el lumen del vaso sanguineo y dificultando la circulación
19
(Gugliucci, 2000; Wolff, Jiang & Hunt, 1991; Wolff, 1993), lo que es de particular interés
en el cerebro (Nickander, McPhee, Low & Tritschler, 1996).
También ha sido explorado el campo concerniente a las deficiencias relativas de factores
de crecimiento neural en la polineuropatía diabética, ya que se sabe que estas sustancias
participan en la reparación y regeneración de nervios periféricos (Hellweg & Hartung,
1990).
Recientemente, Calcutt et al. (2003) reportaron que en ratas diabéticas está disminuida la
expresión de proteínas “desert hedgehod” (DHh), esenciales para el desarrollo del sistema
nervioso periférico tanto en el estado normal como en el patológico. Al tratar a los
animales diabéticos con una proteína de fusión hedgehog-IgG se revirtieron los efectos de
la neuropatía diabética, lo que sugiere su potencial uso terapéutico.
La actividad de las vías metabólicas afectadas en la diabetes y/o en la hiperglucemia no
depende de la actividad eléctrica neuronal, por tanto constituye una respuesta neural
electrofisiológicamente “pasiva”. Aunque los mecanismos asociados a la sobrecarga de
glucosa que afectan pasivamente a las vías metabólicas son los principales responsables de
la patología neural diabética, investigaciones recientes sugieren un segundo mecanismo
“activo” (Aragno et al, 2002; Klein, Craner, Cummins, Black & Waxman, 2002). El estado
diabético induce cambios en la transcripción genética neuronal en el hipocampo e
hipotálamo (Aragno et al.; Klein et al.; Klein & Waxman, 2003).
Daño cognoscitivo en la diabetes
La manifestación de desórdenes cerebrales diabéticos ha sido evidenciada a nivel
cognoscitivo,
estructural,
electrofisiológico,
y
neuroquímico
(Biessels,
Kapelle,
Bravenboer, Erkelens & Gispen, 1994; Di Mario, Morano, Valle & Pozzessere, 1995;
Helkala, Niskanen, Viinamaki, Partanen & Uusitupa, 1995; McCall, 1992; Kamal,
Biessels, Duis & Gispen, 2000).
En relación al daño cognoscitivo, estudios en pacientes diabéticos tipo 2 durante episodios
de hiperglucemia aguda (glucemia ≥ 300 mg/dl ó 6.5 mmol/l) después de 5.9 años de
duración conocida de la enfermedad, muestran alteración de la capacidad de conocer y
20
deterioro en el estado de ánimo. Se considera que estos hallazgos son de importancia
práctica debido a que la hiperglucemia crónica o intermitente es común en individuos con
diabetes tipo 2 y puede interferir con sus actividades diarias (Sommerfield, Deary & Frier,
2004). Varias áreas del cerebro parecen contribuir al déficit cognoscitivo asociado a la
diabetes mellitus (Heijer et al. 2003). Sin embargo, las tareas dependientes del hipocampo
parecen ser particularmente sensibles a la hiperglucemia (Li et al. 2005; Gold et al.). Las
pruebas de cognición en ratones y ratas con diabetes inducida por estreptozotocina, han
revelado resultados similares. Ratones diabéticos muestran déficit significativo en la
retención de la memoria y en tareas de evocación activa dependiente de hipocampo,
reversible con la administración de insulina (Flood, Mooradian & Morley, 1990). También
se observó en ratas adultas despues de 2,4,6 y 8 semanas de inducción de la diabetes,
deficiencia en la realización o en el rendimiento en tareas de memorización y aprendizaje
espacial. Estas deficiencias se agudizaron conforme aumentó la complejidad de las tareas
(Popovic, Biessels, Isaacson & Gispen, 2001).
En participantes jóvenes, con diabetes tipo 2, relativamente bien controlada, Gold et al.
(2007) encontraron una reducción en el volumen cerebral restringida al hipocampo
respecto a sujetos controles no diabéticos, estudiados con imagenes de resonancia
magnética. Paralelamente les detectaron déficit en el rendimiento de memoria hipocampal.
Hallazgos similares habían sido previamente descritos en adultos mayores, por lo que no se
consideraban observaciones suficientemente claras, ya que los efectos podrían asociarse a
otras patologías concomitantes, v. gr. insuficiencia vascular o al mismo proceso de
envejecimiento (van Harten et al. 2007). Este último reportó una correlación entre el daño
cognositivo y el tiempo de evolución de la DM.
El aprendizaje asociativo, la memoria y la evocación se han relacionado con cambios a
largo plazo en la eficacia sináptica entre neuronas hipocampales. Las alteraciones en la
señalización involucrada en estas funciones han sido estudiadas en modelos animales de
diabetes. Los defectos en la memoria declarativa (recuerdo de experiencias personales, uso
y acumulación del conocimiento), dependiente del hipocampo, parecen ser el resultado de
los efectos deletéreos de la hiperglucemia.
En ratas diabéticas existe deterioro progresivo de la plasticidad sináptica y del aprendizaje
(Kamal et al. 2000). Las alteraciones en la plasticidad sináptica asociadas con deficiencia
21
en el aprendizaje de tareas espaciales se previenen con la aplicación de insulina, pero no se
revierten una vez que el déficit en la ejecución de la tarea o en la LTP se han instalado
(Biessels et al. 1998). Asimismo, las ratas diabéticas muestran deficiencia en la retención y
en la recuperación de la información almacenada (Biessels et al. 1996). Se desconoce el
mecanismo por el que se dañan estas habilidades en la diabetes, se ha propuesto que la
diabetes inducida con STZ actúa como un estresor endógeno que induce cambios
estructurales en la región CA3 del hipocampo, particularmente retracción y simplificación
de las dendritas apicales. Dichos cambios son parcialmente coincidentes con los que se
producen como efecto del estrés exógeno ó de la administración de glucocorticoides.
Además, se ha demostrado que la diabetes experimental acelera los cambios producidos
por el estrés ambiental en ciertas regiones del hipocampo (Magariños & McEwen, 2000).
En otras palabras, la concentración de glucosa es importante para la plasticidad sináptica y
por lo tanto en la habilidad para aprender (Tekkok & Krnjevic, 1999).
Evidencias muestran que el proceso de neurogénesis (proliferación celular, sobrevivencia,
migración y diferenciación) continúa en el humano adulto (Gould, Tanapat, Hastings &
Shors, 1999). Sin embargo, en humanos con diabetes hay daño estructural demostrado
como degeneración severa de materia blanca y gris (Gispen & Biessels, 2000). Como fue
mencionado previamente, un estudio muestra que la proliferación celular disminuye
dramáticamente en el giro dentado del hipocampo de ratas diabéticas a los pocos días de
haber inducido la metabolopatía (Jackson-Guilford et al. 2000).
Por otra parte, se han evidenciado alteraciones electrofisiológicas, en células CA1 de
hipocampo de ratas diabéticas hay un incremento en la duración del potencial de acción
cuando se compara con la de animales control (Kamal, Artola, Biessels, Gispen &
Ramakers, 2003). Los autores señalan que estos potenciales de acción son similares a los
registrados en tejidos provenientes de ratas viejas. En la explicación se involucran
alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular. Sin embargo, no se demuestran
diferencias en el potencial de membrana en reposo, la resistencia de entrada, ni en la
constante de tiempo respecto a los controles.
También se han reportado incrementos en la sensibilidad en neuronas CA1, medida como
aumento en la amplitud y en el número de espigas, secundario al aumento de potasio
extracelular. Asimismo, como cambios en la velocidad de conducción. Ambos casos
22
estudiados en rebanadas de hipocampo de ratas diabéticas y comparadas con neuronas
control (Candy & Szatkowski, 2000a & 2000b). Los autores mencionan que estas
alteraciones podrían ocurrir como una consecuencia de daño en la actividad de la enzima
Na+,K+-ATPasa. Es de subrayarse que se ha comprobado una interacción funcional entre
esta enzima y los canales KATP en neuronas del SNC bajo condiciones experimentales de
isquemia cerebral (Akaike, Jin & Koyama, 1997). De lo cual se infiere que los canales
KATP en el SNC podrían verse afectados en otros trastornos metabólicos como la diabetes.
El hipocampo, la memoria y el aprendizaje
El hipocampo esta formado por el doblez interno de los lóbulos temporales del
cerebro, tiene forma de “C” y presenta 3 zonas: giro dentado, asta de Ammon y subículo.
El asta de Ammon se ha dividido en varios campos CA1, CA2, CA3 y CA4 (véase Figura
2). Está involucrado en las funciones cerebrales de consolidación de la memoria y el
aprendizaje, sin embargo los mecanismos celulares que soportan esta asociación no están
completamente esclarecidos (Jackson-Guilford, et al. 2000).
La asociación de la memoria y el aprendizaje con la estructura hipocampal quedó
establecida a partir de casos en los cuales el daño a estas funciones se asoció con lesiones
bilaterales confinadas al hipocampo (Scoville & Milner, 1957). Una lesión en esta zona
produce amnesia anterógrada o disminución de la habilidad para adquirir información
nueva o formación de nueva memoria, pero no afecta al aprendizaje de nuevas capacidades
o habilidades. Por ejemplo, una persona podría aprender a montar en bicicleta después de
la lesión, pero no recordaría haber visto nunca una bicicleta. Tales observaciones hacen
suponer que los cambios duraderos en la eficacia de señalización entre las neuronas del
hipocampo se pueden traducir en la consolidación de la memoria.
Una correlación celular de los cambios a largo plazo con la eficacia sináptica (plasticidad
sináptica) fue identificada por Bliss & Lomo en 1973, quienes demostraron que la
estimulación breve de alta frecuencia, de la zona aferente subicular del hipocampo, produjo
un incremento en la amplitud del potencial sináptico excitatorio, registrado en las neuronas
postsinápticas hipocampales CA1. Este efecto se prolonga por horas, días o incluso
semanas en el animal intacto.
23
A
B
Figura 2. A. En el lado derecho se muestra un corte coronal de cerebro de rata con insertos
para indicar las diferentes zonas. En el lado izquierdo se muestra un diagrama equivalente.
Arriba se observan los dos lóbulos que forman al hipocampo, situados debajo de la corteza
y orientados hacia cada uno de los hemisferios (Tomado de Palkovits y Brownstein, 1988).
B. Corte coronal de hipocampo de rata teñido con Hematoxilina-Eosina visto al
microscopio de luz. Observe las diferentes zonas del asta de Ammon (CA1, CA2, CA3 y
CA4) y el giro dentado (GD) (Tomado de Téllez et al. 2003).
24
Los autores llamaron a esta respuesta, potenciación de largo-término (LTP). Se sabe que la
LTP requiere tanto la liberación de glutamato como la despolarización de la célula
postsináptica. Estudios posteriores mostraron que las sinapsis son diferentes dependiendo
de la zona hipocampal. En CA1, la LTP tiene una acción asociativa y cooperativa. Es
asociativa porque dos o más estímulos sinápticos contribuyen a una ráfaga ó a ráfagas
repetidas en una neurona. Cualquier LTP resultante afecta a todas las sinapsis “asociadas”.
Es cooperativa porque muchos estímulos débiles, aplicados a vías que convergen en una
sóla, pueden, colectivamente despolarizar a la célula postsináptica e inducir la LTP. La
zona CA3 recibe conexiones sinápticas de las fibras musgosas de las células granulares del
núcleo dentado (Kapur, Yeckel, Gray & Johnston, 1998). Ahí la LTP es no asociativa, es
decir, se origina por el uso repetido de un estímulo, el carácter persistente de éste en la
sinapsis, acciona la entrada de calcio a la célula postsináptica (Nicholls et al. 1992).
Los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP)
Los canales KATP son canales de potasio pertenecientes a la familia de
rectificadores entrantes y estructuralmente son heteromultímeros formados por dos
subunidades, una de ellas que forma el poro del canal (Kir6.x) con dos subtipos (Kir6.1 ó
Kir6.2) y otra reguladora que es el receptor a sulfonilureas (SURs) con varias isoformas
dependiendo del tejido (SUR1, SUR2A ó SUR 2B). Los canales KATP son llamados así
porque su actividad es controlada por las concentraciones intracelulares de ATP y ADP.
