Download EFECTO DE LAS CITOCINAS IL-1 , IL-6 Y TNF
Document related concepts
Transcript
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS EFECTO DE LAS CITOCINAS IL-1, IL-6 Y TNF-α SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO MURINO Y LA PRODUCCIÓN DE ROS IN VITRO. Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Vanesa Sofía Zambrano Hernández Como requisito parcial para optar al grado de Magíster en Ciencias Biológicas Realizado con la tutoría de la profesora María Isabel Camejo Bermúdez Febrero, 2009 ii iii AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo de grado, fue lograda gracias al apoyo de las personas e instituciones nombradas a continuación. A mis padres, pilares fundamentales en mi vida, cuyo apoyo incondicional permitió el desarrollo y culminación de mis estudios de postgrado. A mi esposo, Ángel, por su compañía, ayuda y apoyo en todo momento. A la Dra. María Isabel Camejo, profesora del departamento de Biología de Organismos de la Universidad Simón Bolívar, Tutora y amiga; tu confianza y apoyo hizo posible este logro. Al Dr. Freddy Sifontes, Jefe de la División de Servicios Técnicos Auxiliares del Instituto Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨, quien fue fundamental en la fase experimental de la tesis. Al Bioterio del Instituto Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨ y a todo su personal, principalmente al Dr. Moya, el Dr. Albornoz y a la Dra. Carmen González, quienes colaboraron enormemente proporcionando los ratones para la ejecución de los experimentos. Al Fonacit, por la beca concedida durante el desarrollo de esta tesis. iv RESUMEN El proceso de transporte de los gametos, la fecundación y el desarrollo embrionario temprano se llevan a cabo en el oviducto. Procesos como la endometriosis, las infecciones y el hidrosalpinx pueden perjudicar el desarrollo embrionario pre-implantación. El fluido peritoneal y tubárico de las mujeres con procesos inflamatorios presentan concentraciones elevadas de IL-1β, IL-6 y TNF-α. Adicionalmente, informes recientes indican que ciertas citocinas inducen producción de ROS en diversas células. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de citocinas pro-inflamatorias en diferentes concentraciones, de fisiológicas hasta las observadas durante procesos de inflamación del tracto reproductor femenino, sobre el desarrollo embrionario temprano murino, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y apoptosis. Embriones de ratón de dos a cuatro células fueron recolectados por lavado del oviducto y cultivados por 96 horas en condiciones control y a diferentes concentraciones de IL-1 (1, 10, 100 pg/ml), IL-6 (50, 500, 1000 pg/ml) y TNF (10, 100, 1000 pg/ml) simulando condiciones fisiológicas y patológicas. En todas las condiciones se evaluó el desarrollo embrionario, la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) y O2- (NBT), liberación de nitritos (reacción Griess) en el medio de cultivo y el daño al ADN (TUNEL). Se observó que las citocinas estudiadas afectan adversamente el desarrollo embrionario e inducen la producción intracelular de H2O2. La IL-1β, y TNF-α estimulan la producción de O2- solo en las concentraciones de 1 y 10 pg/mL respectivamente, mientras que IL-6 en todas las concentraciones patológicas. Solo TNF-α induce la producción de oxido nítrico en embriones de ratón en cultivo. La IL-1β, IL-6 y TNF- en concentraciones patológicas inducen la apoptosis en el embrión murino. Estos resultados indican que las citocinas en el tracto reproductor femenino en concentraciones elevadas eventualmente pueden provocar un incremento en los ROS que puede afectar el desarrollo embrionario y provocar la muerte celular. Palabras claves: embrión, ROS, citocinas, desarrollo embrionario, apoptosis. v ÍNDICE GENERAL AGRADECIMIENTOS Pág. iii RESUMEN iv ÍNDICE GENERAL v ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS vi I- INTRODUCCIÓN II- INFERTILIDAD HUMANA 1 4 III- PROCESOS INFLAMATORIOS DEL TRACTO REPRODUCTOR FEMENINO 6 IV- DESARROLLO EMBRIONARIO PRE-IMPLANTACIÓN 8 4.1-Generalidades 4.2-Control génico durante el desarrollo embrionario 4.3-Desarrollo embrionario in vitro 4.4-Metabolismo embrionario 8 12 13 15 V- ESTRÉS OXIDATIVO VI- ESTRÉS OXIDATIVO Y SU EFECTO SOBRE EL EMBRIÓN VII- OBJETIVOS VIII- MATERIALES Y MÉTODOS IX- RESULTADOS X- DISCUSIÓN XI- CONCLUSIONES XII- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 18 23 26 27 38 52 66 67 vi ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Figura 1 Trayectoria de los gametos en la trompa de Falopio Pág 8 Figura 2 Desarrollo embrionario pre-implantación 10 Figura 3 Generación de ROS en las células. Principales fuentes de ROS y metabolismo. 19 Tabla 1 Concentraciones de las citocinas: IL-1β, IL-6 y TNF-α en condiciones fisiológicas y patológicas tanto en fluido peritoneal (FP) como en fluido hidrosalpingeal (FH) reportadas en la literatura. 30 Tabla 2 Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α empleadas en las diferentes condiciones experimentales de esta investigación. 31 Figura 4 Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de evaluar el desarrollo embrionario murino alcanzado al 4to día de cultivo en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL y IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 40 Tabla 3 Porcentaje de blastocistos obtenido, índice de blastulación, arresto y retraso en el desarrollo y defectos morfológicos en embriones murino cultivados en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 41 Figura 5 Porcentaje de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto al ser cultivados en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 42 Figura 6 Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia luego de realizar la prueba para determinar la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 43 Tabla 4 Semi-cuantificación de la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las 44 vii mismas (grupo control). Figura 7 Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de realizar la prueba para determinar la producción intracelular O2- (NBT) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 46 Tabla 5 Semi-cuantificación de la producción intracelular de O2- (NBT) durante el desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 47 Tabla 6 Efecto de la IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL y TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL sobre la producción y liberación de óxido nítrico al medio de cultivo por embriones de ratón. 48 Figura 8 Concentraciones promedio de óxido nítrico liberadas al medio de cultivo por embriones de ratón cultivados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 49 Figura 9 Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia luego de realizar la técnica para evaluar apoptosis (TUNEL) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control). 50 I- INTRODUCCIÓN La infertilidad se define como la carencia de concepción luego de un año de relaciones sexuales no protegidas y afecta aproximadamente de un 10 a 15% de las parejas (Remohi, 2005). Se estima que la mujer contribuye a la infertilidad de la pareja en un 55% y el factor masculino con un 45%, mientras que aproximadamente un tercio de las parejas tienen una causa mixta (Agarwal, 2005). Entre las causas femeninas asociadas a infertilidad se pueden mencionar: el factor ovulatorio (30 a 35%), el factor tubárico (30 a 35%), causas inexplicadas (20 a 30%) y el resto está representado por factores inmunológicos, cervicales, entre otros (Chukwuemeka y col, 2002). Es conocido que los procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino pueden comprometer la fertilidad de la mujer causando infertilidad tubo-peritoneal y que son capaces de originar en el tracto reproductor femenino una respuesta inmunológica que conlleva a la secreción de citocinas pro-inflamatorias y agentes quimiotácticos para conducir a la inflamación como mecanismo de defensa del organismo (Dube y col, 2001). Se ha demostrado que tanto el fluido peritoneal de mujeres con endometriosis (Taketani y col, 1992) como el fluido de hidrosalpinx (Singh y col, 2000; Carrasca y col, 2000) tienen un efecto embriotóxico en embriones de ratón en cultivos in vitro (Strandell y col, 1998), sin embargo, hasta la fecha no se conoce con exactitud cual factor presente en estas secreciones es el responsable de esta toxicidad sobre el desarrollo embrionario preimplantación. 2 Los ambientes del fluido peritoneal y del oviducto son muy importantes ya que es allí donde ocurre la interacción entre los gametos, la formación del cigoto y el clivaje del embrión hasta llegar a blastocisto (Agarwal, 2003). Se ha propuesto que cualquier anormalidad en la composición química de estos fluidos o el desequilibrio en sus componentes podría tener un efecto perjudicial sobre el desarrollo del embrión pre-implantación, en el proceso de implantación, o ambos, conduciendo al fracaso reproductivo (Agarwal, 2005). Se ha observado que en fluidos provenientes de mujeres con procesos patológicos puede haber variaciones en las concentraciones de electrolitos, proteínas, factores de crecimiento y algunas citocinas como IL-1 (Bedaiwy y col, 2005), TNF- (Bedaiwy y col, 2005; Barmat y col, 1999; Bedaiwy y col, 2001), IL-8 (Bedaiwy y col, 2001) y IL-6 (Brawn y col, 1996; Koga y col, 2005) encontrándose un incremento de citocinas pro-inflamatorias. Adicionalmente, se ha propuesto que el estrés oxidativo podría estar involucrado en la embriotoxicidad de estos fluidos. El estrés oxidativo se origina por el desequilibrio entre la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos antioxidantes propios del organismo, donde se genera un aumento de ROS (Agarwal y col, 2003). Las especies reactivas de oxígeno a concentraciones bajas, son fundamentales en algunos eventos del proceso reproductivo (Taylor y col, 2001; Miesel y col, 1993; Salas-Vidal y col, 1998); sin embargo, cuando ocurre un desequilibrio, los niveles aumentados de ROS pueden perjudicar este