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Citometría de flujo: análisis
de comunidades planctónicas
Práctico Microbiología Ambiental 2016.
CURE LGA
¿Qué es la citometría de flujo?
Técnica qué mide características físicas y/o
químicas de células individuales en muestras liquidas
Por ej: tamaño, granulometría celular, contenido de ADN
 Primera aplicaciones: cuantificación de células
sanguíneas (1940), análisis de ADN y de proteínas de
células (1960)
¿Cómo funciona?
Analiza la dispersión de la luz y la fluorescencia emitida de cada célula
individual
Las células fluyen individualmente por un punto donde son irradiadas
con un laser de luz
Alta velocidad: miles de células por segundo
SISTEMAS DE FLUIDO
Presión de fluidos: la
muestra pasa a través de
un punto fijo
Una única partícula
(célula) es interceptada
por un rayo láser
Detectores de luz:
captan la señal (luz)
emitida por cada célula
SISTEMA ÓPTICO
Fuente de luz: láser azul (488 nm)
Forward Scatter (FS): detecta
la dispersión de la luz frontal.
Relacionada con el tamaño celular
Side Scatter (SS): detecta la
dispersión de la luz lateral (a 90° de
la partícula).
Relacionado con la estructura
celular
PMT: Fotomultiplicadores:
transforman la señal lumínica en
eléctrica
Detectores de la luz luego de encontrarse con la célula:
Dispersión de la luz frontal (FS) y lateral (SS)
Fluorescencia emitida por la célula (verde, naranja y rojo) si se excita con el
láser de luz
Emisión de luz por excitación
(Espejos dicroicos y filtros:
descomponen la luz emitida a
distintas longitudes de ondas):
Detector de fluorescencia verde
Detector de fluorescencia naranja
Detector de fluorescencia roja
COMPONENTES BÁSICOS
Sitema óptico: Direccionamiento de señales luminosas. PMTs:
detectan la luz, amplifican la señal y transforman los fotones a
electrones.
Sitema eléctrico: La señal tendrá un valor de voltaje dependiendo de
su intensidad
Sitema informático: procesamiento, presentación y análisis de
datos.
¿Qué puede medir un citómetro de flujo?
PARÁMETRO
Tamaño relativo
Complejidad celular
Pigmentos
Contenido de ADN
TIPO DE MEDIDA
Dispersión frontal (FSC)
Dispersión lateral (SSC)
Fluorescencia natural
Fluorescencia (tinción de
ADN)
Integridad de membrana Fluorescencia (colorantes
ej IP)
Estado redox
Fluorescencia (colorante
redox ej CTC)
Aplicación en Microbiología acuática
Permite la medición simultanea de varias propiedades de células
individuales en muestras de agua
 Rápida y elevada cuantificación de células individuales
Identificación y cuantificación del plancton menor a 100 µm de
diámetro (microplancton, nanoplancton, picoplabncton y virus
Aplicación en Microbiología acuática
Estudio de comunidades microbianas naturales.
Autótrofos (cyanobacterias), detecta pigmentos naturales ej: Clorofila,
pigmentos secundarios (ficobilinas: fluorescencia naranja).
Heterótrofos: como no tienen fluorescencia propia hay que teñirlos
para su detección (tinción del ADN).
Discrimina distintas fracciones de microorganismos que integran la
comunidad global.
Permite cuantificar un elevado número de células por unidad de
tiempo (aprox hasta 1000 ev/seg).
ANÁLISIS DE DATOS
Ejemplo muestra teñida con SYBR Green
Histograma: muestra datos de un solo
parámetro. Cantidad de eventos vs
intensidad de la señal
Citograma: correlaciona dos
parámetros ej: fluorescencia verde
(FL1) vs LALS (side scatter:
dispersión lateral)
Heterótrofos: High y Low ADN (dos poblaciones)
Las diferentes regiones resultantes en los citrogramas se denominan
poblaciones: agrupación de bacterias según la similitud en la emisión de
fluorescencia
La emisión de fluorescencia verde es proporcinal al contenido de ADN
(J.M Gasol and P.A Del Giorgio 2000)
Heterótrofos: High y Low ADN (dos poblaciones)
Tres poblaciones: H DNA (H), L DNA (L) y beads (B: perlas de
referencia con tamaño conocido: 1µm).