Los canales Kir6.x tienen dos dominios transmembranales, mientras que los receptores
SUR poseen diecisiete dominios con esta característica. Ambas moléculas se ensamblan
para formar un canal octamérico funcional, con una relación estequiométrica 1:1 (Clement
et al. 1997). Las cuatro subunidades Kir forman el poro y las otras cuatro forman un anillo
exterior que abraza o cubre al poro y regulan la apertura y cierre del canal (Campbell,
Sansom, & Ashcroft, 2003). Estas últimas tienen dos dominios de enlace a nucleótidos
orientados hacia la cara citosólica (Clement et al.) (véase Figura 3).
25
SURx
KIR6.X
N
C
N
C
NBF-1
NBF-2
x
SUR
K IR6.X
(SURX/KIR6.X)4
Figura 3. Topología de las subunidades SURx y Kir6.X (arriba) y su ensamblaje para
formar un canal KATP (abajo). NBF-1 y NBF-2 indican los sitios de unión a nucleótidos. A
cada subunidad SURx se une una subunidad Kir6.X. Cuatro subunidades SURx y cuatro
Kir6.X forman el canal funcional.
Los canales KATP se encuentran distribuidos ampliamente en muchos tejidos y tipos
celulares. Originalmente se descubrieron en células cardiacas (Noma, 1983),
posteriormente se encontraron en otros tejidos y órganos, como en las células β
pancreáticas (Cook & Hales, 1984), cerebro (Ashford, Sturgess, Trout, Gardner, & Hales,
1988; Amoroso, Schmid-Antomarchi, Focet & Lazdunski, 1990), músculo liso (Standen et
al. 1989), músculo esquelético (Spruce, Standen & Stanfield, 1985), riñón (Hunter &
Giebisch, 1988) y en células ganglionares de la raíz dorsal (Ristoiu, Pluteanu, Flonta &
Reid, 2002).
26
En el cerebro, los canales KATP se encuentran ampliamente distribuidos. Se han
identificado en hipotálamo (Ashford, Boden, & Treherne, 1990 a, 1990 b), interneuronas
colinérgicas (Lee, Dixon, Freeman & Richardson, 1998), hipocampo (Velasco, García &
Onetti, 2006; Zawar, Plant, Schirra, Konnerth & Neumcke, 1999), globo pálido y pálido
ventral (Gehlert, Gackenheimer, Mais, & Robertson, 1991), sustancia nigra (Mourre,
Widmann & Lazdunski, 1990; Jiang, Sigworth & Haddad, 1994) y glándula pituitaria
(Bernardi et al. 1993).
Funcionalmente, los canales KATP son importantes para la secreción de insulina estimulada
por glucosa en las células β del páncreas (Ashcroft, 2000; Baukrowitz & Flaker, 2000).
Además, la actividad de los canales KATP es crítica en la respuesta cardiovascular
adaptativa al estrés metabólico como hipoxia, isquemia e inhibición metabólica cuando el
ATP está disminuido (Isomoto, 2003; Jahangir & Terzic, 2005). En músculo esquelético,
donde la actividad metabólica cambia dramáticamente por la contracción muscular, los
canales KATP permanecen inactivos en reposo y son activados durante la fatiga. La apertura
de estos canales incrementa las corrientes salientes de K+ que contribuyen al acortamiento
de la duración del potencial de acción y a la protección contra la sobrecarga de calcio
intracelular (Seino & Miki, 2003). Se sabe que la relajación de células de músculo liso
disociadas de arterias mesentéricas es mediada por la apertura de canales KATP y estos
parecen ser la conexión entre el metabolismo y la regulación del flujo sanguíneo, a través
de su dependencia al ATP (Standen et al., 1989; Isomoto; Seino & Miki). Por otra parte,
con base en estudios realizados en células de la membrana basolateral del túbulo
contorneado proximal de riñón de conejo, se ha propuesto que el acoplamiento de los
canales KATP a la bomba Na+,K+-ATPasa es un mecanismo por el cual se mantiene la
reabsorción de NaCl en el estado estable (Mauerer, Boulpaep & Segal, 1998).
En células nerviosas, los canales KATP actuan como sensores de la actividad metabólica. La
información concerniente al estado metabólico se traduce en información eléctrica, que
puede influenciar la excitabilidad de la membrana celular (Ashford et al. 1988). Como
resultado del metabolismo neuronal de la glucosa, se produce un incremento en la
proporción ATP/ADP que cierra los canales KATP y produce despolarización de la
membrana. Por el contrario, la deficiencia de glucosa disminuye la proporción ATP/ADP,
abre los canales KATP, aumenta la salida de potasio y la membrana se hiperpolariza. Si los
27
niveles de ATP son demasiado bajos la neurona se desactiva, es decir permanece silente
(Aguilar-Bryan & Bryan, 1999) (véase Figura 4). También se ha relacionado a estos
canales con otras actividades fisiológicas que incluyen la secreción de hormonas (Bernardi
et al. 1993) y la citoprotección durante periodos de estrés isquémico (Amoroso et al. 1990;
Terzic, Jahangir, & Karachi, 1995; Griesemer, Zawar & Neumcke, 2002). En este último
trabajo, se reporta que los canales KATP tienen un profundo efecto en la excitabilidad de las
neuronas del hipocampo, lo que implica que su activación durante la isquemia o la hipoxia
disminuye la actividad de las células piramidales excitatorias a niveles por abajo de lo que
ocurre en interneuronas inhibitorias (citoprotección selectiva).
Figura 4. Esquema que muestra la relación entre el metabolismo de la glucosa, los
cambios en la proporción de ATP/ADP, la actividad de los canales KATP y la
despolarización de la célula nerviosa.
Los canales KATP tienen diferentes propiedades biofísicas y farmacológicas dependiendo de
el tejido donde se encuentren, se muestran la Tabla 1. la caracterización de estos ha sido
reportada utilizando la técnica de “patch clamp” en sus diferentes configuraciones.
28
Tabla 1. Propiedades de canales KATP en diferentes tejidos*
Tejido
Subunidades
Pancreático
Musculo
cardiaco
Musculo liso
SUR1/Kir6.2
SUR2A/Kir6.2
SUR2B/Kir6.2
SUR2B/Kir6.1
SUR2A/Kir6.2
Conduc
tancia
(pS)
50-65
80
Sensibilidad a
ATP
IC50 (µM)
10-20
17-100
Sensibilidad a
Glibenclamida
IC50 (µM)
5 nM
1.5
Potencia
de KCOs
20-50
53
20
3
1-20
P=C>D
D>P>C
P=C
Musculo
20-135
135
P=C
esqueletico
Nervioso
SUR1/Kir6.2
26-200
100-3000
6-100
C =P>D
* Tejidos de rata y ratón. Glib: glibenclamida, KCOs: activadores de los canales de potasio; D: Diazóxido, P:
Pinacidil, C:Cromakalim. Modificada de: Babenko et al. 1998 y Karla Vera, 2006. Proyecto Doctoral.
Las propiedades de los canales KATP de algunas regiones cerebrales representativas se
muestran en la Tabla 2. También la caracterización de éstos ha sido reportada utilizando la
técnica de “patch clamp” en sus distintas configuraciones, en células neocorticales por
Jiang y Haddad (1997) y en neuronas del giro dentado por Pelletier, Pahapill, Pennefather
y Carlen (2000). En las células neocorticales se han encontrado dos tipos de canales KATP
con conductancias diferentes: Uno con un valor de 47 pS, su inhibición por ATP presenta
una IC50 de 130 µM mientras que con glibenclamida varió entre 10 y 20 µM. El otro tiene
una conductancia de 180 pS, es inhibido marcadamente por ATP (IC50 = 350 µM) y de
manera similar por la glibenclamida. En el caso de las células del giro dentado del
hipocampo el valor de conductancia del canal es de 27 pS, se inhibe por ATP y SU (20 100 µM para tolbutamida y 10 µM para glibenclamida) (Pelletier et al., 2000).
Experimentos realizados en nuestro laboratorio evidenciaron, en neuronas de hipocampo
de rata en cultivo primario, dos canales en la configuración “cell-attached” con
conductancias de 41 y 133 pS. Además, en la configuración “inside-out” se observó otro
canal con conductancia de 230 pS (Velasco et al.. 2006). Se han reportado en la literatura
todos los posibles patrones de coexpresión de Kir6.1 ó Kir6.2 y SUR1 ó SUR2A en
diferentes poblaciones neuronales (Babenko, Aguilar-Bryan & Bryan, 1998) y por
ingeniería genética se han generado ratones cuyas células poseen canales KATP deficientes
en la subunidad Kir6.2 (knockout de Kir6.2), en los cuales la respuesta a glucosa y
secresión de insulina es defectuosa (Miki et al. 2001) y un daño incrementado
dramáticamente en neuronas de hipocampo después de una isquemia inducida (Sun, Feng,
Miki, Seino & French, 2006).
29
El efecto de la diabetes sobre la región CA3 del hipocampo, la importancia de esta
estructura en la memoria y el aprendizaje, así como la participación de los canales KATP en
la LTP, apoyan la relevancia de estos últimos, ya que podrían modificarse en la diabetes y
constituir un factor importante en el daño cognoscitivo. Por eso, estamos interesados en el
estudio de sus propiedades biofísicas en este trastorno metabólico, pues hasta ahora las
alteraciones de los canales KATP en la diabetes solamente se han estudiado en corazón
(Smith & Wahler, 1996; Shimoni, Light, & French, 1998) y no en neuronas del SNC.
Hipótesis
Las propiedades biofísicas de los canales KATP se modifican como consecuencia de la
diabetes experimental en neuronas piramidales CA3 del hipocampo de rata.
Tabla 2. Propiedades de canales KATP en cerebro.
Región
cerebral
Conductancia
de (pS)
rata
Cuerpo
44
Sensibilidad al Sensibilidad a Referencias
ATP
#
IC50 sulfonilureas
(mM)
#
2
Glib: 3
estriado
IC50 (µM)
Tolb: 50-100
30
Lee et al. 1998
Neocorteza*
Hipocampo
47
0.130#
Glib: 10-20
Jiang
200
0.350#
Glib: 10
Haddad, 1997
--
--
Glib. 20
Zawar
Tolb. 50
1999
y
et
al.
41, 133
--
--
Velasco et al.
230
--
Glib. 2.59
2006
27
--
Glib: 10
Pelletier et al.
Tolb: 20-100
2000
Tolb: 1000
Erdemli
--
1
y
Krnjevic, 1993
Hipotálamo
146
2-3#
Glib:100
Ashford et al.
1990a
Sustancia nigra
220
0.135#
Glib: 10
Jiang
et
al.
1994
Glándula
26
2#
Glib:0.1(nM)▲# Bernardi et al.
pituitaria
74
30# (µM)
Tolb: 12.5▲#
1993
--
Wu et al. 2000
*Trabajo realizado también en cerebro humano.
Glib., glibenclamida. Tolb., tolbutamida.
▲
Medidos como inhibición del enlazamiento a sitios de unión de alta afinidad de
[3H]glibenclamida.
Objetivo general
Evaluar si en ratas diabéticas inducidas con STZ, existen cambios en las propiedades
biofísicas de los canales KATP presentes en la membrana de neuronas CA3 del hipocampo.
Objetivos específicos
31
1. Implementar en el laboratorio la técnica de registro electrofisiológico en rebanadas
de hipocampo.
2. Estudiar las siguientes propiedades de los canales KATP en neuronas CA3 del
hipocampo de rata:
2.1.Conductancia unitaria.
2.2. Permeabilidad al potasio.
2.3. Dependencia del voltaje.
2.4. Sensibilidad a la glucosa y el ATP.
3. Comparar las propiedades a que se refiere el objetivo 2 con las de los canales KATP
de neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas inducida con STZ.
32
Materiales y Métodos
Animales utilizados:
Para el desarrollo del presente trabajo se usaron ratas macho de la cepa Wistar de
21 días de edad. Los animales se agruparon en controles e diabéticas inducidas
experimentalmente.
Inducción de la diabetes.