proceso. Es conocido que los ROS en exceso tienen un efecto citotóxico, originando peroxidación de los fosfolípidos de membrana (lo que causa un aumento en la permeabilidad de membrana y pérdida de su integridad), inactivación enzimática, daño estructural de ADN y muerte celular (Guerin y col, 2001; Agarwal y col, 2003; Wells y col, 2005). Las especies reactivas de oxígeno tienen la capacidad de regular la actividad de las proteínas y la expresión de genes (Van Langendonckt y col, 2002). En particular participan 3 en la trascripción de los factores NF-kB y AP-1, los cuales controlan los genes involucrados en la respuesta inmunológica, defensa celular y expresión de citocinas y moléculas de adhesión celular. La activación de NF-kB involucra la liberación de su subunidad IkB, la cual es inducida por citocinas como IL-1 y TNF-α (Van Langendonckt y col, 2002). Adicionalmente, estudios in vitro han aportado datos concernientes a la capacidad de ciertas citocinas para inducir la producción de ROS en diversas células (Volk y col, 2000; Ben-Shlomo y col, 1994; Sugino y col, 2002). En resumen durante diferentes patologías como la endometriosis, el hidrosalpinx y las infecciones, el fluido tubárico, puede variar en composición, incrementando la concentración de citocinas pro-inflamatorias y posiblemente los ROS, pudiendo perjudicar los procesos de fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Sin embargo, la forma como este fluido tubárico presente durante estos procesos inflamatorios e infecciones ejerce un efecto deletéreo sobre el embrión y la implantación es desconocida. En el presente trabajo de investigación se cultivaron embriones de ratón en estadio de preimplantación en condiciones que asemejen un ambiente inflamatorio, caracterizado por la presencia de niveles elevados de IL-1, IL-6 y TNF- en el medio de cultivo, para evaluar el efecto de estas citocinas sobre el desarrollo embrionario y su posible efecto embriotóxico, la producción de ROS y potencial daño al ADN. 4 II-INFERTILIDAD HUMANA La infertilidad es un problema que afecta a una de cada seis parejas. La infertilidad puede ser definida como la carencia de concepción luego de un año de relaciones sexuales no protegidas y afecta aproximadamente de un 10 a 15% de las parejas (Remohi, 2005). Se estima que la mujer contribuye a la infertilidad de la pareja en un 55% y el factor masculino con un 45%, mientras que aproximadamente un tercio de las parejas tienen una causa mixta (Agarwal, 2005). Entre los factores asociados a la infertilidad se pueden mencionar: el factor ovulatorio (presente en alrededor del 20% de las parejas), el factor útero-tubario-peritoneal (aproximadamente en 30% de las parejas), el factor de migración de semen (10% de las parejas), el factor masculino (30% de las parejas) y el resto está representado por causas inexplicables (Chukwuemeka y col, 2002). En cuanto al factor ovulatorio, involucra el desarrollo, la maduración y la ruptura adecuada del folículo; el factor útero-tubario-peritoneal incluye el estudio de la integridad tubárica, la cavidad uterina y la presencia de adherencias pélvicas que comprometan la anatomía del aparato genital femenino. El factor de migración espermática incluye el estudio de la relación entre el mucus cervical y los espermatozoides. Las alteraciones en esta interacción provocan la reducción en el número y la motilidad de los espermatozoides y su desplazamiento dentro del mucus cervical, perjudicando la llegada de los mismos a las trompas y fertilización del óvulo. 5 Una de las pruebas para evaluar la fertilidad masculina es el estudio del semen. Es conocido que algunas afecciones provocan alteraciones en la calidad y cantidad de los espermatozoides, como el varicocele, infecciones genitales, traumatismos, sustancias tóxicas entre otras. Finalmente cuando se han considerado todos los factores mencionados y no se ha encontrado ninguna alteración objetiva que lleve a un diagnóstico definido se considera que la infertilidad es inexplicada. La infertilidad es una condición que afecta entre un quinto y un sexto de las parejas en edad reproductiva. En el campo de la salud reproductiva, la infertilidad implica una deficiencia que aunque no compromete la integridad física del individuo puede provocar frustración. Comparado con otras especies, el ser humano es altamente ineficiente en términos de reproducción. La tasa de fertilidad por ciclo es de alrededor de 20% y la tasa de embarazos acumulados en las parejas con fertilidad probada es aproximadamente 90% después de doce meses y 94% después de dos años (Remohi, 2005). 6 III-PROCESOS INFLAMATORIOS DEL TRACTO REPRODUCTOR FEMENINO Es conocido que los procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino pueden comprometer la fertilidad de la mujer causando infertilidad tuboperitoneal. Entre estos procesos se pueden mencionar: las infecciones recurrentes y asintomáticas originadas por bacterias como Neisseria gonorreae (Maisey y col, 2003), Chlamydia trachomatis (Carmona, 1998; Rasmussen y col, 1997) y Ureoplasma urealyticum, microorganismos que pueden provocar una enfermedad inflamatoria pélvica, la endometriosis pélvica (Taketami y col, 1992) y el hidrosalpinx (Chang y col, 2004), entre otros. La endometriosis es una enfermedad crónica y recurrente caracterizada por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina (Van Langendonckt y col, 2002; Lebovic y col, 2001). Es una enfermedad casi exclusiva de mujeres en edad reproductiva, caracterizada por una respuesta inflamatoria general en la cavidad peritoneal (Agarwal y col, 2005) con síntomas como: dismenorrea, sangrado intermenstrual, disuria y dolor pélvico. El hidrosalpinx se conoce como la acumulación de líquido en las trompas de Falopio y su posterior dilatación, ocasionada por una obstrucción tubárica distal con reflujo hacia la cavidad endometrial y es conocido que puede originarse tanto por procesos infecciosos como por patologías como la endometriosis (Spandorfer y col, 1999). Tanto las infecciones, como la endometriosis y el hidrosalpinx son capaces de originar en el tracto reproductor femenino una respuesta inmunológica que conlleva a la secreción de 7 citocinas pro-inflamatorias y agentes quimiotácticos para conducir a la inflamación como mecanismo de defensa del organismo (Dube y col, 2001). No está claro como los procesos inflamatorios en el tracto reproductor femenino comprometen la fertilidad de la mujer, sin embargo es conocido que las infecciones pueden ocasionar un daño tisular de las trompas de Falopio. Durante la endometriosis severa pueden formarse adherencias, mientras que el hidrosalpinx puede provocar la obstrucción tubárica de forma unilateral o bilateral, sin embargo, se propone que otros mecanismos deben estar involucrados en los casos de endometriosis de bajo grado los cuales están vinculados a estados de subfertilidad, con índices de fecundidad mensual de 0,02 a 0,1 (cuando normalmente está entre 0,15 y 0,20) de difícil explicación (Wang y col, 1997; Mio y col, 1992). Se ha demostrado que tanto del fluido peritoneal de mujeres con endometriosis (Taketani y col, 1992) como del fluido de hidrosalpinx (Singh y col, 2000; Carrasca y col, 2000) tienen un efecto embriotóxico en embriones de ratón en cultivos in vitro (Strandell y col, 1998), sin embargo, existen controversias en los resultados (Koong y col, 1998), además, el mecanismo por el cual estos fluidos producen embriotoxicidad es desconocido hasta la fecha. Diversos estudios han tratado de determinar cuales de los factores presentes en estas secreciones son los responsables de la toxicidad de estos fluidos sobre el desarrollo embrionario pre-implantación, así se ha investigado la presencia de diversas citocinas y factores de crecimiento (Barmat y col, 1999), así como sus concentraciones (Bedaiwy y col, 2001). 8 IV-DESARROLLO EMBRIONARIO PRE-IMPLANTACIÓN 4.1-Generalidades: Los ovocitos humanos en condiciones normales in vivo son captados por las fimbrias tubáricas unas horas después de la ovulación y avanzan a lo largo de la trompa gracias a la actividad muscular y ciliar para que se lleve a cabo la fertilización en el ámpula (Remohi, 2005). Figura 1: Trayectoria de los gametos en la trompa de Falopio (Vitrolife, Closer to Nature, 2002). 9 El proceso de fertilización es un fenómeno de múltiples pasos que se inicia con la interacción y posterior fusión de los gametos (Wassarman, 2005; Nixon y col, 2005) la cual desencadena una cascada de señalización que resulta en la transformación del ovocito fecundado a un embrión diploide capaz de formar un nuevo organismo, que poseerá características genéticas de ambos progenitores (Evans, 2002). El desarrollo embrionario de los mamíferos en fase pre-implantación es marcadamente similar. Tras la fusión de los gametos, los cigotos comienzan una serie de repetidas mitosis, dividiéndose en intervalos de 16-24 horas en los estadios tempranos, siendo estas primeras divisiones habitualmente asincrónicas. Al alcanzar un número de 16-32 células o blastómeras es considerado una mórula, momento en el cual llega al útero para continuar su desarrollo (Ben-Yosef y col 2004; Remohi y col, 2005). Posteriormente sus blastómeras se van compactando y es llamada mórula compactada. Cabe destacar que el desarrollo desde la fecundación hasta el estadio de mórula tiene lugar mientras el embrión desciende por la trompa gracias a la acción ciliar y peristáltica y que a lo largo de su recorrido se encuentra englobado en la zona pelúcida que mantiene un microambiente adecuado. Las blastómeras de los embriones tempranos tienen una fisiología análoga a los organismos unicelulares y solo después que sufren la compactación de las blastómeras y se genera el primer epitelio de transporte, es cuando las células de la nueva mórula presentan una fisiología similar al de la células somáticas (Gardner y col, 1998; Lane, 2001). La dinámica de desarrollo de las blastómeras se caracteriza por una diferenciación de las uniones intercelulares que se van modificando a lo largo del desarrollo embrionario. Al principio, hasta el estadio de 4 células, las blastómeras se comunican entre sí con uniones tipo gap, semejantes a los desmosomas primarios y por microvellosidades en los espacios intercelulares. En el estadio de 6 a 8 células aparecen uniones estrechas y se diferencian los desmosomas. Las blastómeras comienzan a formar una red sincitial e inician un proceso de 10 compactación, durante el cual pierden su identidad y se convierten en una masa celular compacta, formándose el blastocisto (Remohi, 2005). Aproximadamente en el día 5 empieza a formarse una cavidad denominada blastocele y se produce la diferenciación celular, en este momento es denominado blastocisto y puede ser clasificado como temprano o cavitado. Luego el blastocisto se expande, en este momento se observa el blastocele rodeado de una monocapa celular o trofoectodermo (TE) que formará la placenta y una masa celular interna (ICM) que dará lugar al embrión. Posteriormente el blastocisto eclosiona de la zona pelúcida para que ocurra la implantación en el endometrio aproximadamente al día sexto tras la fecundación (Remohi, 2005). Figura 2: Desarrollo embrionario pre-implantación (Mercader y col, 2000). 