El resto de los puntos es ruido (ej: materia orgánica disuelta)
H DNA vs L DNA: Relacionado con el estado fisiológico de las bacterias.
Mayor contenido de ADN: mayor actividad
(J.M Gasol and P.A Del Giorgio 2000)
Citometría de flujo (CF):
evaluación de calidad de agua
CF: técnica rápida y eficiente (detecta la totalidad de las células presentes
en el agua) para monitorear la concentración de bacterias en tratamientos de
agua para potabilizar.
Ventajas sobre clásicas técnicas utilizadas en el recuentro de bacterias en agua
potable.
Recuento en placa: consume más tiempo,
detecta solamente las células cultivables.
Medición de concentración de ATP
(Adenosine Triphosphate: indicativo de la
actividad metabólica).
Técnica afectada por el ATP extracelular
resultante de su liberación en la muerte celular
en las etapas de potabilización (ej: ozonización)
Foto: Sistemas de distribución de agua
potable
Citometría de flujo:
evaluación de calidad de agua
Útil para monitoreo en los procesos de tratamientos de agua o para la
detección de cambios en la calidad del agua potable.
Método que detecta cambios en estado fisiológico de las bacterias (ej: activas
vs no activas)
La intensidad en la fluorescencia esta directamente relacionada con el
contenido en acido nucleído (ADN), lo que se relaciona con el estado fisiológico
de la bacteria.
Conteo de bacterias totales en procesos de tratamientos de agua
para beber (Hammes et al., 2008)
Muestra in situ de Lago
Zurich
Luego del proceso de
ozonización (proceso de
desinfección)
Luego de filtrar con carbono activado (GAC: granular active
carbon)
H DNA
L DNA
(Hammes et al., 2008)
Relación entre población H DNA con actividad
metabólica (medida mediante concentración de ATP)
Estudio llevado acabo en
sistemas de potabilización y
distribución de agua para
beber (planta de
tratamiento en Países Bajos)
Liu et al., 2013
Relación entre población H DNA con
calidad del agua
Se encontró relación positiva entre la población H DNA
con la contaminación del agua por bacterias (Prest et al.,
2013)
Agua directamente del grifo: mayor proporción de H DNA
Luego de dejar correr 1.5 lts: menor propoción de H DNA
(lavado del agua eliminación de posibles bacterias presentes en biofilms de cañerías).
Prest et al., 2013
A mayor proporción de agua no contaminada: mayor propoción de
L DNA
Prest et al., 2013
ACTIVIDAD PRÁCTICA
Bacterias heterótrofas: la fluorescencia estará dada por un
fluorocromo: SYBR-Green: colorante para ácidos nucleicos (tiñe ADN y
ARN). Exc/ Em: 494/521 (verde)
Descongelar las muestras y teñir con SYBR Green (1 µl/ ml). Esperar 10
minutos en oscuridad.
Inmediatamente antes de medir agregar las Beads (perlas de referencia
de 1 µm de diámetro): 5 µl/ ml).
Determinar abundancia de heterótrofos totales
Determinar abundancia de H DNA LDNA
¿Se encontró relación entre la abundancia de H DNA con la calidad del
agua?
Proporción de coliformes fecales respecto a heterótrofos totales
CITÓMERTO DE FLUJO
A medida que la célula pasa a través del rayo de luz, se genera un
pulso (evento)
-Área: proporcional a la fluorescencia total de la célula
-Ancho y alto: proporcional a lo que demora la célula en pasar a través del haz de
luz
-El ancho del pulso para el FS se relaciona con el tamaño celular (para partículas
superiores a 10 micras)