Para inducir la diabetes experimental las ratas permanecieron en ayuno un periodo
de 12 a 14 h, después del cual se les midió la concentración de glucosa en sangre y se les
inyectó STZ vía I.P. a dosis única de 100 mg/kg de peso. La STZ se disolvió en solución
amortiguadora de fosfatos salinos agitando en vortex durante 20 segundos y se ajustó el pH
a 4.5 con ácido ascórbico 0.05M. Una vez inyectadas, las ratas se dejaron con alimento y
agua a libre demanda. Se les midió la glucemia entre 5 y 7 días después de la inyección,
colocando una gota de sangre obtenida de la cola del animal en un glucómetro digital
(Accutrend, Roche Diagnostics, Inc.). Las concentraciones de glucosa en sangre fueron de
118±5 mg/dl (6.5±0.3 mM) en ratas control (n=20) y 425±80 mg/dl (23.5±4.4 mM) en
ratas diabéticas (n=30). El criterio de inclusión para ratas diabéticas fue una concentración
sanguínea de glucosa ≥ 250 mg/dl (13.7 mM).
Obtención de rebanadas
Una vez medida la concentración de glucosa, se sacrificaron las ratas. Se extrajo el
cerebro y se colocó en solución Ringer (ver soluciones) a 4°C, burbujeada previamente con
oxígeno. En esta condición se eliminaron el cerebelo y los polos frontales y se realizó un
corte sagital. La duración de estas maniobras fue siempre menor a dos minutos. De los dos
bloques hemisféricos, utilizando un vibratomo (Lancer series 1000, Technical Products
International, USA), se obtuvieron cortes coronales de la zona del hipocampo, con
espesores de 250 a 300 µm. Posteriormente las rebanadas se incubaron durante una hora a
25 °C en solución Ringer oxigenada, usando un baño maría con agitación continua (Julabo
33
SW 20, Julabo Labortechnik, Germany). Finalmente, las rebanadas se transfirieron a una
cámara con perfusión para realizar los registros electrofisiológicos.
Registros electrofisiológicos
Considerando sus características morfológicas y su tamaño, se realizó la
identificación de las neuronas piramidales de la zona CA3 del hipocampo de manera visual
con un microscopio de luz Olympus (modelo BX50WI, Olympus Optical Co., Japan). Se
utilizó un aumento total de 400X. Se seleccionaron células con un soma piramidal o
semiesférico, de núcleo grande y visible. Las rebanadas fueron perfundidas todo el tiempo
con solución Ringer. Todos los registros fueron hechos en la misma zona anatómica a
temperatura ambiente (20-22°C). Para registrar los potenciales de acción y la actividad
unitaria de los canales de potasio sensibles a ATP en las rebanadas de hipocampo, se
utilizó la técnica electrofisiológica “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Las configuraciones
usadas fueron célula adherida ó “cell-attached”, célula completa ó “whole-cell” y el
interior de la membrana expuesto ó “inside-out”. Los potenciales de acción fueron
registrados bajo condiciones de fijación de corriente en la configuración “whole-cell”.
Las pipetas utilizadas fueron preparadas con capilares de vidrio borosilicato (1.5 y 0.86
mm, diámetros externo e interno respectivamente; Sutter Instruments Co., Novato, CA,
USA). Las puntas fueron pulidas en una microforja (Narishige, Scientific Instrument Lab,
Tokio, Japan). Al llenar las pipetas con solución de alto-K (ver soluciones) tenían una
resistencia de 2-5 MΏ para la configuración de “whole cell” y de 8-10 MΩ para “cell
attached” e “inside-out”. La señal se registró utilizando la pipeta de “patch” conectada a un
amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). A su vez, el
amplificador estaba conectado a un osciloscopio a través del cual la señal fue monitoreada
durante todo el experimento. Las corrientes unitarias fueron filtradas, Bessel pasabajos de
2 kHz, amplificadas y muestreadas a 10 kHz, usando un convertidor analógico-digital
DigiData 1200 (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). En la Figura 5 se muestra
un esquema del dispositivo experimental utilizado. La adquisición y el análisis de las
corrientes unitarias se realizó por medio de una computadora Pentium utilizando el
programa pClamp 8 (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). Los valores de la
probabilidad de apertura (Po) en el estado estable fueron obtenidos usando el método
34
descrito por Quayle et al. (1988). Para calcular la Po se midió el tiempo (tj)
correspondiente a los diferentes niveles de corriente j=1, 2, 3, …..N, para después obtener
N
el valor de la probabilidad mediante la fórmula PO = ∑
t jj
TN
j =1
, donde T es la duración del
registro y N es el número de canales activos en el parche. Se usaron registros con duración
de 30 y 390 segundos. Para obtener las curvas corriente-voltaje, se fijó el potencial de
membrana a diferentes valores y se midió la corriente unitaria ajustando una función
gaussiana a los histogramas de amplitud de la corriente, usando el método de mínimos
cuadrados. Se estudió la cinética de la apertura y cierre de los canales unitarios en
registros en los que se observó un solo canal activo. Las distribuciones de los tiempos de
apertura y de cierre fueron ajustadas con funciones exponenciales mediante el método de
máxima verosimilitud (Colquhuoun & Sigworth, 1983).
Figura 5. Esquema que muestra el dispositivo experimental utilizado para la
obtención de los registros electrofisiológicos. Las rebanadas de hipocampo fueron
colocadas en la cámara de registro, la cual estaba conectada a tierra a través de un
electrodo de Ag/AgCl2. Para el registro de los potenciales y corrientes unitarias se utilizó
una micropipeta, conectada a un amplificador de “patch”, la señal amplificada se envió a
un osciloscopio para ser monitoreada durante todo el experimento. A su vez la señal se
enviaba a un convertidor analógico digital (A/D) y de éste a una computadora para su
almacenamiento y análisis posterior. El microscopio estaba conectado a una cámara
infrarroja de TV, la cual enviaba la imagen a un monitor de TV.
35
Soluciones
La composición de las soluciones utilizadas en la obtención de las rebanadas de hipocampo
y en las distintas configuraciones de “patch clamp” se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Composición de las soluciones experimentales (mM)
Ringer
alto-K+EGTA
alto-K
(interna)
(externa)
NaCl
130
-
-
KCl
3
140
140
CaCl2
1
-
-
MgCl2
1
1
1
Hepes
10
10
10
EGTA
-
2
D-Glucosa
20
La solución Ringer se ajustó a un pH de 7.4 con NaOH. La solución alto-K+EGTA y alto-K se ajustaron con
KOH a un pH de 7.2 y 7.4, respectivamente.
Las soluciones experimentales fueron preparadas siempre inmediatamente antes de ser
utilizadas. Todas las soluciones fueron filtradas a través de un filtro millipore de 0.22 µm.
Todos los experimentos fueron hechos con perfusión continua de las rebanadas con
solución Ringer. Para estudiar la sensibilidad del canal a la glucosa, ésta fue eliminada de
la solución de baño. Las soluciones se perfundieron con un sistema de perfusión provisto
de una válvula electrónica de tres vías, a través del cual el volumen de la cámara de
registro se mantenía constante. La velocidad de recambio fue de 0.75-1 ml/min.
Para el registro de las corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, después de
hacer el sello en “cell-attached”, la solución Ringer con glucosa era cambiada por la
solución alto-K+EGTA para obtener concentraciones de potasio simétricas ([Ki] = [Ke] =
140 mM), (véase tabla 3). Posteriormente se retiró la pipeta de la célula dejando ahora la
36
parte interna de la membrana expuesta a la solución de alto-K+EGTA. El ATP y la
glibenclamida se disolvieron en solución de alto-K+EGTA.
Para los experimentos dosis-respuesta se utilizó un sistema de superfusion DAD-12 (ALA
Scientific Instruments, Inc., USA) el cual consta de 12 válvulas que desembocan en una
micropipeta de cuarzo, la cual tiene un diámetro interno de 100 µm. Este sistema se
controla con una microcomputadora laptop, permitiendo programar una secuencia que
controla la presión y la duración de la perfusión con cada solución. La pipeta de cuarzo se
colocó en un área muy cercana al parche, permitiendo bañar el parche de manera directa,
de tal manera que el efecto de cualquier solución se lleva a cabo en fracciones de segundo,
sin requerir el recambio total de la cámara. El parche era bañado por la parte interna de la
membrana de manera directa con las soluciones experimentales, mientras que las
rebanadas eran bañadas todo el tiempo con la solución Ringer.
Para experimentos de la curva dosis-respuesta se preparó una solución madre de ATP en
solución alto-K+EGTA a una concentración de 10 mM, el pH se ajustó a 7.2 con KOH. De
esta solución se hicieron diluciones a concentraciones finales de 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1
y 3 mM de ATP, en volúmenes de 5 ml. Para los experimentos con glibenclamida se
preparó una solución madre de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO), de la cual se hizo una
dilución en solución alto-K+EGTA para tener un volumen de 5 ml a una concentración de
100 µM (pH= 7.2).
Todas las sustancias y fármacos fueron obtenidos de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO,
USA.
Rebanadas delgadas para observación de la morfología celular
Con el propósito de observar a mayor detalle las características morfológicas y la
preservación de la zona de interés (CA3 de hipocampo), así como comparar forma y
tamaño de las células piramidales con las de las células gliales en la misma zona, se
realizaron cortes de 150 µm en el vibratomo y de 40 a 50 µm en un criotomo (Leica CM
1800, Leica Microsystems, Inc. Depew, NY USA). Estos cortes se tiñeron con azul de
metileno al 1 % en agua durante 2 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se
lavaron con agua desionizada, se observaron al microscopio de luz y se fotografiaron
(véase Figura 6).
37
Resultados
En este trabajo se presentan los resultados del estudio de las propiedades biofísicas de los
canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP) en neuronas de la zona CA3 del
hipocampo de ratas con diabetes inducida, comparadas con las propiedades de neuronas de
ratas sanas (control).
Para ello se realizaron series de experimentos para:
1. Identificar las neuronas CA3 de hipocampo por medio de su morfología y del patrón de
descarga de potenciales de acción en neuronas de ratas sanas.
2. Estudiar los siguientes aspectos de la actividad de los canales KATP en neuronas CA3
del hipocampo de ratas diabéticas y sanas:
2.1. Efecto de la glucosa.
2.2. Permeabilidad al potasio y conductancia unitaria.
2.3. Dependencia de voltaje.
2.4. Sensibilidad al ATP.
2.5. Efecto de la glibenclamida.
1. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas control
Ubicación de las neuronas CA3 en rebanadas del hipocampo.
Como un control de la calidad de las rebanadas obtenidas de hipocampo de rata y para
garantizar que el procedimiento de obtención fue el adecuado para tener una buena
preservación neuronal, se obtuvieron rebanadas de hipocampo, las cuales se tiñeron con
azul de metileno, se lavaron con agua desionizada para quitar el exceso de colorante y se
observaron al microscopio de luz. La Figura 6 muestra un corte coronal de cerebro de rata
teñido con azul de metileno, exponiendo el hipocampo y sus distintas zonas. Una
amplificación de la zona CA3 permitió ver con mayor detalle las células presentes (véase
Figura 6). En ella, se observan células de forma piramidal o semiesférica con el soma de
diámetro mayor entre 24 y 28 µm, en algunas se aprecia el núcleo. También se observan
otras células de menor tamaño (8-12 µm) que corresponden a las células gliales.
38
A
500 µm
B
50 µ m
Figura 6. Hipocampo de rata teñido con azul de metileno. A. Corte coronal de
hipocampo de 150 µm de espesor, mostrando las distintas zonas del hipocampo. B. Región
CA3 en la que se observan neuronas piramidales y células gliales. En este caso el espesor
del corte fue de 40 µm para mejor visualización.
39
Potenciales de acción en neuronas CA3 del hipocampo.
La siguiente serie de experimentos se centró en la obtención de registros de
potenciales de acción para observar el patrón de descarga propio de neuronas piramidales
CA3 del hipocampo de ratas. Esto permite asegurar que las células selecciondas
correspondan a neuronas piramidales y no a otro tipo de neuronas ubicadas en el
hipocampo o a células gliales. Para ello, los registros se realizaron con la técnica “wholecell” “patch-clamp” en el modo fijación de corriente usando Ringer como solución
extracelular y la solución alto-K para llenar las pipetas (veáse Tabla 3). Se encontró que el
potencial de membrana en reposo fue de -55 ± 5 mV (n=3). En la Figura 7 se muestran
registros representativos de potenciales de acción espontáneos (véase Figura 7 A) y
provocados al aplicar un pulso de corriente (véase Figura 7 B). En contraste, las células
gliales mostraron potenciales de membrana en reposo más negativos, -70 ± 2 mV (n=5) y
fallaron en generar potenciales de acción.