11 La formación de la cavidad del blastocisto (blastocele) representa el comienzo del transporte de fluido por las células del trofoectodermo, así como la diferenciación física de las células en un compartimiento interno (masa celular interna) y otro externo (trofoectodermo), que engloba la masa celular y retiene el fluido del blastocele. Dentro del estadio de blastocisto podemos diferenciar cuatro tipos: el blastocisto temprano (Bt), cuando comienza a formarse la cavidad y empieza la diferenciación celular; el blastocisto cavitado (Bc), donde el blastocele ocupa mas del 50% del volumen del embrión; el blastocisto expandido (Be), cuando se observa el blastocele rodeado por una monocapa celular o trofoectodermo, que formará la placenta y una masa celular interna, que dará lugar al embrión. Con la expansión del embrión se produce un aumento del volumen y una disminución del grosor de la zona pelúcida y por último, el blastocisto eclosionando o “hatching” (BHi), cuando el blastocisto está saliendo de la zona pelúcida y el eclosionado o “hatched” (BH), cuando el blastocisto ha salido completamente de la zona pelúcida (Remohi, 2005). Después de la formación del blastocisto, en su superficie celular aparecen glicoproteínas, glicolípidos y enzimas de transporte. Los organelos celulares también se diferencian, se elongan las mitocondrias y se yuxtaponen al retículo endoplasmático durante las divisiones embrionarias. También se modifica el aparato de golgi y los lisosomas primarios se diferencian en lisosomas secundarios. En este momento, el embrión comienza a ser sensible a nuevos estímulos. El trofoectodermo y la masa celular interna se comunican además de por uniones estrechas, por interacciones entre moléculas de superficie y por señales autocrinas y paracrinas. Todos estos sistemas están también involucrados en la reparación de los daños que puedan haber sufrido los embriones a lo largo de su desarrollo (Remohi, 2005). El embrión en periodo de pre-implantación tiene características únicas ya que evoluciona en ausencia de contacto celular directo con el tracto reproductor materno, durante aproximadamente una semana (en el caso de humanos) antes de implantarse en el útero. Durante este periodo, el embrión sufre divisiones celulares, apoptosis y diferenciación y es dependiente de las secreciones luminales del oviducto y del útero para su nutrición. 12 El embrión en su recorrido desde el oviducto hasta el útero pasa por condiciones específicas de pH (Dale y col, 1998) y de oxígeno (Dumoulin y col, 1999). El pH del fluido folicular humano es de 7.2-7.3, el del fluido oviductal es de 7.6-7.9, mientras que el pH del útero es más ácido que el del oviducto, lo que indica que los embriones de mamífero encuentran tres ambientes en su travesía desde el folículo hasta el útero (Dale y col, 1998). Además es conocido que las condiciones de oxígeno entre el oviducto y el útero varían entre 1.5 y 9% (Dumoulin y col, 1999), aspecto que explica que investigadores hayan demostrado que condiciones bajas de oxígeno favorecen el desarrollo de embriones pre-implantación in vitro en algunas especies como ratón (Gardner y Lane, 1996) y hámster (Mckiernan y col, 1990). En el desarrollo embrionario pre-implantación in vivo, un alto porcentaje de embriones se bloquean o detienen naturalmente en estadios pre-implantación y aproximadamente un 15% lo hace luego de la implantación, antes de la semana 10 de embarazo (Remohi, 2005). 4.2-Control genético durante el desarrollo embrionario: Los procesos de síntesis proteica en el ovocito una vez éste es activado por el espermatozoide, se pueden considerar como el resultado de dos programas de desarrollo: uno de ellos comienza durante la oogénesis y el otro se inicia en el momento de la fecundación. La transición de un programa a otro viene definida por dos periodos, uno controlado por factores acumulados en el ovocito, que constituyen la herencia materna y otro regulado por la actividad del genoma embrionario procedente de ambos progenitores (Kawamura y col, 2001) Este periodo que transcurre desde la fecundación hasta la implantación, es crítico a nivel genético, ya que representa la transición desde un programa de gametogénesis a otro de proliferación rápida y diversificación. Así pues, la información génica que contiene un embrión procede de dos fuentes: el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) materno que proviene del ovocito y el ARNm embrionario que comienza a sintetizarse en estadios posteriores, después de la fecundación, aproximadamente cuando el embrión tiene 8 blastómeras en el caso del humano, este fenómeno se llama activación del genoma embrionario. Este ARNm participa en la transcripción de factores nucleares, elementos del 13 citoesqueleto, proteínas de membrana y secretadas al medio (incluyendo factores de crecimiento y sus receptores), así como en los componentes de la maquinaria metabólica de estos embriones (Remohi, 2005). La activación de los genes en los estadios mas tempranos del desarrollo embrionario preimplantatorio dependen del genoma materno, periodo cuando se codifican muchos factores que incluyen precursores de complejos de unión y algunos otros factores que se relacionan con el crecimiento y no con funciones especializadas. Por otro lado, la activación del genoma embrionario varía con la especie: en humanos, comienza en fases muy tempranas, habitualmente cuando el embrión alcanza entre 4 y 8 células, mientras que en el ratón ocurre en el estadio de 2 células (Lawitts y col, 1991; Gardner y Lane, 1993). Esta expresión de genes por parte del embrión, como por ejemplo factores de crecimiento, es muy importante ya que sin ellos no se iniciarían los procesos de compactación y desarrollo del blastocisto que permiten la diferenciación de las células especializadas necesarias para el crecimiento intrauterino. En resumen, la activación del genoma embrionario es el momento de transición de la síntesis de proteínas ya no a partir de material contenido en el ovocito materno sino a partir de la transcripción del genoma embrionario (Larson y col, 1992), lo que indica una clara transición del control materno al embrionario. 4.3-Desarrollo embrionario in vitro: En los procesos de fertilización in vitro, se obtienen ovocitos de una mujer que ha sido estimulada hormonalmente para lograr un número mayor de ovocitos y luego se incuban con espermatozoides en un medio específico para la fertilización (IVF), o se les introduce un espermatozoide, por la técnica de inyección intra-citoplasmática de espermatozoides (ICSI), los ovocitos fecundados continúan su desarrollo embrionario en cultivo, sin embargo, solo un 50% progresa hasta estadio de blastocisto (Kably y col, 2001). En estos procedimientos de reproducción asistida no todo óvulo será fertilizado y no todo óvulo es fertilizado correctamente, esto dependerá en parte de la calidad de los gametos 14 (Lonergan y col, 2001; Kably y col, 2001), siempre que se garanticen las condiciones de cultivo adecuadas. La tasa promedio de fertilización es de 75%, es decir que de cada 10 óvulos que se colocan con los espermatozoides van a fertilizar aproximadamente 7 y cuando se trabaja con parejas con problemas en los gametos, la tasa de fertilización suele ser menor (Remohi, 2005). También es importante destacar que no todo óvulo fertilizado avanza en su desarrollo, muchos sufrirán un descarte natural, que no tendrá que ver con la técnica realizada, sino con las características intrínsecas de cada embrión que estarán determinadas por el óvulo y el espermatozoide (Kably y col, 2001). En embriones humanos el 70% de ovocitos fertilizados experimentan las tres primeras divisiones durante los tres primeros días de cultivo, solo la mitad llega a cavitación al día 5 (Gardner y col, 1998) y solo 1/3 forma blastocistos morfológicamente óptimos con una masa celular interna bien definida y una expansión apropiada (Alikami y col, 2000). A diferencia del embrión humano que tarda de 5 a 6 días en cultivo post fertilización para llegar a estadio de blastocisto, el embrión de ratón toma entre 3 y 3 ½ días para desarrollarse hasta el mismo estadio conteniendo 32 o mas células (Remohi, 2005). Por otra parte, se ha demostrado una correlación directa entre el tiempo de la primera división celular del embrión post fecundación in vitro, la competencia de desarrollo (Lonergan y col, 2001; Bos-Mikich y col, 2001) y las tasas de embarazo (Sakkas y col, 1998; Lundin y col, 2001). Se ha demostrado que embriones que inician sus divisiones tempranamente progresan con mejor calidad al compararlos con aquellos con clivaje tardío (Lundin y col, 2001), este fenómeno podría deberse a que los embriones con divisiones tempranas provinieron de ovocitos en los cuales hubo una mejor sincronización entre la maduración citoplasmática y nuclear (Mikkelsen y col, 2001), o sus embriones hayan tenido una mayor actividad metabólica o tal vez a una mejor calidad del espermatozoide (Lundin y col, 2001). 