A
Vm (mV)
50
0
-50
-100
10 ms
Vm (mV)
B
50
0
-50
-100
0.2 nA
100 ms
Figura 7. Potenciales de acción característicos de las neuronas piramidales CA3.
Potenciales de acción espontáneos (A) y ráfaga de potenciales de acción, inducida por un
pulso despolarizante de corriente de 0.2 nA de intensidad (B). Los valores obtenidos
fueron de 126 mV de amplitud y 0.98 ms de duración. Las rebanadas fueron perfundidas
con solución Ringer-Glucosa (veáse Tabla 3).
40
Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+.
En la segunda fase de experimentos, el objetivo fue determinar la presencia de canales de
potasio sensibles a glucosa. Se registraron corrientes unitarias en la configuración “cellattached”. Las pipetas se llenaron con la solución alto-K. Cuando las rebanadas fueron
perfundidas con solución Ringer no se observó actividad de canales unitarios (véase Figura
8, trazo superior). Sin embargo, cuando la glucosa fue removida del fluido extracelular se
observó actividad de canales de potasio (véase Figura 8, trazos inferiores). Como se
aprecia, existe una relación inversa entre el potencial de la pipeta y el tiempo de apertura
del canal.
Figura 8. Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+. Registro de
corrientes unitarias de neurona CA3 del hipocampo en la configuración “cell-attached”. En
el trazo superior la rebanada fue bañada con solución Ringer (glucosa 20 mM). En los
trazos inferiores los registros se obtuvieron después de quitar la glucosa del medio
extracelular, a diferentes potenciales de pipeta (Vp) indicados a la derecha de cada trazo.
Las probabilidades de apertura (Po) y los niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal están
indicados a la izquierda. La pipeta se llenó con la solución alto-K.
41
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje de los
canales de K+ que mostraron sensibilidad a glucosa en la condición “cell-attached”.
Usando la configuración “cell-attached” se observaron corrientes unitarias con
diferente amplitud y probabilidad de apertura al variar el potencial de la pipeta. El análisis
estadístico permitió caracterizar la actividad de los canales unitarios registrados en cada
una de las condiciones experimentales. También se caracterizó la actividad de los canales
de acuerdo a su conductancia. Esta última se determinó midiendo la amplitud media de las
corrientes a potenciales de pipeta entre -100 y 40 mV, con incrementos de 20 mV. Los
valores obtenidos se ajustaron a una línea recta. La relación IK-V fue lineal en el rango
mencionado. Un histograma representativo de la amplitud de la corriente se muestra en la
Figura 9 A. El valor de la conductancia unitaria fue de 170 ± 3 pS (n=7) (véase Figura 9
B). La relación IK-V obtenida se describe por la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz:
I K = PK
F 2 VP [K]o e FVP RT - [K]i
RT
e FVP RT - 1
(1)
Donde PK es la permeabilidad del canal a los iones K+ y VP el potencial de la pipeta; R es
la constante de los gases R=8.314 J/molK, T la temperatura absoluta y F la constante de
Faraday. El valor de la permeabilidad (PK) obtenido por ajuste de los datos experimentales
a la ecuación (1) fue de 3.86x10-13 cm/s.
42
Número de Observaciones
A
200
150
100
50
0
8
10
12
14
16
Amplitud (pA)
B
-100
IP(pA)
-80
-60
-40
5
-20
20
-5
40
VP(mV)
-10
-15
-20
Figura 9. Relación corriente-voltaje de los canales de potasio sensibles a glucosa en la
configuración “cell-attached”. A. Histograma representativo de la amplitud de la
corriente y el ajuste de los datos a la ecuación de Gauss (VP = -40 mV). Construido a partir
de los registros mostrados en la Figura 8. B. Relación corriente-voltaje para el canal. La
línea recta representa el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de GoldmanHodgkin-Katz. La pendiente determina la conductancia del canal (170 pS). Los datos son
presentados como media ± error estándar (n=7).
43
Uno de los parámetros electrofisiológicos que se estudiaron para el canal de potasio
sensible a glucosa en estudio fue su dependencia al voltaje.
Al registrar las corrientes unitarias se observó que la actividad del canal es mayor a
potenciales de pipeta positivos que a potenciales negativos, por lo que se determinó la
relación entre la actividad del canal y el potencial de la pipeta. Para ello se ajustaron los
valores experimentales de Po, obtenidos a diferentes potenciales de pipeta, con la ecuación
de Boltzmann, empleada comúnmente para describir la sensibilidad de los canales iónicos
al voltaje (Jiang et al, 1994):
(
Po = 1 + e
)
(V1/2 − VP ) k −1
(2)
Recordando, Po es el valor de la probabilidad de apertura obtenido experimentalmente a un
potencial de pipeta (Vp). V1/2 es el valor del potencial de la pipeta al cual Po alcanza el 50%
de su valor máximo y k es una medida de la sensibilidad al voltaje (el número de e-veces
que Po se incrementa). Los parámetros obtenidos para este canal fueron: El potencial de
activación medio (V1/2) = -79±1 mV y el valor de k = 11.9±0.7 mV (véase Figura 10).
Obsérvese que Po se incrementa cuando el voltaje en la pipeta aumenta.
Además, se construyeron histogramas de apertura y cierre del canal a diferentes
potenciales de pipeta y se ajustaron a una ecuación exponencial (véase Figura 11 A). A
partir de los ajustes se obtuvieron las constantes de tiempo de apertura y cierre del canal en
función del potencial de la pipeta (véase Figura 11 B). Este resultado muestra que el
aumento en la probabilidad de apertura con la despolarización se debe al aumento del
tiempo de permanencia en el estado abierto y a la disminución de los tiempos en el estado
cerrado.
44
Figura 10. Actividad de los canales de KATP en el estado estable y cinética de su
dependencia al voltaje. Probabilidad de apertura (Po) para un canal de K+ dependiente de
ATP en función del potencial de la pipeta. La línea curva corresponde a los valores
experimentales de Po ajustados a la ecuación de Boltzmann.
45
Figura 11. Cinética de los tiempos de apertura y cierre para el canal de potasio
sensible a glucosa. A. Histogramas típicos de los tiempos de apertura y cierre (Vp = -60
mV). Las líneas curvas corresponden al ajuste de los valores experimentales a una
ecuación exponencial. B. Dependencia de voltaje de las constantes de apertura y cierre.
Los datos se presentan como media ± EE (n = 3). Obsérvese que el eje de las ordenadas
tiene escala logarítmica.
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje en
condiciones de K+ isométrico.
Con el propósito de obtener los parámetros biofísicos de los canales de K+ en
condiciones de K+ isométrico ([Ki] = [Ke] = 140 mM), se hizo una serie de experimentos
para registrar corrientes unitarias con la técnica de “patch-clamp” en la configuración
46
“inside-out”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con la solución
alto-K+EGTA. En estas condiciones en algunos sellos se presentó un fenómeno conocido
como run-down ó disminución y/o desaparición temporal de la actividad de los canales de
K+. En la Figura 12 se muestra un registro característico de las corrientes unitarias en un
parche que presentó run-down; la actividad del canal pudo ser restablecida después de
aprox. 1 min al añadir ATP a una concentración baja (50 µM) en la cara intracelular del
parche de membrana, ya que el efecto del ATP depende del estado operativo del canal.
Este fenómeno se debe posiblemente a los cambios en el microambiente al momento del
desprendimiento del parche; se optó por analizar solamente los parches que no presentaron
este fenómeno. En la Figura 13 se muestran registros típicos de corrientes unitarias a
diferentes potenciales de membrana en la configuración “inside-out” en condiciones de
potasio simétrico.
Figura 12. Actividad unitaria de los canales KATP y efecto “run down”. Registro de
corrientes unitarias de canales KATP en la configuración “cell-attached” Antes del
desprendimiento la rebanada se perfundió con solución Ringer con glucosa. Nótese la
pérdida de la actividad de los canales. Al desprendimiento del parche para el registro en
configuración “inside-out”, se cambió a solución de alto-K+EGTA con condiciones
isométricas, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna, Tabla 3). Al agregar el ATP a
concentración de 0.05 mM (flecha) se observa la reaparición de la actividad del canal. Los
registros fueron adquiridos con la pipeta llena con solución externa (Tabla 3) en las dos
configuraciones, a un potencial de 40mV.
A partir de tres registros similares a los de la Figura 13 se obtuvo la relación corrientevoltaje. Del ajuste de una recta a los valores de corriente para diferentes potenciales de
membrana se obtuvo el valor para la conductancia, correspondiendo a 178.5±8.0 pS para
47
potenciales de membrana negativos (véase Figura 14). Se puede observar que la corriente
mostró una rectificación entrante pequeña. Al hacer el ajuste de la ecuación de GoldmanHodgkin-Katz (veáse Ecuación 1) a los datos experimentales de la relación corrientevoltaje, se obtuvo una permeabilidad al K+ de 3.84±0.33x10-13 cm/s. Los valores de
conductancia y permeabilidad fueron similares a los valores encontrados en la
configuración “cell-attached”.
Figura 13. Actividad unitaria de canales KATP de neuronas hipocampales CA3. Se
muestran registros de corrientes unitarias obtenidos en la configuración “inside-out” a
diferentes potenciales de membrana, indicados en mV a la derecha de los trazos. Los
niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal se indican a la izquierda de cada registro. La
rebanada se perfundió con solución de alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el
potasio, [K+]e = [ K+]i = 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó con solución de
alto-K (solución externa).
48
Figura 14. Relación corriente-voltaje de los canales KATP obtenidos de neuronas
hipocampales CA3. La gráfica se construyó a partir de registros similares a los mostrados
en la Figura 13. La línea continua representa el ajuste de los valores experimentales a la
ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Los datos fueron obtenidos de tres parches de
membrana distintos. Note la ligera rectificación para los potenciales positivos. La rebanada
se perfundió con solución isométrica de alto-K+EGTA, [K+]e= [ K+]i= 140 mM (solución
interna). Las pipetas se llenaron con solución de alto-K (externa).
Para describir la dependencia de la actividad del canal al voltaje, se ajustó la ecuación de
Boltzmann (veáse Ecuación 2) a los valores experimentales de Po a diferentes potenciales
de membrana obtenidos de tres parches. La relación Po-Vm y la curva ajustada se muestran
en la Figura 15. En este caso el potencial de activación medio (V1/2) fue de 2.1 ± 0.6 mV y
el valor de k fue de 11.1 ± 0.3 mV.
49
Figura 15. Cinética de la dependencia de voltaje de los canales de KATP de neuronas
CA3 de hipocampo. Se calculó la probabilidad de apertura (Po) para los canales KATP en
función del potencial de membrana. Se utilizaron registros obtenidos en la configuración
“inside-out”. La curva corresponde al ajuste de los valores experimentales de Po a la
ecuación de Boltzmann. La probabilidad de apertura aumenta a potenciales positivos de
membrana. Los datos se obtuvieron de tres parches de membrana distintos. La rebanada se
perfundió con solución de alto-K+EGTA, con condiciones isométricas, [K+]e = [ K+]i = 140
mM (solución interna). La pipeta se llenó con alto-K (solución externa).
50
Sensibilidad de los canales de K+ sensibles a glucosa al ATP.
Con la intención de tener evidencia de la sensibilidad al ATP de los canales de K+, se
realizó otra serie de experimentos en rebanadas de hipocampo de ratas, diseñados para
registrar corrientes unitarias con la técnica de “patch-clamp” en la configuración “insideout”, perfundiendo la cara intracelular del parche de membrana con ATP disuelto a
diferentes concentraciones (0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 y 1 mM) en la solución altoK+EGTA. Se muestran registros típicos en la Figura 16 A. En todos los parches
examinados, se encontró que en neuronas control la probabilidad de estado abierto bajó
notablemente a la concentración de 300 µM de ATP y la actividad de los canales fue
totalmente abolida a 1 mM del mismo nucleótido. Se obtuvo la relación dosis-respuesta
para el bloqueo de la actividad del canal con ATP. La Po obtenida para cada una de las
concentraciones de ATP se ajustó a la ecuación de Hill:
Po
P o max
1
=
⎞⎟
1 + ⎛⎜ [ ATP ]
KD⎠
⎝
h
(3)
Donde Pomax es la probabilidad de apertura máxima; [ATP] es la concentración interna de
ATP, KD es la constante de disociación, que representa la concentración a la cual la Po
disminuye al 50% de la Pomax y h es el coeficiente de Hill, este valor indica el número de
moléculas de ATP que se unen al canal para producir el bloqueo de la actividad.
En la Figura 16 B se muestra la curva dosis-respuesta obtenida para el canal de K+ a un
potencial de membrana de 40 mV y la curva ajustada con la ecuación de Hill.
La concentración de ATP que induce el 50% de la inhibición de la actividad del canal (KD)
fue de 0.25 ± 0.01 mM. El coeficiente de Hill (h) fue de 2.4 ± 0.2. Lo anterior sugiere que
la inhibición del canal resulta del enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al
canal KATP.
51
Figura 16. Sensibilidad de los canales membranales KATP de neuronas CA3 del
hipocampo al ATP. A. Registros representativos de corrientes unitarias de canales KATP a
diferentes concentraciones de ATP, indicadas en mM a la izquierda de los registros. El
registro se obtuvo en la configuración “inside-out” a un potencial de membrana de 40 mV.
Nótese el bloqueo total de la actividad a la concentración 1 mM del nucleótido. B.
Relación entre la probabilidad de apertura y la concentración de ATP. La línea continua
representa el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de Hill. Los datos son
presentados como media ± EE (n = 3). Los parches de membrana fueron perfundidos con
la solución de alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el potasio [K+]e = [ K+]i = 140
mM (solución interna) adicionada de ATP a las concentraciones indicadas. La pipeta se
llenó con solución de alto-K (externa).
52
Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de K+ sensibles al ATP.
Se realizó otra serie de experimentos registrando corrientes unitarias en parches de
membrana en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara interna de la membrana
con la solución alto-K+EGTA en la que se disolvió glibenclamida a concentración de 100
µM. La Figura 17, muestra el bloqueo de la actividad del canal producido por la aplicación
de glibenclamida en la cara interna de la membrana. Este resultado proporciona otra
evidencia de que los canales estudiados comparten propiedades con los canales KATP.
0 Gl ib
100 µM Gli b
20 pA
Lavado
200 ms
Figura 17. Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales KATP de
membrana en neuronas CA3 de hipocampo. Se muestran los registros de corrientes
unitarias de canales KATP obtenidos empleando la configuración “inside-out”. La actividad
del canal en condiciones control (trazo superior) fue bloqueada después de agregar 100 µM
de glibenclamida (trazo medio). Después del lavado de la sulfonilurea la actividad del
canal fue recuperada (trazo inferior). El potencial de membrana fue de 40 mV. Los parches
se perfundieron con soluciones isométricas de alto-K+EGTA, [K+]e = [ K+]i = 140 mM
(solución interna) y solución de alto-K+EGTA más glibenclamida. La pipeta se llenó con
alto-K (solución externa).
53
2. Neuronas CA3 del hipocampo de ratas diabéticas
Efecto de la glucosa sobre la actividad de los canales de K+.
La siguiente parte de este trabajo consistió en indagar los diferentes parámetros
biofísicos de los canales KATP, pero ahora en neuronas de ratas con diabetes inducida
experimentalmente.
Para conocer si la actividad de los canales de potasio también es sensible a la glucosa en
condición diabética, se registraron corrientes unitarias de parches de membrana en la
configuración “cell-attached”, las neuronas en las rebanadas fueron perfundidas con
solución Ringer con y sin glucosa. La Figura 18 muestra registros de corrientes unitarias en
parches de membranas de neuronas control (véanse Figuras 18 A y 18 C) y diabéticas
(véanse Figuras 18 B y 18 D). En la Figura 18 A en la configuración “cell-attached” se
puede observar que la glucosa extracelular (20 mM) suprime la actividad del canal;
mientras que en la neurona diabética no se observó bloqueo del canal (véase Figura 18 B).
Se aumentó la concentración de glucosa extracelular hasta 50 mM; aún así no se observó
inhibición de la actividad de los canales de potasio.
En estos experimentos, después de separar de la célula el parche de membrana hasta
obtener la configuración “inside-out”, los canales de K+ se bloquearon al agregar ATP (1
mM) en la cara interna de la membrana en neuronas control (véase Figura 18 C) y se
inhibieron en las diabéticas (véase Figura 18 D).
54
DIABETES
CONTROL
A
B
0 mM GLUCOSA
O
O
C
C
20 mM GLUCOSA
20 mM GLUCOSA
O
O
C
C
C
0 mM GLUCOSA
0 mM ATP
D
O
O
C
C
1 mM ATP
0 mM ATP
1 mM ATP
O
C
C
10 pA
O
200 ms
Figura 18. Efecto de la glucosa sobre la actividad de canales unitarios de neuronas
hipocampales CA3 de ratas diabéticas. En neuronas de ratas control (A) y diabéticas (B)
se registró la actividad unitaria de canales KATP en la configuración “cell-attached”; en
ausencia (arriba) y en presencia de 20 mM de glucosa (abajo). La actividad unitaria del
canal en la condición diabética no se inhibe aún en presencia de glucosa. Registros de la
actividad unitaria de canales KATP en el mismo parche, pero ahora en la configuración
“inside-out” obtenidos de ratas control (C) y diabética (D), en ausencia (arriba) y en
presencia (abajo) de 1 mM de ATP. Obsérvese el bloqueo total de la actividad en presencia
del nucleótido en el control y una inhibición en la diabética. Los parches fueron
perfundidos con soluciones isométricas de alto-K+EGTA, [K+]e = [ K+]i = 140 mM
(solución interna), a la cual le fue adicionado el ATP. La pipeta se llenó con alto-K
(solución externa) en ambas configuraciones.
55
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje en
condiciones de K+ simétrico.
Con el propósito de obtener los parámetros biofísicos de los canales KATP en
neuronas diabéticas, en condiciones de K+ simétrico ([Ki] = [Ke] = 140 mM), se registraron
corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara intracelular del
parche de membrana con la solución alto-K+EGTA. En la Figura 19 se muestran registros
típicos de corrientes unitarias a diferentes potenciales de membrana en la configuración
“inside-out” en condiciones de potasio simétrico. Se puede apreciar un aumento en la
amplitud de la corriente saliente y en la apertura del canal para potenciales positivos.
Figura 19. Actividad unitaria de canales KATP de neuronas CA3 de hipocampo de rata
diabética. Registro de corrientes unitarias adquiridos en la configuración “inside-out” a
diferentes potenciales de membrana, indicados a la derecha de los trazos. A la izquierda de
los mismos se indican los niveles cerrado (c) y abierto (o) del canal. La rebanada se
perfundió con solución alto-K+EGTA en condiciones isométricas para el potasio, 140 mM
(solución interna). La pipeta se llenó con solución de alto-K, (externa).
56
La relación corriente-voltaje mostró un valor de conductancia de 177.4±6.2 pS (n = 3). La
Figura 20 exhibe las curvas correspondientes a neuronas control y diabéticas. Se puede
observar que las corrientes salientes, a potenciales de membrana superiores a 40 mV,
fueron mayores en neuronas diabéticas que en neuronas control, manteniéndose una
relación lineal en el primer caso. Al hacer el ajuste de la ecuación de Goldman-HodgkinKatz (ecuación 1) a los datos experimentales de la relación corriente-voltaje, se obtuvo una
permeabilidad al K+ de 3.74±0.23x10-13 cm/s para la condición diabética. Los valores de
conductancia y permeabilidad fueron similares a los encontrados en la condición control.
Figura 20. Relación corriente-voltaje de los canales KATP de neuronas CA3 de rata
diabética. La curva I-V se construyó a partir de los registros de tres parches de membrana
distintos, obtenidos en la configuración “inside-out”. La línea continua representa el ajuste
de los valores experimentales a la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Destaca la
ausencia de rectificación para potenciales positivos en la condición diabética. Las
rebanadas se perfundieron con solución interna, [K+]i = 140 mM. La pipeta se llenó con
solución externa isométrica de alto-K.
57
Para describir la dependencia a voltaje de la actividad del canal, similar a lo realizado con
las preparaciones control, se ajustó la ecuación de Boltzmann (véase Ecuación 2) a los
valores experimentales de Po a diferentes potenciales de membrana. La relación Po-Vm y la
curva ajustada se muestran en la Figura 21. Al comparar esta curva con la condición
control no hubo un cambio significativo. En este caso el potencial de activación medio
(V1/2) fue de 5.3 ± 0.6 mV y k tuvo un valor de 11.02 ± 0.4 mV (n = 3). Tanto V1/2 como k
fueron muy similares a los encontrados en neuronas de ratas control.
Figura 21. Dependencia al voltaje de la actividad de los canales KATP de neuronas
CA3 de hipocampo de la rata diabética. A partir de registros en la configuración “insideout” se obtuvo la Po en función del potencial de la membrana. La línea corresponde al
ajuste de los valores experimentales de Po a la ecuación de Boltzmann. Los datos fueron
obtenidos de tres parches de membrana distintos. La rebanada se perfundió con solución
alto-K+EGTA en condiciones isométricas a 140 mM (solución interna). La pipeta se llenó
con solución de alto-K, (externa).
58
Sensibilidad al ATP.
Para estudiar la sensibilidad al ATP de los canales KATP, en neuronas de ratas
diabéticas se registraron corrientes unitarias en la configuración “inside-out”, perfundiendo
la cara intracelular del parche de membrana con ATP disuelto en la solución alto-K+EGTA
a diferentes concentraciones (0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 y 5 mM). Los registros de
corriente a diferentes concentraciones de ATP se muestran en la Figura 22 A. En todos los
parches examinados, se encontró que la probabilidad del estado abierto disminuyó
notablemente a la concentración de 1 mM de ATP y que la actividad de los canales se
abolió totalmente a 3 mM de ATP. La probabilidad de apertura del canal obtenida para
cada una de las concentraciones de ATP se ajustó la ecuación de Hill (veáse Ecuación 3).
La Figura 22 B muestra la relación dosis-respuesta de la actividad del canal.
Al ajustar los valores experimentales de Po a la ecuación de Hill se encontró que la
concentración de ATP que inducía el 50% de la inhibición de la actividad del canal (KD)
fue de 0.59 ± 0.02 mM. El valor de la constante de disociación (KD) para los canales KATP
de neuronas diabéticas aumentó aproximadamente al doble del valor obtenido para
neuronas control (véase Figura 22 B). Es decir, la sensibilidad al ATP de los canales KATP
resultó menor que en las neuronas control. En cambio el coeficiente de Hill (h = 2.1 ± 0.1,
n = 3) en las neuronas diabéticas no fue significativamente diferente al de los controles. Lo
anterior sugiere que, al igual que en ratas control, la inhibición probablemente resulta del
enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al canal.
59
A
ATP (mM)
0
0.3
10 pA
1
3
100 ms
B
1.0
0.8
Po/Pomax
0.6
0.4
Control
Diabetes
0.2
0.0
0.01
0.1
1
[ATP] mM
Figura 22. Sensibilidad al ATP de los canales KATP de membranas neuronales CA3 de
la rata diabética. Datos obtenidos en configuración “inside-out”. A. Registros
representativos de corrientes unitarias en ausencia (trazo superior) y a diferentes
concentraciones de ATP (indicadas a la izquierda de los tres trazos inferiores). El valor de
potencial de membrana fue de 40 mV. Nótese el bloqueo total de la actividad a 3 mM. B.
Relación entre la probabilidad de apertura y la concentración de ATP en neuronas de ratas
dibéticas (S) y ratas control (O). Nótese la disminución de la sensibilidad en la condición
diabética. Los datos (B) fueron obtenidos de tres parches de membrana distintos. Los
parches de membrana fueron perfundidos con la solución de alto-K+EGTA (solución
interna) en condiciones isométricas, [K+]e = [K+]i = 140 mM. La pipeta se llenó con
solución de alto-K (externa).