15 Por otra parte, Alkami y col, 2000, demostraron que un clivaje anormal al día 2 o 3 de cultivo (<5 células para el día 3 de cultivo) conlleva a una reducción en la formación de blastocistos al día 5 de cultivo. Se ha observado que los embriones que compactaron y formaron ICM exitosamente tuvieron un número mayor de células para los días 2 y 3, al compararlas con los que fracasaron en su desarrollo. Interesantemente, los embriones con clivaje más acelerado, con 9 o 10 células para el día 3 de cultivo, mostraron disminución en la formación de blastocistos normales, lo que sugiere que cuando el clivaje es demasiado rápido podría haber aberración cromosómica (Alkami y col, 2000). Debido a lo discutido anteriormente, el momento de la primera división celular o clivaje forma parte de los criterios de selección de los embriones más óptimos para transferir, junto a las características morfológicas del mismo, como tamaño y forma de las blastómeras, características del citoplasma y presencia o ausencia de fragmentación (Ben-Yosef y col, 2004). Es conocido que algunas especies de mamíferos experimentan bloqueo en su desarrollo in vitro (Devreker y col, 1999; Lawitts y col, 1991), como el observado en embriones de ratón de algunas cepas en el estadio de 2 células. Este bloqueo en el desarrollo ha sido relacionado con varios factores: fracaso en la activación del genoma embrionario, desbalance en la concentración de ciertos constituyentes de medios de cultivo (Lawitts y col, 1991) y con concentraciones de glucosa inadecuadas en cultivo (Leppens y col, 1997; Sakkas y col, 1993), aumento de especies reactivas al oxígeno (ROS), entre otros. 4.4-Metabolismo del embrión pre-implantación: Los embriones obtienen la energía necesaria para su desarrollo mediante la síntesis de ATP, a partir del metabolismo de los monosacáridos. Los sustratos energéticos requeridos por el embrión varían secuencialmente a lo largo de su curso por el tracto reproductivo, siendo los principales sustratos utilizados: piruvato, lactato y glucosa (Sakkas y col, 1993). Durante el desarrollo del cigoto al estadio de blastocisto, el embrión experimenta varios eventos importantes para su desarrollo, tales como la activación del genoma embrionario, la 16 formación de uniones entre células, la diferenciación del TE y ICM y las formación de la cavidad del blastocele. Todos estos eventos tienen requerimientos metabólicos diferentes por parte del embrión (Sakkas y col, 1993). 1-Utilización de la glucosa: Antes de la activación del genoma embrionario, el metabolismo del embrión es bajo y depende principalmente de la trascripción materna, en este estadio el piruvato es la mayor fuente de energía y el embrión tiene una baja capacidad para metabolizar glucosa. Después de la activación del genoma embrionario, la replicación del ADN y la síntesis de proteínas aumentan drásticamente y el embrión es capaz de metabolizar la glucosa, así la utilización de glucosa y piruvato aumenta para satisfacer las demandas extras de energía (Sakkas y col, 1993). Adicionalmente el embrión en estadio tardío también requiere una amplia variedad de nutrientes, incluyendo aminoácidos y vitaminas para soportar las diferentes rutas biosintéticas (Sakkas y col, 2003; Devreker y col, 2001). Este cambio dramático en la utilización de glucosa es necesario para cumplir con las diferentes exigencias metabólicas que surgen a medida que se desarrolla el embrión. Durante el desarrollo del embrión la glucosa es usada en estadios y rutas diferentes (Leppens y col, 1997). La glucosa puede ser almacenada como glucógeno, ser usada vía la ruta pentosa fosfato o entrar en la ruta glucolítica. La selección de la ruta depende de la actividad de ciertas enzimas. Se han evaluado cinco factores que podrían ser clave para la generación de este cambio metabólico, estos son: edad del embrión (horas post hCG), estadio de desarrollo, citocinesis, número celular y activación del genoma embrionario. Se ha encontrado que la activación del genoma embrionario es pre-requisito para el cambio de requerimientos metabólicos y que el tiempo de cambio está asociado con el estadio de desarrollo de compactación y/o cavitación, mientras que el número celular, citocinesis y edad del 17 embrión parecen no estar relacionados con el tiempo del cambio. Estas conclusiones se pueden extrapolar a otras especies (Remohi, 2005). 2-Utilización de los aminoácidos (aas): Los aminoácidos están presentes en altas concentraciones en el tracto reproductor femenino y parecen estar involucrados en el desarrollo de embriones de mamíferos pre-implantación por eso son incluidos en medios de cultivo embrionario. Se ha demostrado que al cultivar embriones de ratón en medios que carecen de los aas presentes en el tracto reproductivo de ratón, se observa una disminución en la viabilidad de los embriones (Devreker y col, 2001). Se han realizado muchos estudios para determinar la función de los aas en embriones preimplantación en diversas especies como ratón, vaca, oveja, hámster y humanos y han concluido que algunos estimulan el desarrollo de los embriones, mientras que otros parecen inhibirlo (Devreker y col, 1999; Gardner y Lane, 1993; Devreker y col, 2001). En general diversos estudios han identificado que ciertos aas actúan como estimulatorios para el desarrollo embrionario (GLY, CYS, LYS), mientras que otros como inhibidores (PHE, VAL, ILE, TYR, TRP, ARG) o neutrales (PRO, SER, THR, HIS, ALA, LEU, ASP, MET) (Devreker y col, 2001). El mecanismo por el cual los aas promueven el desarrollo de embriones pre-implantación es desconocido. Sin embargo, en ratón se ha vinculado a las siguientes funciones: a la síntesis de proteínas y nucleótidos, como fuente de energía, como reguladores de la osmolaridad, como antioxidantes, reguladores de pH y como precursores de moléculas de señalización como el óxido nítrico (Gardner y Lane, 2001). Así pues, el embrión está expuesto a un conjunto de metabolitos variables a lo largo de su desarrollo. En sus primeros estadios consume piruvato y lactato y en estadios posteriores aprovecha la glucosa como sustrato energético. Por lo tanto, el cultivo in vitro requiere un cambio secuencial de los medios de cultivo a medida que el embrión evoluciona. 18 V-ESTRÉS OXIDATIVO La mayoría de las células requieren vivir en condiciones aeróbicas, debido a que el oxígeno es necesario para la vida, sin embargo su metabolismo oxidativo puede ser tóxico, por ser el responsable de la formación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden alterar la función y viabilidad celular (Agarwal y col, 2003). Todas las células aeróbicas están sometidas a estrés oxidativo, el cual es desencadenado por compuestos químicos denominados radicales libres. Un radical libre es una molécula o fragmento de ella que contiene uno o más electrones desapareados en su orbital más externo, producto de la ganancia o pérdida de electrones. Los ROS son formados durante los pasos intermediarios de la reducción del oxígeno: el radical anión superóxido (O2-), el radical peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH·), correspondientes a los pasos de la reducción por uno, dos y tres electrones respectivamente (Guerin y col, 2001). La reducción univalente del oxígeno resulta en la producción del anión superóxido. La dismutación de dos aniones superóxidos, catalizada por la superóxido dismutasa conduce a la formación del peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es destoxificado por la glutatión peroxidada o inactivado a agua y oxígeno por la catalasa. El óptimo balance se da solo cuando hay un balance apropiado entre las concentraciones de superóxido dismutasa, glutatión peroxidada y catalasa. 19 Alternativamente, en presencia de metales de transición como el hierro, el peróxido de hidrógeno genera el radical hidroxilo que es altamente reactivo. El radical hidroxilo es altamente tóxico para las células porque reacciona instantáneamente con todos los componentes celulares (Packhan y col, 1995). Figura 3: Generación de ROS en las células. Las principales fuentes de ROS y su metabolismo (Packham y col, 1995). El óxido nítrico (ON) es otro radical que contiene oxígeno y es sintetizado por la enzima óxido nítrico sintasa y por ser un radical libre con un electrón desapareado es capaz de reaccionar con una gran variedad de moléculas celulares. En condiciones patológicas el ON puede ser sobre-producido y junto con el superóxido originar el peroxinitrito que es un radical altamente tóxico el cual se acumula, este es considerado un radical fuertemente prooxidante similar al radical hidroxilo (Van Langendonckt y col, 2002). El estrés oxidativo se origina por el desequilibrio entre la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos antioxidantes propios del organismo, donde se genera un aumento de ROS (Agarwal y col, 2003). 20 En diferentes tipos de células los ROS pueden incrementar o reducir el porcentaje de proliferación, inducir apoptosis o necrosis, modular la expresión de genes y actuar estimulando o inhibiendo componentes de señalización bien caracterizados; estas capacidades son muy relevantes en la fertilización, desarrollo embrionario temprano e implantación (Taylor y col, 2001). Las especies reactivas de oxígeno a concentraciones bajas, son fundamentales en algunos procesos reproductivos como, la capacitación e hiperactivación espermática, reacción acrosómica (Taylor y col, 2001), la activación del ovocito, la interacción entre las membranas de los gametos (Miesel y col, 1993) y en el proceso de apoptosis necesario en el desarrollo pre-implantacional del embrión, para el descarte natural de embriones con anormalidades genéticas y morfológicas (Salas-Vidal y col, 1998); sin embargo, cuando ocurre un desequilibrio, los niveles aumentados de ROS pueden perjudicar el proceso reproductivo. El metabolismo del oxígeno molecular es importante para los embriones y es conocido que ellos producen ROS en tres formas principales: O2-, H2O2 y OH·. Los ROS pueden ser producidos por varias rutas metabólicas y enzimáticas, incluyendo principalmente: fosforilación oxidativa (OXPHOS), NADPH oxidasa y xantina oxidasa. Es conocido que los embriones pre-implantación generan adenosin trifosfato (ATP) vía OXPHOS y glicólisis. Se ha descrito que en embriones murino el 70% del oxígeno es metabolizado vía OXPHOS en el estadio de blastocisto, mientras que en estadios de dos y cuatro células menos del 30% del oxígeno es metabolizado por esta ruta. La actividad de las oxidasas está presente en embriones pre-implantación y fundamentalmente representada por la NADPH oxidasa y la xantina oxidasa (Guerin y col, 2001). Las células poseen mecanismos de defensa para contrarrestar el efecto tóxico que genera la reducción del oxígeno, estos mecanismos se dividen en enzimáticos y no enzimáticos. 21 Entre los mecanismos enzimáticos, se encuentran la superóxido dismutasa (SOD), responsable de la dismutación del anión superóxido (O2-) intracelular hasta peróxido de hidrógeno (H2O2) más oxígeno (O2). Adicionalmente, la catalasa y la glutatión peroxidada (GP) catalizan el peróxido de hidrógeno; cuando este está en bajas concentraciones, la glutatión peroxidada (GP) en presencia de glutatión reducido (GSH), es oxidado para producir glutatión oxidado (GSSG) más agua, mientras que en concentraciones elevadas de peróxido de hidrógeno, la catalasa interviene en la remoción del peróxido produciendo oxígeno más agua (Guerin y col, 2001). Entre los mecanismos no enzimáticos se encuentran la vitamina E o alfatocoferol, que actúa como donador de un átomo de hidrógeno al radical oxígeno, haciéndolo menos reactivo y el ácido ascórbico o vitamina C, que actúa como donador de hidrogeniones al radical libre de oxígeno (Guerin y col, 2001). Es conocido que los ROS en exceso tienen un efecto citotóxico, originando peroxidación de los fosfolípidos de membrana (lo que causa un aumento en la permeabilidad de membrana y pérdida de su integridad), inactivación enzimática, daño estructural de ADN y muerte celular (Guerin y col, 2001; Agarwal y col, 2003). Adicionalmente estudios in vitro han aportado datos concernientes a la capacidad de ciertas citocinas para inducir la producción de ROS en diversas células. Se ha demostrado que algunas citocinas tales como IL-1, TNF- y IFN-gamma pueden inducir la producción de ROS por las células endoteliales conllevando a peroxidación lipídica y daño al ADN (Volk y col, 2000). Otras publicaciones indican que la IL-1 causa producción y acumulación de nitritos en ovario de rata (Ben-Shlomo y col, 1994), la IL-1 junto con el TNF- y IFN-gamma tienen efectos estimulatorios en la producción de nitritos en líneas celulares osteoblásticas (Hukkanen y col, 1995), la IL-1 y el TNF- estimulan la producción de nitritos en células 22 de cerebro de rata (Romero y col, 1996) y que el TNF- estimula la producción de superóxido dismutasa en el endometrio in vitro (Sugino y col, 2002) y en hepatocitos de ratón in vitro (Adamson y col, 1993). 23 VI- ESTRÉS OXIDATIVO Y SU EFECTO SOBRE EL EMBRIÓN El estrés oxidativo es responsable de muchas alteraciones en el embrión. Los ROS como el anión superóxido (O2-) son capaces de difundir y pasar a través de la membrana celular causando alteraciones en la mayoría de las moléculas celulares como lípidos proteínas y ácidos nucleicos. Las consecuencias son variadas, incluyendo alteraciones mitocondriales, bloqueo celular, depleción de ATP y apoptosis. 6.1-Lípidos: Los ROS inducen peroxidación lipídica afectando la división celular, transporte de metabolitos y disfunción mitocondrial. El bloqueo de 2 células en embriones de ratón ha sido relacionado con peróxidos lipídicos (Nasr-Esfahani y col, 1990). 6.2-Proteínas: Los ROS pueden inducir la oxidación de los grupos sulfidrilo en las proteínas y la formación de disulfuros. Con el estrés oxidativo, los porcentajes de puentes disulfuro y la formación de mezclas disulfuro incrementan dentro de la célula, pudiendo causar inactivación de enzimas como la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) (Guerin y col, 2001). 6.3-ADN: Se conoce que las ROS atacan al ADN, produciendo rupturas de las cadenas de ácidos nucleicos y daño en el contenido genómico de la célula. Se ha encontrado una relación 24 entre el arresto en el desarrollo embrionario in vitro y lesiones al ADN (Guerin y col, 2001). 6.4-Alteraciones mitocondriales: El estrés oxidativo produce daño mitocondrial. El ADN mitocondrial (ADNm) es especialmente susceptible a la mutación debido que carece de histonas que son las que normalmente capturan los ROS. Durante el estrés oxidativo, las mutaciones del ADNm son cuatro veces más frecuentes que las mutaciones del ADN nuclear. El ADNm codifica enzimas esenciales de la maquinaria OXPHOS (Guerin y col, 2001). Embriones con ADNm defectuoso pueden inducir disfunciones metabólicas y como consecuencia, alteraciones en el desarrollo embrionario. Las consecuencias de estas alteraciones son múltiples e incluyen, arresto y retraso en el desarrollo embrionario, disfunciones metabólicas y posiblemente también apoptosis (Guerin y col, 2001). 6.5-Utilización de ATP: La utilización de ATP ocurre en las células vía inactivación de las rutas G3PDH, glicolítica y mitocondrial. El estrés oxidativo induce el consumo de equivalentes reducidos como GSH. La actividad de la glutatión reductasa (GR) permite el mantenimiento del GSH endógeno. La glutatión reductasa (GR) es dependiente de NADPH y la principal fuente de NADPH en el desvío monofosfato (ruta de las pentosa fosfato). Por lo tanto, el estrés oxidativo, vía consumo competitivo de equivalentes reducidos, puede interferir con importantes funciones metabólicas y desviar glucosa desde otras rutas por inducción del desvío monofosfato (Guerin y col, 2001). 6.6-Apoptosis y fragmentación de embriones: 25 La acumulación de radicales superóxidos y la disminución en los niveles de SOD están involucrados en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que antioxidantes como la SOD pueden inhibir la apoptosis. El peróxido de hidrógeno es un mediador de apoptosis en los blastocistos (Yang y col, 1998). Se ha demostrado una relación directa entre el incremento en las concentraciones de H2O2 y la apoptosis en embriones humanos fragmentados (Yang y col, 1998), como en embriones de otras especies (Velez-Pardo y col, 2007). La fragmentación ocurre en embriones humanos y de ratón justo antes del bloqueo en el desarrollo in vitro, por lo cual, la fragmentación podría ser un mecanismo que regula la relación núcleo/citoplasma en blastómeras o un mecanismo protector contra el daño inducido por el estrés oxidativo (Guerin y col, 2001). 26 VII- OBJETIVO -Evaluar el efecto de citocinas pro-inflamatorias sobre el desarrollo embrionario temprano murino, la producción de ROS y daño al ADN. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 1-Eevaluar el efecto de IL-1, IL-6 y TNF- sobre el desarrollo de embriones de ratón in vitro. 2- Determinar el efecto de la IL-1, IL-6 y TNF- sobre la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2-) y nitritos en embriones. 3-Determinar el efecto de la IL-1, IL-6 y TNF- sobre el daño al ADN evaluado por apoptosis en embriones. 27 VIII- MATERIALES Y MÉTODOS 1-Población: Se utilizaron ratones hembras maduras de la cepa NIH (n=349), no consanguíneas de 20 a 25 gramos, provenientes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨. 2-Recolección de embriones: Para la recolección de los embriones se utilizaron pinzas y tijeras quirúrgicas, pipetas Pasteur de vidrio, pipetas volumétricas, pipetas automáticas, puntas descartables, inyectadora de vidrio con aguja n0 30, placas de cultivo (NUNC), placas de cuatro pozos (NUNC), medio de cultivo embrionario IVF (Vitrolife, Sweden), medio de colecta PBS suplementado con HSA al 10%, lupa estereoscópica (Wild Herrbrugg M5A) y una boquilla acoplada a una pipeta Pasteur de fabricación artesanal (a base de mangueras de plástico conectadas a filtros millipore de 0,22 um). Los embriones fueron recolectados 24 h luego de que las hembras presentaron el tapón vaginal. Se sacrificaron los animales por dislocación cervical y luego realizando un procedimiento quirúrgico se extrajeron los oviductos. Posteriormente se realizó un lavado a los oviductos inyectándoles PBS suplementado con HSA desde el ámpula (con la ayuda de la inyectadora de vidrio y la aguja n° 30), para así obtener los embriones encontrados en su interior. Luego de la recuperación de los embriones, los mismos fueron tomados con la boquilla acoplada a la pipeta Pasteur para lavarlos en el medio de colecta PBS (previamente 28 preparado y equilibrado en CO2) en placas de cultivo de cuatro pozos, trasladándolos de un pozo a otro, en orden secuencial. 3-Cultivo embrionario: Los embriones en estadio de 2-4 células fueron colocados en placas que contenían medio de cultivo simple IVF (previamente preparadas y equilibradas en CO2), fueron lavados en las gotas dispuestas en la placa para este fin y luego, se colocaron en las gotas donde fueron cultivados bajo una cubierta de aceite mineral. Cabe destacar que solo fueron seleccionados para este estudio embriones en estadio de 2-4 células con una morfología óptima (blastómeras simétricas y sin presencia de fragmentación citoplasmática). 4- Citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α a diferentes concentraciones: Para la realización de este trabajo empleamos las siguientes citocinas: IL-1β humana recombinante (R&D Systems, código 201-LB), IL-6 humana recombinante (R&D Systems, código 206-IL) y TNF-α humana recombinante (R&D Systems, código 206-IL). Todas las citocinas fueron obtenidas por la expresión de una secuencia de ADN de la proteína madura en E. coli., y con una pureza mayor del 97% determinada por SDS-PAGE. Sus pesos moleculares fueron 17, 20,3 y 17,5 KDa respectivamente y para lograr las concentraciones deseadas con cada citocina preparamos una solución madre para cada citocina de la siguiente forma: para la IL-1β de10 μg, para la IL-6 de 10 μg y para el TNF-α de 100 μg en todos los casos diluidas con agua destilada. Se realizó una revisión bibliográfica para determinar la concentración de las diferentes citocinas en fluido peritoneal en condiciones fisiológicas, es decir, las observadas en 29 mujeres sanas y adicionalmente se evaluó los niveles de citocinas presentes durante procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino como endometriosis e hidrosalpinx. En el presente estudio se utilizó un intervalo de concentración de las diferentes citocinas tomando en cuenta diversas publicaciones que hacen referencia a los valores determinados tanto en condiciones fisiológicas como inflamatorias (patológicas). 30 Tabla 1: Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α en condiciones fisiológicas y patológicas tanto en fluido peritoneal (FP) como fluido hidrosalpingeal (FH) reportadas en la literatura: Citocina Fluido Conc. Fisiológica (pg/ml) - IL-1β: -IL-6: -TNF-α: Conc. Patológica Referencias (pg/ml) FP 5 3 Taketami y col, 1992 FP 13.9 24.3 Sokolov y col, 2005 FP 0 3.71±1.5 Bedaiwy y col, 2007 FH ------- 0.9±0.8 Bedaiwy col, 2005 FP 800± 6 1280±160 Buyalos y col, 1992 FP 27.9 1869.4 Sokolov y col, 2005 FP 5 FP 21.94±21 FH -------- FP --------- 20.65 Kalu y col, 2007 31±35 Bedaiwy y col, 2007 204.8±1 32 Bedaiwy y col, 2005 1.69 Noriega y col, 2003 FP 60 300 Taketami y col, 1992 FP 1.4 3.1 Podgaec y col, 2007 FP 0.82+/- 2.77 FP 0 54±50 FH --------- 6.2 ±3.6 Barmat y col, 1999 FH --------- 12 ±12.8 Bedaiwy y col, 2005 FH --------- 12 46.9±18.9 Bedaiwy y col, 2001 Bedaiwy y col, 2007 Chen y col, 2002 31 Tabla 2: Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α empleadas en las diferentes condiciones experimentales de esta investigación: Citocinas Concentración (pg/ml) IL-1 β 1, 10 y 100 IL-6 50, 500 y 1000 TNF- α 10, 100 y 1000 5-Condiciones experimentales: Después de la recolección y lavado de los embriones, los mismos fueron distribuidos y transferidos al medio de cultivo control (sin citocinas) o al medio de cultivo experimental suplementado con diferentes concentraciones de cada una de las citocinas a evaluar. Todos los embriones fueron cultivados por 4 días (96 h) en grupos de 6-8 embriones por gota de 40 l, bajo aceite mineral Ovoil-100 (Vitrolife, Sweden) en placas de cultivo (NUNC) a temperatura de 37 °C, a 5% de atmósfera de CO2 y entre 5-8% de atmósfera de O2. El desarrollo de los embriones se evaluó en gotas de medio de cultivo con concentraciones de IL-1, IL-6 y TNF- (RD systems) que incluyeron valores observados en fluido peritoneal de mujeres sanas o aquellos presentes en condiciones patológicas como endometriosis (Taketani y col, 1992; Buyalos y col, 1992; Noriega y col, 2003; Bedaiwy y col, 2001 y Podgaec y col, 2007; Bedaiwy y col, 2007; Sokolov y col, 2005 y Kalu y col, 2007) y en fluido hidrosalpingeal de mujeres con hidrosalpinx (Bedaiwy y col, 2005; Barmat y col, 1999 y Chen y col, 2002) respectivamente. 32 A los embriones se les evaluó el desarrollo en cultivo, la producción de peróxido de hidrógeno (diacetato del 2´,7´-diclorodihidrofluoresceina; DCHFDA), la producción de aniones superóxidos (azul de nitro tetrazolio; NBT) y apoptosis (marcaje final de fragmentos de ADN mediado por deoxinucleotidil transferasa; TUNEL), por otra parte el medio de cultivo fue congelado a –200C para la posterior determinación de nitritos (reacción de Griess). 6-Evaluación morfológica de los embriones: Los embriones recolectados se evaluaron con la ayuda de un microscopio ZEISS MC80. Se determinó el estadio embrionario tanto al momento de la recolección como al día 4 de cultivo. Se evaluó el porcentaje de embriones que progresaron hasta estadio de blastocisto. Además, con el fin de definir el efecto de las citocinas estudiadas sobre el desarrollo embrionario temprano, se calculó el índice de blastulación de la siguiente manera: Índice de blastulación= % de blastocisto obtenido en condición experimental/ % de blastocisto obtenido en condición control. Un índice de blastulación 0,5 fue considerado potencialmente embriotóxico, un índice 1,0 fue considerado embriotrópico y los índices entre 0,5 y 1,0 representaron un efecto inhibitorio o adverso sobre el desarrollo embrionario (Chen y col, 2002). Adicionalmente, se consideraron los cambios morfológicos que conforman el criterio de muerte celular: la fragmentación celular y arresto en el desarrollo (Hao y col, 2003) para la futura correlación de datos. Cabe señalar que el término “arresto o bloqueo en el desarrollo” fue usado en el caso de embriones que al día 4 de cultivo presentaron un estadio de 2-4 células (Faveta y col, 2007); el término “retraso en el desarrollo” fue usado en el caso de embriones que al día 4 de cultivo no alcanzaron el estadio de blastocisto, teniendo sin embargo, más de 4 células o blastómeras (Favetta y col, 2007) y el término “embriones con defectos morfológicos”, en 33 el caso de embriones con un espacio intercelular aumentado entre blastómeras, con blastómeras de tamaño y forma irregular, con fragmentación o con una calidad embrionaria subóptima (Hao y col; 2003) 7-Determinación de peróxido de hidrógeno (H2O2) intracelular: El nivel de H2O2 en cada embrión fue medido por el método de 2’7’diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCHFDA, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA). El principio de esta técnica se basa en que el DCHFDA no ionizado difunde rápidamente dentro de la célula, donde los grupos acetato son hidrolizados por la actividad de la estereasa intracelular, formando 2’7’-diclorodihidrofluoresceina (DCHF) que por ser polar es atrapado dentro de la célula. Después el DCHF es oxidado por el H2O2 o por peróxidos lipídicos a 2’7’-diclorofluoresceina (DCF). El nivel de DCF producido dentro de la célula es relativamente lineal a los peróxidos presentes, por lo que la emisión fluorescente aporta una medida de los niveles de peróxido. Los embriones fueron transferidos a una placa de cultivo con medio IVF conteniendo DCHFDA. Después de 15-20 minutos de cultivo a 37°C, los embriones se lavaron con PBS para eliminar la fluorescencia superficial y se colocaron sobre una lámina y se cubrieron con una laminilla. La emisión de fluorescencia de los embriones fue evaluada con un microscopio de fluorescencia con filtros entre 405 y 435 nm por exitación y 515 nm por emisión posterior de su calibración a cero usando una lámpara xenon (100w) y filtros de isiotiocyanatofluoresceina. El DCHFDA fue preparado en dimetil sulfóxido (DMSO) a 1x10-3 M antes de empezar cada experimento y colocado en la oscuridad y usado en un periodo máximo de 48 horas. 34 En cada experimento la concentración fue ajustada a 1x10-5 M diluyendo con IVF (Yang y col, 1998). Como control negativo usamos embriones que habían sido cultivados por 96 horas en ausencia de citocinas (control) y como control positivo, embriones igualmente cultivados en ausencia de citocinas pero tratados con H2O2 (SIGMA) a una concentración de 100 μM. La fluorescencia (producción intracelular de H2O2) fue semi-cuantificada por medio de un sistema de cruces tomando como negativo los embriones control, donde los rangos establecidos indican el porcentaje de la célula en el que se observa la fluorescencia. Los rangos establecidos fueron los siguientes: (0-20%)= 0; (21-40%)=+; (41-60%)=++; (6180%)=+++ y (81-100%)= ++++ 8-Determinación de anión superóxido intracelular (O2-): Los aniones superóxidos fueron determinados como un marcador de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por un ensayo cualitativo basado en la reducción del tetrazolium nitroblue (NBT) a formazan por los aniones superóxidos (O2-) (NBT, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA). Este es un ensayo microscópico convencional basado en el ensayo de NBT, que permite determinar la localización de los aniones superóxidos en embriones in vitro. Inmediatamente de los 4 días de cultivo los embriones intactos fueron lavados en solución salina balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con HSA y luego incubados por 30 minutos en HBSS conteniendo 2 mg/ml de NBT en un baño de maría de agitación a 37°C (en placas de cultivo). Posteriormente, los embriones fueron lavados en HBSS y examinados por microscopía de luz para observar la tinción azul-violeta que indica la reducción de NBT a formazan por aniones superóxidos (Hawk y col, 2003). 35 Como control negativo se usaron embriones que fueron cultivados en ausencia de citocinas y que posteriormente fueron incubados con 30μg/ml de SOD (un potente catalizador de la dismutación de O2- a H2O2 y O2). La coloración azul-violeta fue semi-cuantificada mediante un sistema de cruces tomando en cuenta el control negativo, donde los rangos establecidos indican el porcentaje de la célula en el que se observa la coloración violeta. Los rangos establecidos fueron los siguientes: (05%)=0; (6-25%)=+; (26-50%)=++; (51-75%)=+++ y (76-100%)=++++. 