60
Efecto de la glibenclamida sobre la actividad de los canales de K+ sensibles al ATP.
Para verificar si los canales de K+ sensibles a glucosa y ATP son sensibles a la
glibenclamida en ratas diabéticas, se registraron corrientes unitarias en parches de
membrana en la configuración “inside-out”, perfundiendo la cara interna de la membrana
con la solución alto-K+EGTA en la que se disolvió glibenclamida a una concentración de
100 µM. La Figura 23, muestra el bloqueo de la actividad de los canales en un parche de
membrana por este fármaco. Es decir que en la condición diabética los canales KATP son
bloqueados por la glibenclamida de manera similar a como ocurrió en las neuronas control.
En la Tabla 4 se muestra un resumen de los valores de los parámetros biofísicos de los
canales KATP en neuronas de hipocampo de ratas control y diabéticas, obtenidos en la
configuración “inside-out” en condiciones isométricas, [K+]e = [K+]i = 140 mM.
0 Glib
100 µM Glib
20 pA
Lavado
2 00 ms
Figura 23. Efecto de la glibenclamida en los canales KATP de membranas de neuronas
CA3 de la rata diabética. En la configuración “inside-out” la actividad del canal (trazo
superior) fue bloqueada después de agregar 100 µM de glibenclamida (trazo medio). El
efecto se revirtió después del lavado de la sulfonilurea (trazo inferior). El potencial de
membrana fue de 40 mV. Los parches fueron perfundidos con solución de alto-K+EGTA
con condiciones isométricas para el potasio a 140 mM (solución interna), adicionada de
glibenclamida cuando fue necesario. La pipeta se llenó con solución de alto-K (externa).
61
Tabla 4. Parámetros biofísicos de los canales KATP en neuronas CA3 de hipocampo.
Dependencia de
Voltaje
Sensibilidad al
ATP
Control
G
pS
178.5±8.0
Rectificación
entrante
Sí
PK
10-13 cm/s
3.84±0.33
V1/2
mV
2.1±0.6
k
mV
11.1±0.3
Sensibilidad
a la Glucosa
Sí
KD (*)
mM
0.25±0.01
2.4±0.2
Diabetes
177.4±6.2
No
3.74±0.23
5.3±0.6
11.02±0.4
No
0.59±0.02
2.1±0.1
h
(*) Los valores de la KD para el efecto inhibitorio del ATP sobre la actividad de los canales
KATP en neuronas control y diabéticas fueron significativamente diferentes (p < 0.5).
62
Discusión
En este trabajo se caracterizaron las propiedades biofísicas de canales KATP en neuronas
CA3 del hipocampo de ratas sanas y los cambios en esas propiedades causados por la
diabetes experimental.
Los potenciales de membrana en reposo, la amplitud y la duración de los potenciales de
acción, así como el patrón de descarga en las neuronas piramidales CA3, se estudió usando
la configuración “whole-cell” de la técnica de “patch-clamp” (véase Figura 7). Los valores
de amplitud y duración, así como la forma de los potenciales de acción fueron similares a
los medidos con la técnica de electrodos intracelulares en neuronas CA1 de rebanadas de
hipocampo de ratas de 3 a 4 semanas de edad (Isagai, Fujimura, Tanaka, Yamamoto &
Higashi, 1999). Cabe mencionar que la duración de los potenciales de acción CA1 de ratas
de una semana de edad, reportados por esos mismos autores, son a su vez similares a los
registrados con la técnica de “patch clamp” en neuronas CA3, de rebanadas hipocampales
de ratas de la misma edad, mantenidas en cultivo órgano-típico por 10 a 14 días (Raffaelli,
Saviane, Mohajerani, Pedarzani & Cherubini, 2004). También son comparables a los de
células piramidales CA1 (Zawar et al. 1999). La caracterización electrofisiológica
mencionada evidenció que las células seleccionadas visualmente durante este trabajo,
corresponden a neuronas piramidales y no a células gliales, ya que estas últimas no
generan potenciales de acción (Zawar et al. 1999).
Propiedades biofísicas de los canales KATP en neuronas piramidales CA3 del
hipocampo.
Las propiedades biofísicas de los canales KATP se estudiaron usando la configuración “cellattached” e “inside-out” de la técnica de “patch” antes mencionada. En particular, se
determinó la conductancia unitaria, permeabilidad a K+, dependencia del voltaje y cinética,
sensibilidad al ATP y glucosa y el bloqueo con glibenclamida.
Esta es la primera vez que se describen estas propiedades en células piramidales CA3 en
rebanadas de tejido.
63
En el sistema nervioso central se han encontrado canales KATP con diferentes
conductancias en distintas regiones del cerebro, como el hipotálamo, la sustancia nigra y la
neocorteza (Spanswick, Smith, Groppi, Logan & Ashford, 1997; Jiang et al. 1994; Jiang &
Haddad, 1997). En hipocampo se han reportado canales KATP con conductancias de 10 y
100 pS (Tromba et al. 1992; 1994), así como de 37, 147 y 241 pS (Velasco et al. 2006),
entre otros. En este trabajo se encontraron canales KATP en neuronas piramidales CA3 con
una conductancia de 178 pS (véase Figura 14). La variación en las conductancias de los
canales KATP puede deberse a la distinta composición de las subunidades (Kir 6.X y
SURX) que conforman los canales en las diversas regiones del cerebro (Zawar et al. 1999),
pues se sabe que existen distintas propiedades intrínsecas en las subunidades tanto de
Kir6.X como de SURX (Yokoshiki, Sanagawa, Seki & Sperelakis, 1998). Así,
cambios
sutiles en la constitución de los residuos de aminoácidos pueden impactar en la función
conductiva del canal. Además, se ha reportado que durante el desarrollo neuronal del
hipocampo de rata se observaron canales KATP con mayor conductancia, infiriendo que esto
podría contribuir a una menor resistencia de las neuronas maduras en las isquemias
cerebrales (Acevedo, 2002).
Los resultados de esta tesis indican que la permeabilidad de este canal a K+, en condiciones
isométricas para este ión, fue de 3.84±0.33x10-13 cm/s. Hasta donde nos es posible conocer
no existen datos previos en este tipo celular. Cuando se compara con la permeabilidad de
otros canales de potasio, por ejemplo los descritos como BK para las neuronas del órgano
X del acocil, de 2.3 x 10-13 cm/s (Lara, Acevedo & Onetti, 1999), el valor encontrado en
las células piramidales es 34 % mayor e indica que es altamente selectivo para iones
potasio.
Se sabe que la compuerta de los canales KATP no depende del potencial de membrana, es
decir es independiente de voltaje, en miocitos cardiacos (Noma & Takano, 1991) y en
células β-pancreáticas (Cook & Hales, 1984; Gopalakrishnan, Janis & Triggle, 1993). Por
otro lado, se han reportado canales KATP que sí son dependientes del voltaje en células de
músculo esquelético (Spruce et al. 1985), en neuronas de sustancia nigra (Jiang et al. 1994)
y células nerviosas hipocampales (Tromba et al. 1994). En el 2006, Velasco et al.
reportaron
canales KATP con conductancias de 37 y 241 pS que también fueron
dependientes de voltaje y uno de 147 pS no dependiente de voltaje en neuronas
hipocampales cultivadas. Los canales reportados por Jiang et al. tienen conductancias de
64
220 pS, mientras que los caracterizados por Tromba presentan 100 pS de conductancia.
Los resultados presentados en este trabajo muestran que la actividad de los canales KATP de
178 pS de conductancia, son dependientes de voltaje de tal manera que la probabilidad de
apertura aumenta con la despolarización del potencial de membrana aumentando el tiempo
de permanencia en el estado abierto y disminuyendo los tiempos de cierre, tanto en la
célula completa en la configuración de “cell-attached” (véase Figura 10) como en “insideout” (véase Figura 15). Lo anterior sugiere que pese a estar considerados como canales no
dependientes de voltaje (Ashcroft, 2000) los canales KATP poseen aminoácidos cargados en
la región transmembranal que podrían alterar conformacionalmente a la proteína del canal
a mayor despolarización.
Al estudiar la sensibilidad al ATP, utilizando la configuración “inside-out” y condiciones
isométricas de potasio, se observó que el ATP bloqueó completamente la actividad de estos
canales a una concentración de 1mM (véase Figura 16 A). Para medir la sensibilidad al
ATP, se estudió la relación dosis-respuesta (véase Figura 16 B), en la que se encontró un
una KD = 0.25 mM. Este valor ubica a los canales KATP dentro de los de tipo II de acuerdo
a la clasificación propuesta por Ashcroft y Ashcroft (1990). Estos canales KATP tipo II son
inhibidos por ATP a concentraciones del orden milimolar, a diferencia de los tipo I que son
inhibidos por ATP a concentraciones del orden micro y nanomolar (Gopalakrishnan et al.
1993). Sin embargo, dentro de los tipo II existen diferencias en los valores de la KD para
diferentes regiones del cerebro, las que van desde 0.1 hasta 10 mM de ATP
(Schwanstecher & Bassen, 1997; Routh, McArdle, & Levin, 1997). Esto indica que existe
variabilidad en la sensibilidad al ATP de los canales KATP, probablemente debida a la
conformación del canal con diferentes subunidades y a las propiedades intrínsecas de cada
una de ellas, ya que los canales KATP son sensores metabólicos y esta gama de canales es
básica para la repuesta a modificaciones en el aporte de energía, incluyendo situaciones de
estrés metabólico como la hiperglucemia (Gopalakrishnan et al. 1993; Tromba et al. 1994;
Zawar et al. 1999).
Esta bien establecido que las sulfonilureas son bloqueadores específicos de los canales
KATP en células de cerebro de rata de cuerpo estriado, neocorteza, hipocampo, hipotálamo,
sustancia nigra y glándula pituitaria (Lee et al. 1998; Jiang & Haddad, 1997; Zawar et al.
1999; Velasco et al. 2006; Pelletier et al. 2000; Ashford et al. 1990a; Jiang et al. 1994;
Bernardi et al. 1993). La glibenclamida y la tolbutamida son los bloqueadores de elección
65
para caracterizar a los canales de K como sensibles al ATP, debido a su selectividad y a su
enlace con la subunidad SUR del canal (Aguilar-Bryan & Bryan, 1999). En este trabajo la
glibenclamida (100 µM) suprimió la actividad de los canales de K en neuronas CA3 de
hipocampo de ratas (véase Figura 17), confirmando que efectivamente pertenecen a la
familia de los canales KATP. Resultados similares se han reportado en neuronas cultivadas
de hipocampo de rata (Velasco et al. 2006).
Permeabilidad al potasio, conductancia unitaria y dependencia de voltaje de los
canales KATP en células piramidales CA3 del hipocampo de ratas diabéticas.
Con el propósito de estudiar los posibles cambios producidos por la diabetes, se estudiaron
las propiedades biofísicas de los canales KATP en células piramidales CA3 de ratas
diabéticas: Conductancia unitaria, permeabilidad a K+ y dependencia del voltaje.
En este trabajo no se encontró diferencia entre la conductancia del canal KATP, en la
condición diabética y el valor encontrado en neuronas control. Esto sugiere que, en las
condiciones experimentales utilizadas, la diabetes no afecta estructuralmente al canal KATP,
al menos no de tal manera que modifique su conductancia. En la literatura existen varios
reportes donde se da cuenta que modificaciones importantes del metabolismo celular
tampoco se asocian a alteraciones en la conductancia de los canales KATP en células β
pancreáticas, musculares ó neuronales (Branstrom, Corkey, Berggren & Larsson, 1997;
Tricarico & Camerino, 1994; Murphy & Greenfield,1992), incluyendo a la diabetes entre
las causales de las mencionadas modificaciones metabólicas (Smith & Wahler, 1996;
Shimoni et al. 1998).
La conductancia es una propiedad intrínseca del canal que depende de dos factores: la
permeabilidad y la concentración de iones en las regiones vecinas al canal (Nicholls et al.
1992). Respecto a la permeabilidad, nuestros datos indican que la permeabilidad de los
canales a K+ fue muy similar en las neuronas de rata diabética comparada con el valor
obtenido en las neuronas de rata no diabética. En este caso se sugiere que los factores
involucrados en el paso de los iones a través del canal, como son el filtro de selectividad y
los aminoácidos cargados que conforman la zona del poro, no sufren modificación en las
66
neuronas de rata diabética. De tal manera que al no verse afectada la permeabilidad,
tampoco se vería efecto de la diabetes en la conductancia del canal, como se discutió
anteriormente.
Una característica que posiblemente cambia en la condición diabética respecto al control es
la ausencia de rectificación que presentan los canales KATP de neuronas de rata control. La
figura 20 muestra la comparación de la curvas I-V de neuronas obtenidas de ratas con una
de las dos condiciones de estudio. La rectificación entrante observada en la gráfica
correspondiente a las neuronas de rata sana, no se presenta en las de rata diabética.
Resultados similares han sido reportados en miocitos cardiacos de ratas diabéticas (Smith
& Wahler, 1996), con la salvedad de que la subunidad SUR del canal es distinta y en otro
trabajo realizado también en el tejido cardiaco no se reporta la pérdida de la rectificación
(Shimoni et al. 1998). Este último autor atribuye esta discrepancia con el anterior a
diferencias metodológicas entre los estudios, particularmente a la ausencia o presencia de
magnesio, respectivamente. Se sabe que el magnesio es un factor clave en la regulación de
la rectificación. Sin embargo, es necesario enfatizar que en los resultados que aquí se
reportan, la ausencia de rectificación en la condición diabética ocurrió en presencia de
magnesio. Con estas evidencias se puede descartar que el efecto pudiese deberse a una
disminución en la concentración de magnesio más abajo de las condiciones fisiológicas
(≈0.7 mM) como se ha propuesto en células ventriculares (Babenko, Gonzalez, AguilarBryan & Bryan, 1998). Sin embargo, no se pueden descartar efectos de largo plazo,
asociados en alguna forma al nivel de magnesio, ya que se ha descrito que las personas
diabéticas presentan hipomagnesemia (Sales & Pedrosa, 2006) y que algunas de las
manifestaciones de la diabetes pueden ser mejoradas con el uso de este elemento de
manera suplemental (Song, He, Levitan, Manson & Liu, 2006). Esta posibilidad también es
apoyada por las evidencias de que la acción estimulatoria del SUR1 sobre el poro del Kir y
consecuentemente sobre la probabilidad de apertura depende del nivel basal de magnesionucleótido (Babenko et al. 1998).
La posible carencia de rectificación entrante observada en las células nerviosas diabéticas
también podría deberse a alteración del metabolismo, específicamente en la ruta de síntesis
de las poliaminas, que junto con el magnesio, son los dos factores intracelulares conocidos
causantes de la rectificación entrante en esta familia de canales de K+ (Ashcroft, 2000). Las
poliaminas (putrescina, espermina y espermidina) interactúan con ácidos nucleicos,
67
proteínas (canales) y otras macromoléculas, modificando su estructura y función en la
célula. Las poliaminas están involucradas en la regulación del crecimiento, diferenciación
celular, estabilización de membranas e importantes funciones neurofisiológicas (Morgan,
1998). La posible participación de las poliaminas en la pérdida de la rectificación entrante
se sustenta por el hallazgo de que influyen la función de compuerta del canal KATP en
miocitos cardíacos (Niu & Meech, 1998), se cree que a potenciales de membrana positivos,
las poliaminas entran al poro del canal donde se enlazan y lentifica el paso del potasio
(Aguilar-Byan & Bryan, 1999) lo cual podría también ocurrir en células nerviosas.
Por otra parte, se ha reportado disminución en el contenido de poliaminas y en la actividad
de la enzima ornitina descarboxilasa (ODC) en embriones de 11 días de gestación en ratas
diabéticas (Bengtsson, Wiberg & Eriksson, 1994). La ODC es una enzima clave en la
síntesis de poliaminas en la célula, exhibe una rápida respuesta a hormonas, factores de
crecimiento y otros estímulos en células de mamíferos, además tiene una tasa alta de
recambio (Morgan, 1998). La reducción de la ODC en la diabetes disminuiría el nivel
intracelular de poliaminas y consecuentemente la rectificación del canal, como ha sido
demostrado para otros canales de K+ con rectificación entrante Kir 2.3 (Shyng, Sha,
Ferrigni, Lopatin & Nichols, 1996). Mas investigaciones futuras son necesarias para
confirmar e interpretar este efecto.
El pH intracelular también ha sido involucrado en el control del mecanismo de
rectificación mediado por poliaminas (Baukrowitz et al. 1999). Aunque una acidificación
del citoplasma, resultado del estrés metabólico que excede el potencial compensatorio de la
célula, también explicaría la ausencia de rectificación en neuronas de rata diabética,
específicamente debido a una protonación-desprotonación del residuo intracelular de
histidina H216 en la región C terminal de la subunidad Kir del canal KATP (Baukrowitz et
al. 1999), nuestros resultados fueron obtenidos en condiciones similares de pH para los
registros control y diabéticos, por lo que se descarta la participación de este factor.
Estudios posteriores son necesarios para entender este resultado.
Como se mencionó en la sección anterior, los datos en la literatura muestran que los
canales KATP pueden presentar o no dependencia al voltaje. Las diferencias entre la no
dependencia (Noma & Takano, 1991; Cook & Hales, 1984; Gopalakrishnan et al. 1993) y
la dependencia de voltaje (Spruce et al. 1985; Jiang et al, 1994; Tromba, Salvaggio,
68
Racagni & Volterra, 1994; Velasco et al. 2006), podrían deberse a diferencias específicas
entre los distintos tipos de subunidades que conforman los canales KATP presentes en las
distintas zonas del cerebro. El canal estudiado en este trabajo muestra que en la condición
diabética su actividad mantiene la propiedad de dependencia de voltaje, como en el
control. Asimismo, la probabilidad de apertura se incrementa de manera similar a
potenciales de membrana positivos en ambas condiciones (véase Figura 21). El potencial
de activación medio (V1/2) y los valores de “k” fueron también similares (2.1 y 11.1 control
y 5.3 y 11.02 mV diabética respectivamente). Lo que sugiere que el campo eléctrico puede
tener influencia en las interacciones entre cargas eléctricas de aminoácidos en la zona del
poro, pero no la tuvo en la condición diabética experimental.
Cambio en la sensibilidad al ATP de los canales KATP en neuronas diabéticas.
Se sabe que la hiperglucemia induce una serie de cambios muy complejos en los sistemas
neuronal y vascular en modelos animales y en pacientes con diabetes, ya que la glucólisis y
sus metabolitos afectan muchas de las rutas metabólicas celulares (Bhardwaj et al. 1999).
Al estudiar la sensibilidad de los canales KATP de neuronas CA3 en rebanadas provenientes
de ratas diabéticas al ATP, se encontró que el ATP bloqueó completamente la actividad de
estos canales a concentraciones de 3 mM (véase Figura 22 A). Sin embargo, cuando se
analizó la relación dosis-respuesta se evidenció una disminución en la sensibilidad al
nucleótido (véase Figura 22 B). La KD de 0.59 mM (0.25 mM para el control) indica que
esa disminución en la sensibilidad requiere una concentración dos veces mayor de ATP
para obtener el efecto bloqueador. Resultados similares han sido encontrados en miocitos
cardiacos, en los que se presenta disminución en la sensibilidad de los canales KATP al
ATP, detectada a los cinco días y a las siete semanas después de la inducción de la diabetes
(Shimoni et al. 1998). De acuerdo con estos autores el coeficiente de Hill (h) para neuronas
de ratas control y diabéticas fue de 2.1 y 2.0 respectivamente, aunque reportan una
disminución en este valor a las 7 semanas (1.75). Al comparar con los valores para el
mismo coeficiente calculados en este trabajo, 2.4 y 2.1 respectivamente, podemos
considerarlos similares. Esto sugiere que la inhibición probablemente resulta del
enlazamiento simultáneo de dos moléculas de ATP al canal. Tanto los resultados de
Shimoni como los de esta tesis difieren de los reportados por Smith y Wahler (1996),
69
quienes no encontraron diferencias significativas en la sensibilidad al ATP de los KATP en
miocitos cardiacos de ratas diabéticas comparados con el control.
La disminución en la sensibilidad al ATP de los canales KATP se ha observado también en
diferentes patologías y tejidos (Deutsch & Weiss, 1993; Koumi, Martin & Sato, 1997;
Light, Shimoni, Harbison, Giles & French, 1998). Así, podría haber alguna propiedad
intrínseca del canal que cambiara en la misma dirección, es decir hacia la disminución, en
una variedad de patologías, todas ellas de tipo metabólico.
Se ha señalado que probablemente el estrés metabólico ocasione que algunas enzimas
proteolíticas intracelulares sean liberadas, modifiquen estructuralmente al canal y reduzcan
su sensibilidad al ATP (Deutsch & Weiss, 1994; Lee, Ozanne, Rowe, Hales & Ashford,
1994; Sodder, Bowie, & Cameron, 1996). Los alcances de nuestro trabajo no permiten
apoyar o rechazar esas posibilidades en las neuronas hipocampales diabéticas.
Existe una vía que se favorece en condiciones de estrés metabólico, la cual fosforila a una
proteína de choque térmico (heat shock protein 27, HSP27) en cardiomiocitos. La
sobreexpresión de HSP27 en miocitos ventriculares aislados de la rata confiere protección
contra la isquemia simulada (Baines et al. 1999). La HSP27 es a su vez un regulador
importante de la dinámica de actina, promoviendo la polimerización de los
microfilamentos. Ya que se ha comprobado que el citoesqueleto de actina es básico para el
número, distribución y actividad funcional de varios tipos de canales en la superficie
celular, entre ellos precisamente los KATP. (Wang, Eldstrom, Jantzi, Moore & Fedida,
2003).
La inhibición del canal KATP por ATP, resulta de la interacción de este nucleótido de
trifosfato con la subunidad Kir, mientras que la activación, resulta de la interacción del
nucleótido-Mg con la subunidad SUR (Nichols, 2006). Además, desde hace tiempo se ha
involucrado a los fosfolípidos como una nueva clase de moléculas reguladoras de canales
Kir (Baukrowitz et al. 1998). El dominio citoplásmico de cada subunidad Kir (6.2) provee
los sitios de enlace para el ATP y otro para el fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2), los
cuales estabilizan el estado cerrado y abierto del canal, respectivamente (Enkvetchakul &
Nichols, 2003).
70
Una posible explicación para la disminución de la sensibilidad de los canales KATP de
neuronas de ratas diabéticas al ATP, es considerando los sitios afines al ATP en la
subunidad Kir6.2 (Ashcroft, 2000), ya que los sitios de enlace del ATP y del PIP2 se
encuentran intercalados en una área en común, habría una competencia bioquímica de los
dos ligandos (ATP y PIP2) por el sitio “no ocupado” en esta subunidad (Nichols, 2000).
Cuando los niveles neuronales de ATP disminuyen y “aumentaría” la concentración de
PIP2 en la membrana en el estado diabético (Baukrowitz & Fakler, 2000), el enlace de PIP2
al sitio de unión en la subunidad se vería favorecido y el estado activo del canal persistiría.
Ante esto sería necesaria una mayor cantidad de moléculas de ATP, para competir por el
sitio de unión al ATP y para finalmente bloquear el canal.
Otra de las causas a las que se ha atribuido la disminución en la sensibilidad del canal al
ATP son las mutaciones al azar, las que en la diabetes mellitus neonatal (NDM) causan
pérdida de la función específica del canal, ya que impiden que los canales se cierren. En
células pancreáticas esto inhibe la actividad eléctrica, la entrada de calcio y la secreción de
insulina (Hattersley & Ashcroft, 2005). Aunque es posible que mutaciones espontáneas
puedan ocurrir en las subunidades del canal en otros tejidos (nervioso), la probabilidad de
que ocurran espontáneamente es baja.
Que el decremento en la sensibilidad de los canales KATP pueda resultar en un fenotipo
diabético abre la posibilidad de que mutantes insensibles al ATP puedan ocasionar diabetes
en humanos. Se postula que el aumento sostenido de la actividad de los KATP pueda ser un
factor causal importante de la diabetes mellitus (Nichols and Koster 2002).
La evidencia inicial de la presencia de los canales KATP en el cerebro se obtuvo al
demostrar la existencia de sitios de unión para glibenclamida (Mourre, Ben Ari, Bernardi,
Fosset & Lazdunski, 1989; Karschin et al. 1997), ya que la subunidad SUR esta
íntimamente relacionada y requerida para la función de los canales KATP (Aguilar-Bryan &
Bryan, 1999). Se ha reportado que la diabetes (inducida con STZ) altera el enlazamiento de
gliburida[H*] al sitio de alta (SUR1) y baja afinidad (SUR2) en varias zonas del cerebro de
rata (Levin & Dunn-Meynell, 1998), sin embargo, en algunas zonas, como la “CA” del
hipocampo (CA2) no se aprecia variación entre controles y diabéticos. En esta tesis la
glibenclamida (100 µM) suprimió la actividad de los canales KATP en neuronas de ratas
71
diabéticas (véase Figura 23), confirmando con ello que, efectivamente, los estudiados son
canales KATP y que no existe diferencia aparente en el bloqueo de la subunidad SUR del
canal en la condición diabética comparada con el control.
Sensibilidad a la glucosa de los canales KATP en neuronas control y diabéticas.
Los canales de potasio estudiados fueron sensibles a la glucosa, es decir, la glucosa
suprimió la actividad de estos canales (véase Figura 8). El efecto de la glucosa sobre la
actividad de los canales KATP, ha sido descrito previamente. La glucólisis y la fosforilación
oxidativa, aumentan el ATP citosólico, incrementa el cociente ATP/ADP y
consecuentemente bloquean a los canales. Se ha reportado el mismo efecto en las células β
del páncreas (Ashcroft, Harrison y Ashcroft, 1984) y en neuronas del hipocampo (Tromba,
Salvaggio, Racagni y Volterra, 1992; 1994; Velasco et al. 2006). Velasco et al. hallaron
que en neuronas cultivadas de esta estirpe, la glucosa bloquea canales de potasio con tres
diferentes conductancias.
Resultados obtenidos en este trabajo muestran que en la condición diabética, la glucosa no
bloqueó la actividad de los canales de potasio sensibles al ATP, es decir se observó
actividad de los canales en presencia de glucosa, aún a concentraciones de 20 y 50 mM.
Sin embargo, esa actividad sí fue inhibida por ATP.
Una explicación a esta observación está sustentada en el hecho de que como se mencionó
anteriormente en la condición diabética disminuye la sensibilidad de los canales K ATP al
ATP, con respecto a lo observado en el control. Por lo tanto, la ausencia de bloqueo de los
canales K ATP por glucosa podría deberse a esta disminución de la sensibilidad al ATP por
estos canales en las neuronas diabéticas, es decir, que la cantidad de ATP citosólico no sea
suficiente para las funciones neuronales y para bloquear los canales KATP. Aunque tampoco
se descartan cualquiera de las dos posibilidades que se discuten en seguida.
Otra posible explicación para la ausencia de bloqueo de los canales KATP por glucosa es
que las neuronas diabéticas fuesen incapaces de transportar la glucosa al interior de la
célula. Dada la importancia fisiológica de la captación de glucosa, no sorprende que la
expresión de los transportadores de la misma (GLUTs) sean regulados por insulina la cual
72
atravieza la barrera hematoencefálica (Banks, 1997). Se ha reportado que existen
receptores de insulina del tipo IRS-1 y predominantemente el IRS-2 en el hipocampo y
otras zonas cerebrales de rata y ratón (Dou, Chen, Dufour, Alkon & Zhao, 2005; Schubert
et al. 2003), y la deficiencia de ISR-2 daña el crecimiento cerebral (Schubert et al.). La
posible alteración en el transporte de glucosa esta apoyado por evidencias que sostienen
que debido a la disminución de insulina en la condición diabética se reduciría el
desplazamiento (migración) de vesículas con los transportadores de glucosa a la membrana
plasmática ó que se alteraría su expresión ó que se modificaría la estructura de la proteína
canal (Marette et al. 1999; Wang & Gleichmann, 1995; Yokoshiki et al. 1998). Aunque
existen reportes en la literatura que indican que otras hormonas (testosterona,
glucocorticoides, ácido retinoico y hormona tiroidea) también alteran la expresión de los
transportadores GLUT (Medina & Owen, 2002). Varios estudios sugieren que la insulina
realiza en el cerebro las mismas acciones que en los tejidos periféricos, es decir, entre
otras, facilita la entrada de glucosa a las neuronas, manteniendo así su producción
energética. Uemura y West en el 2006, proponen que la insulina regula la captación de
glucosa neuronal, promoviendo la translocación de transportadores GLUT3 a la membrana
plasmática y que la insulina habilita a las neuronas a responder a las demandas de energía
inducida por una actividad neuronal incrementada. La insulina también, estimula enzimas
glucolíticas claves en la corteza cerebral (Hoyer, Prem, Sorbi & Amaducci, 1993). La
insulina en el cerebro podría tener otros efectos benéficos adicionales, como favorecer el
desarrollo neuronal o inhibir la formación de las lesiones cerebrales constituidas por redes
de neurofibrillas (Biessels & Kappelle, 2005), por lo que podría estar asociada también con
funciones tan importantes como el aprendizaje y la memoria (Biessels et al.1998).
Otra posibilidad para explicar la ausencia de bloqueo de los canales KATP en las neuronas
hipocampales CA3 de rata diabética es que la glucosa sí entra a la célula, pero ésta es
incapaz de metabolizarla para producir ATP, lo que consecuentemente afectaría la
regulación de la actividad del canal K ATP y la excitabilidad neuronal (Nichols, 2006).
Evidencias de daño metabólico intracelular en ratas diabéticas han sido reportadas (Makar
et al.1999; Sokoloff, 2004). La enzima glucocinasa que cataliza la conversión de glucosa a
glucosa-6-fosfato, la primera reacción de la glucólisis, juega un papel crítico en la
homeostasis de la glucosa en muchos tejidos incluyendo neuronas (Nichols & Koster,
2002). Una forma de diabetes no dependiente de insulina conocida como MODY2
73
(maturity-onset diabetes of the young) ha sido asociada con actividad reducida de la
glucocinasa (Vionnet et al. 1992), con descenso en los niveles de ATP. Consecuentemente
la actividad de los canales KATP aumenta y disminuye la actividad eléctrica neuronal
(Sakura, Ashcroft, Terauchi, Kadowaki y Ashcroft, 1998; Nichols & Koster, 2002). Lo
anterior explicaría la ausencia de bloqueo por glucosa de los canales
K ATP documentada en este trabajo en la condición diabética.
Una alternativa para obtener energía por las neuronas es vía células gliales, los astrocitos
pueden proveer de lactato a las neuronas, estas transformarlo a piruvato y luego a ATP, sin
embargo, se ha visto que las neuronas pueden detectar y metabolizar la glucosa en ausencia
completa de lactato (Dunn-Meynell, Routh, Kang, Gaspers. & Levin, 2002). Por ello el
lactato no parece ser una molécula reguladora de la actividad energética sino solo un
sustrato alternativo para la actividad neuronal.
En la disponibilidad reducida de ATP también podría involucrarse una proteína
desacopladora, que interrumpe la producción de ATP por fuga de electrones en la
membrana mitocondrial; la UCP-2 (uncoupling protein-2). La expresión de UCP-2 está
aumentada en células pancreáticas de roedores (Chan et al. 2001) y humanos (Brown,
Tomas, Digby & Dunmore, 2002) con diabetes. Sin embargo, Moreira et al. en el 2004,
reportaron el efecto de la diabetes inducida por STZ, en la función mitocondrial de cerebro
de rata, sin observar cambios sustanciales respecto al control.
Para recalcar la ausencia del efecto inhibitorio de la glucosa en la actividad de los canales
K ATP y la importancia de esta observación, es necesario recordar también la función de
neuroprotección de los canales KATP en la isquemia cerebral. Se podría suponer que, al
igual que en la isquemia, en la diabetes, los canales KATP permanecen abiertos debido tal
vez a una reducción del cociente ATP/ADP. La activación de los canales KATP
hiperpolariza a la membrana neuronal y disminuye tanto la excitabilidad, la liberación de
neurotransmisores como el consumo mismo del nucleótido, silenciando a las neuronas
hipocampales (Herteaux, Lauritzen, Widmann & Lazdunski, 1995; Reshef, Sperling &
Zoref-Shani, 2000). En la isquemia esto permite una mayor supervivencia celular, lo cual
podría ocurrir también en el trastorno metabólico de la diabetes. Lo que sugiere que la
activación de los canales KATP podría representar un mecanismo de defensa endógeno
importante en el corto plazo para la viabilidad neuronal en esta patología metabólica.
74
Conclusiones
Los canales KATP en neuronas CA3 de hipocampo:
1. En ratas control y diabéticas la conductancia unitaria y la permeabilidad al potasio
fueron similares (178.5 y 177.4 pS; 3.74x10-13 y 3.84x10-13 cm/s respectivamente).
2. Son dependientes de voltaje tanto en neuronas de ratas control como diabética
(V1/2=2.1 ± 0.6 y k=11.1 ± 0.3 mV; V1/2=5.3 ± 0.6 y k=11.2 ± 0.4 mV).
3. En ratas diabéticas los canales KATP no se opbservó rectificación entrante como
ocurrió con las ratas control.
4. En ratas control y diabéticas los canales KATP son sensibles al ATP de manera
dependiente de la concentración, sin embargo, en ratas diabéticas los canales
mostraron disminución en la sensibilidad al ATP (KD=0.59 mM) comparada con el
control (KD=0.25 mM). El coeficiente de Hill (h) prácticamente no se modificó (2.1
y 2.4 respectivamente).
5. A diferencia de las ratas control, en las diabéticas los canales KATP no se
bloquearon con glucosa (hasta 50 mM). La falta de sensibilidad a la glucosa se
puede deber a la disminución de la sensibilidad al ATP, aunque no se puede
descartar la posibilidad de que la glucosa no entre a la célula o que la síntesis de
ATP no se realice eficientemente.
6. La glibenclamida (100 µM) bloqueó los canales KATP tanto en rata diabética como
en el control.
75
Perspectivas
En este trabajo se encontró que en la diabetes experimental existe modificación de
los parámetros biofísicos de los canales KATP presentes en las membranas de neuronas CA3
del hipocampo de rata, comparado con el control.
Los resultados mostraron que la glucosa aplicada en el medio extracelular no bloqueó la
actividad de los canales KATP en neuronas de rata diabética, posiblemente debido a la
disminución en la sensibilidad al ATP de los canales KATP encontrada en este trabajo en la
condición diabética. En cuanto al estudio de las corrientes unitarias de los canales KATP,
aún falta estudiar la sensibilidad de estos canales a la glibenclamida (relación dosisrespuesta) así como el efecto del PIP2 en la actividad de estos canales en la diabetes.
Además, es importante saber en que parte de la ruta glucolítica la célula ha sido dañada en
esta patología, de tal manera que impide la síntesis de ATP. Lo anterior se realizaría
mediante el uso de inhibidores metabólicos específicos en diferentes etapas de la glucólisis
y/o fosforilación oxidativa combinada con técnicas electrofisiológícas.
También podría confirmarse e investigarse la causa de la aparente ausencia de rectificación
observada en los canales KATP de membranas de neuronas de ratas diabéticas. La adición
exógena de poliaminas en esta condición y el comportamiento subsiguiente de la corriente
de potasio por los canales KATP podría ayudar a explorar y tratar de entender mejor este
resultado.
Puesto que se ha demostrado la participación de los canales KATP en la unión del
metabolismo con la excitabilidad celular y en el precondicionamiento isquémico, es
probable que los canales KATP registrados en este trabajo, se activen durante la diabetes
como un mecanismo de protección neuronal, dejando las células silentes.
Todos estos resultados junto con otras investigaciones podrían ayudar a futuro, para el
diseño de nuevas estrategias de tratamiento de la neuropatía diabética central y favorecer a
evitar el deterioro de las funciones de la memoria y aprendizaje característico de esta
enfermedad.
76
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