9-Determinación de las concentraciones de óxido nítrico (ON) mediante la reacción de Griess: Los niveles de óxido nítrico en el medio de cultivo se determinaron mediante un test colorimétrico basado en la determinación de nitritos utilizando la metodología de Griess (Moshage y col, 1995). Las concentraciones de nitritos son los metabolitos estables de la síntesis del óxido nítrico (ON) y se utilizaron como indicadores de la formación de radicales de óxido nítrico. De esta forma los niveles de nitritos son proporcionales a las concentraciones de ON. Se realizó un ensayo con los medios de cultivo almacenados previamente conservados a 20°C donde habían sido cultivados los embriones control y aquellos sometidos a la incubación con las citocinas empleadas en este estudio. Se realizaron cinco réplicas en cada condición y cada réplica con un pool de 2 gotas de medio de cultivo (cada gota con 40 μL de medio y entre 6 y 8 embriones que mantuvieron un desarrollo homogéneo en cada condición). Para la determinación de las concentraciones de ON se empleó un ensayo de micro-plato, adicionando 5 l/pozo del reactivo de Griess (Molecular Probes, Inc, Eugene, OR, USA) en una placa de ELISA, 37.5 l/pozo de la muestra o del estándar y 32.5l/pozo de agua 36 destilada. Posteriormente la placa se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. Por último se leyó la absorbancia a 540 nm. Como blanco se usó medio de cultivo IVF (en el cual no se habían cultivado embriones). Se preparó una curva de calibración a partir de una solución estándar de NaNO2 (14,5 nm) diluida en agua, desde 0 hasta 200 M y posteriormente se llevó a cabo la determinación de la absorbancia respectiva de las muestras con un lector de ELISA (Bioteck). A partir de esta curva de calibración se determinaron las concentraciones de nitritos en las muestras con la utilización del programa KC Junior. Este ensayo determinó la liberación espontánea de nitritos por los embriones al medio de cultivo. 10-Determinación de apoptosis en embriones de ratón (TUNEL): El marcaje final de fragmentos de uridina mediado por deoxinucleotidiltransferasa (TUNEL) es una adición enzimática de nucleótidos marcados con fluoresceína a los finales 3’ de ADN que quedan libres como consecuencia de la fragmentación del ADN típica de la muerte celular programada o apoptosis. En orden de visualizar las células apoptóticas, los embriones luego de 72 horas de cultivo en presencia de las diferentes citocinas en las concentraciones pre-establecidas y en ausencia de ellas (control) fueron lavados cuatro veces en búfer fosfato salino (PBS) suplementado con 1 mg de poli-vinil pirrolidona (PVP) por cada mL (PBS-PVP) en placas de cuatro pozos (NUNC). Luego, los embriones, fueron fijados en micro-gotas con paraformaldehído al 4% (w/v) en PBS (pH 7.4). Después de la fijación, los embriones fueron lavados dos veces en PBS-PVP y colocados en grupos de 10 sobre láminas portaobjeto de vidrio recubiertas con Poly L-Lisina, donde se dejaron secar al aire por 12 horas a temperatura ambiente. Posteriormente las láminas fueron lavadas dos veces por dos minutos en PBS-PVP. 37 Los embriones fueron permeabilizados por una hora a temperatura ambiente en tritón X100 al 0,5% (v/v) en citrato de sodio al 0,1% (w/v). Después de la permeabilización, los embriones fueron lavados una vez en PBS-PVP para la realización del procedimiento TUNEL. Posteriormente, se les adicionó a los embriones (ya fijados en las láminas), el reactivo de mezcla TUNEL, preparado siguiendo las especificaciones del Kit comercial (In Situ Cell Death Detection Kit; Roche; Mannheim, Germany) en gotas de 50μL que cubrieran completamente los embriones. Las láminas fueron incubadas en cámara húmeda en oscuridad a 37°C por una hora. Los embriones control negativo fueron expuestos solo a la solución de nucleótidos marcados (no enzima TdT), mientras que los control positivo a DNAsa I, grado I (Sigma). Luego, las láminas fueron lavadas cuatro veces por dos minutos en PBS-PVP y el exceso de líquido fue removido de las láminas y las laminillas fueron montadas sobre las láminas usando glicerol. Los embriones fueron visualizados con un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokyo, Japan). Los embriones que presentaron fluorescencia verde brillante fueron considerados TUNELpositivo, al ser comparados con los embriones controles negativos. 11-Análisis Estadístico: Los resultados obtenidos del desarrollo embrionario en diferentes condiciones fueron evaluados por el test de X2. Valores de p<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los resultados obtenidos de los test cuantitativos fueron analizados por el Test de Student´s (ON). 38 Las correlaciones entre variables fueron realizadas por el test de Pearson. Para ambos análisis se utilizó el programa de estadística “Statistica¨ (Versión 1999). 39 IX- RESULTADOS Una muestra de 349 embriones en estadio de 2-4 células, provenientes de ratones hembras de la cepa NIH, fueron utilizados en cultivos extendidos hasta el día 4. Embriones que presentaron alteraciones morfológicas al momento de la recolección, fueron excluidos del estudio. Los resultados serán presentados de la siguiente forma: la primera tabla y las dos primeras figuras, mostrando el efecto de las citocinas a las concentraciones consideradas como fisiológicas y patológicas sobre el desarrollo embrionario murino pre-implantacional. La segunda tabla y tercera figura, mostrando el efecto de la presencia de las citocinas a las concentraciones ya mencionadas sobre la producción intracelular de peróxido de hidrógeno (H2O2) por los embriones murino; y la tercera tabla y cuarta figura, sobre la producción intracelular de anión superóxido (O2-). La cuarta tabla y quinta figura, presentarán la liberación al medio de cultivo de óxido nítrico por los embriones cuando han sido incubados con citocinas en un intervalo de concentraciones que incluyen tanto la condición fisiológica como la patológica. La última figura mostrará la apoptosis evaluada en los embriones empleaos como control negativo, positivo, así como en aquellos que fueron incubados con citocinas en las diferentes condiciones experimentales. 40 1-Efecto de la IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre el desarrollo embrionario murino: Las figuras 4 y 5 y la tabla 3 muestran el efecto de la IL-1β, IL-6 y el TNF-α a concentraciones consideradas como fisiológicas y patológicas sobre el desarrollo embrionario pre-implantacional murino. Es conocido que los embriones de ratón en cultivo tardan aproximadamente tres días y medio en alcanzar el estadio de blastocisto, y como era de esperar los embriones cultivados en ausencia de citocinas (grupo control) alcanzaron al día 4 de cultivo estadios de blastocistos y en muchos casos se observaron eclosionando o ya habiendo eclosionado. En la figura 4, se evidencia que la incubación de los embriones murino con IL-1β y TNF-α a la concentración más baja (1 y 10 pg/mL) respectivamente, permite un desarrollo embrionario óptimo, mientras que a las concentraciones siguientes se evidencia un arresto y retraso en el desarrollo embrionario. Los embriones incubados con IL-6 a la concentración más baja (50 pg/mL) alcanzaron los estadios de blastocisto, sin embargo en la mayoría de los embriones la calidad fue subóptima, mostrando a las siguientes concentraciones un desarrollo embrionario con importantes defectos morfológicos (predominando la fragmentación). En la tabla 3 y figura 5 puede observarse, que existe una diferencia estadísticamente significativa con respecto al número de blastocistos obtenidos en embriones incubados con IL-1β (P=0,01; P<0,001 y P<0,001), IL-6 (P<0,01; P<0,001 y P<0,001) y TNF-α (P=0,003; P<0,001 y P<0,001). Al comparar el grupo control con aquellos grupos incubados con las citocinas a concentraciones crecientes, se observaron los siguientes índices de blastulación IL-1β (0,77; 0 y 0%), IL-6 (0,69; 0,42 y 0,05%) y TNF-α (0,77; 0,47 y 0%). 41 Control (-) IL-1β [1pg/mL] IL-6 [50 pg/mL] IL-1β [10pg/mL] IL-6 [500 pg/mL] IL-1β [100pg/mL] IL-6 [1000 pg/mL] TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL] Figura 4: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de evaluar el desarrollo embrionario murino alcanzado al 4to día de cultivo en presencia de IL1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (grupo control). La incubación de los embriones con IL-1β y TNF-α a las concentraciones de 10 y 100 pg/mL y 10, 100 y 1000 pg/mL respectivamente, provocaron un aumento significativo en el número de embriones que presentaron bloqueo en el desarrollo (P<0,001 y P<0,001) y defectos morfológicos (P<0,001 y P<0,001), mientras que al referirnos al número de embriones que presentaron retraso en el desarrollo, no se encontró diferencia significativa 42 al comparar con el grupo control en embriones en presencia de IL-1β, sin embargo si se encontró diferencia significativa en las concentraciones de 10 (P<0,007) y 100 (P<0,001) pg/mL en los incubados con TNF-α. La incubación con IL-6 a las concentraciones de 500 y 1000 pg/mL mostró un aumento significativo en el número de embriones que presentaron retraso en el desarrollo (P=0,007) (P<0,001) y defectos morfológicos (P<0,001) (P<0,001) respectivamente; mientras que en cuanto al número de embriones que presentaron arresto en el desarrollo, se encontró diferencia estadísticamente significativa al comparar el grupo control con aquellos incubados con IL-6 a concentraciones crecientes P=0,001; P<0,001 y P<0,001 respectivamente. Tabla 3: Porcentaje de blastocistos obtenido, índice de blastulación, arresto y retraso en el desarrollo y defectos morfológicos en embriones murino cultivados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). 43 Datos analizados por X2 *P<0,05; **P<0,001 % Blastocisto 44 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 * * ** ** ** 0 1 10 ** ** 100 IL-1B [pg/mL] ** 50 500 1000 IL-6 [pg/mL] ** 10 100 1000 TNF-alfa [pg/mL] Figura 5: Porcentaje de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto al ser cultivados en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). Datos analizados por X2 *P<0,05; ** P<0,001. Estos resultados indican que el desarrollo pre-implantacional murino se ve afectado negativamente por la presencia de IL-1-β, IL-6 y TNF-α a las concentraciones consideradas como patológicas, fundamentalmente, causando un arresto significativo en el desarrollo y la presencia de defectos morfológicos, predominando: la asimetría en el tamaño y forma de las blastómeras; la fragmentación y la pérdida de la relación blastómera/embrión respectivamente. 2- Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción intracelular de peróxido de hidrógeno (H2O2): La figura 6, muestra embriones incubados con IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control) luego de realizarles la técnica de DCHFDA, para evaluar la producción intracelular de H2O2, 45 mostrando que la intensidad de la fluorescencia fue directamente proporcional al aumento en las concentraciones de IL-1β, IL-6 y TNF-α. Control (-) IL-1β [1pg/mL] Control (+) IL-6 [50 pg/mL] IL-1β [10pg/mL] IL-1β [100pg/mL] IL-6 [500 pg/mL] IL-6 [1000 pg/mL] TNF- α [10 pg/mL] TNF- α [100 pg/mL] TNF- α [1000pg/mL] Figura 6: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia luego de realizar la prueba para determinar la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de con IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). 46 La tabla 4 presenta la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) en embriones de ratón al ser cultivados por 96 horas en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). Para este ensayo fueron utilizados 10 embriones por condición y la tabla muestra la estimación de la fluorescencia representada por un sistema de cruces (semi-cuantificación) anteriormente mencionado; mostrando como la fluorescencia aumenta a medida que aumenta la concentración de IL-1β, IL-6 y TNF-α. Tabla 4: Semi-cuantificación de la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). Producción de H2O2 semi-cuantitativa (N°, %) Control IL-1β IL-6 TNF-α Condición N° de [pg/mL] embriones 0 + ++ +++ ++++ 0 10 10(100%) - - - - 1 10 - 9(90%) 1(10%) - - 10 10 - - - 10(100%) - 100 10 - - - - 10(100%) 50 10 4(40%) 6(60%) - - - 500 10 1(10%) 9(90%) - - - 1000 10 - 2(20%) 7(70%) 1(10%) - 10 10 5(50%) 5(50%) - - - 100 10 - 10(100%) - - - 1000 10 - - - 1(10%) 9(90%) 47 Estos resultados indican que la incubación con IL-1β, IL-6 y TNF-α induce la producción de H2O2 intracelular en embriones murino al compararlos con el grupo control y que el efecto es dosis dependiente. 3-Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción intracelular de anión superóxido (O2-): La figura 7 muestra embriones incubados con IL-1β, IL-6 y TNF-α a diferentes concentraciones luego de realizarles la técnica de NBT para evaluar la producción intracelular de O2-, mostrando que la coloración violeta característica de la reducción del formazan por el reactivo NBT fue observada solo en el grupo de embriones cultivados en presencia de IL-1β en concentración de 1 pg/mL y en presencia de TNF- α a la concentración de 10 pg/mL, mientras que en los incubados en presencia de IL-6 fue observada en las concentraciones de 50, 500 y 1000 pg/mL, pero sin evidenciar diferencias importantes. La tabla 5 presenta la producción intracelular de O2- (NBT) en embriones de ratón al ser cultivados por 96 horas en presencia de IL-1β, IL-6 y TNF-α en diferentes concentraciones. Para este ensayo fueron utilizados 10 embriones por condición y la tabla muestra la estimación de la coloración violeta representada por un sistema de cruces (semicuantificación) anteriormente mencionado; mostrando como la coloración violeta solo fue evidente en embriones incubados con IL-1β y con TNF-α en las concentraciones más bajas (1 y 10 pg/mL) respectivamente; mientras que en los incubados con IL-6 en todas las concentraciones (50, 500 y 1000 pg/mL). 48 IL-1β [1pg/mL] Control (-) IL-6 [50 pg/mL] IL-1β [10pg/mL] IL-6 [500 pg/mL] IL-1β [100pg/mL] IL-6 [1000 pg/mL] TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL] Figura 7: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de realizar la prueba para determinar la producción intracelular O2- (NBT) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). 49 Tabla 5: Semi-cuantificación de la producción intracelular de O2- (NBT) durante el desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). Producción de O2- semi-cuantitativa (N°, %) Control IL-1β IL-6 TNF-α Condición N° de [pg/mL] embriones 0 + ++ +++ ++++ 0 10 10(100%) - - - - 1 10 - 10(100%) - - - 10 10 10(100%) - - - - 100 10 10(100%) - - - - 50 10 4(40%) 6(60%) - - - 500 10 1(10%) 9(90%) - - - 1000 10 - 2(20%) 7(70%) 1(10%) - 10 10 - - 10(100%) - - 100 10 10(100%) - - - - 1000 10 10(100%) - - - - 4- Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción y liberación de óxido nítrico por embriones murino al medio de cultivo: En orden de examinar el efecto de la IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción y liberación de óxido nítrico al medio de cultivo por los embriones, evaluamos los niveles de óxido nítrico tanto en el medio donde fueron cultivados los embriones del grupo control como en el medio donde fueron cultivados los embriones expuestos a IL-1β, IL-6 y TNF-α durante 96 horas. La tabla 6 y figura 8 muestran el efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la producción y liberación al medio 50 de cultivo de óxido nítrico por los embriones murino, mostrando que no hay diferencia estadísticamente significativa entre el grupo control y los embriones cultivados en presencia de IL-1β, IL-6 y TNF-α; sin embargo en la figura 8 se evidencia una tendencia que indica un aumento en las concentraciones de óxido nítrico que se correlaciona con el aumento en las concentraciones de TNF-α. Tabla 6: Efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la producción y liberación de óxido nítrico al medio de cultivo por embriones de ratón. Control IL-1β IL-6 TNF-α Condición Concentración de óxido nítrico IL [pg/mL] X +/- DS 0 5846,0 +/- 2220 1 5562,2 +/- 4009 0,9055 10 5392,7 +/- 1110 0,7275 100 5460,7 +/- 715 0,75524 50 9245,7 +/- 1869 0,0576 500 5997,0 +/- 1189 0,9085 1000 7090,5 +/- 1630 0,4011 10 3324,2 +/- 880 0,0792 100 6752,2 +/-2961 0,6417 1000 10084,2 +/- 3834 0,1043 P Datos analizados por el Test de Student’n Estos resultados indican que la incubación con IL-1β e IL-6 no induce mayor síntesis de óxido nítrico en embriones cultivado in vitro al ser comparados con el grupo control, mientras que TNF-α si pareciera tener un efecto inductor, ya que al realizarse un estudio de correlación entre la concentración de ON y la concentración de TNF-α se obtuvo una correlación de 0,82, la cual es estadísticamente significativa. 51 Concentración ON 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 1 10 100 IL-1B [pg/mL] 50 500 1000 10 100 1000 IL-6 [pg/mL] TNF-alfa [pg/mL] Figura 8: Concentraciones promedio de óxido nítrico liberadas al medio de cultivo por embriones de ratón cultivados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (grupo control). 5-Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la apoptosis (TUNEL): Con la finalidad de evaluar el efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la apoptosis en embriones murino estudiamos la apoptosis en los embriones expuestos a IL-1β, IL-6 y TNF-α en las distintas concentraciones durante el cultivo de 72 horas y en los embriones cultivados en condición control. Las células o blastómeras del embrión fueron consideradas como TUNEL-positivo cuando presentaron un patrón de marcaje verde fluorescente brillante. 52 Control (-) Control (+) IL-1β [1pg/mL] IL-6 [50 pg/mL] IL-1β [10pg/mL] IL-6 [500 pg/mL] IL-1β [100pg/mL] IL-6 [1000 pg/mL] TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL] Figura 9: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia luego de realizar la técnica para evaluar apoptosis (TUNEL) durante el desarrollo embrionario murino en presencia IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). La figura 9 muestra imágenes de embriones incubados con la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) luego de realizarles la técnica de TUNEL para evaluar la apoptosis, mostrando que en todas las concentraciones estudiadas los embriones presentaron fluorescencia y que la intensidad de la fluorescencia 53 fue directamente proporcional al aumento en las concentraciones de la IL-1β y TNF- α, mientras que en embriones incubados con IL-6 no se observó este efecto dosis dependiente. Estos resultados indican que la IL-1β, IL-6 y TNF-α inducen apoptosis en las células embrionarias, lo cual no ocurre en los embriones control negativo. El estímulo que ejerce la IL-1β y el TNF- α parece ser dosis dependiente, ya que aumenta con la concentración de la IL, lo cual no ocurre con en la incubación con IL-6. 54 X- DISCUSIÓN En condiciones in vivo, la fecundación ocurre en el ser humano en la región ampularístmica de las trompas de Falopio bajo el ambiente del fluido peritoneal; durante los primeros 3 a 4 días de desarrollo, el embrión es trasportado a través de la trompa u oviducto hasta que aproximadamente al día 5 post-fecundación entra en la cavidad endometrial cuando se encuentra en estadio de mórula o blastocisto para la posterior implantación (Thaler y col, 2003). Durante su trayectoria por la trompa, el embrión sufre divisiones celulares, diferenciación y apoptosis y es dependiente de las secreciones luminales tanto del oviducto como del útero para su nutrición. Los componentes del fluido peritoneal tanto celulares como acelulares son dinámicos y están en constante interacción, siendo influenciados tanto por eventos fisiológicos del ciclo menstrual como por procesos patológicos, como la enfermedad inflamatoria pélvica (Bedaiwy y col, 2007), por lo que diversos estudios han sido enfocados en la determinación de los componentes del fluido peritoneal tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Se ha demostrado la presencia de diversos factores de crecimiento y citocinas en el fluido peritoneal de mujeres sin patología pélvica (Buyalos y col, 1992; Taketami y col, 1992; Podgaec y col, 2007; Bedaiwy y col, 2001), así como la expresión de sus respectivos receptores en embriones pre-implantación, lo que sugiere una comunicación bidireccional de tipo química entre el embrión y el endometrio materno, fundamental para el desarrollo embrionario (Hardy y Spanos, 2002). Adicionalmente se ha demostrado que la expresión de estos factores de crecimiento y citocinas como de sus receptores son estadio-específico durante el desarrollo embrionario pre-implantación. 55 Procesos inflamatorios como la endometriosis, las infecciones y el hidrosalpinx pueden activar una respuesta inmune local a nivel de la trompa provocando la liberación de citocinas pro-inflamatorias (Díaz-Cueto y col, 2001; Fabián y col, 2004; Glabouski y col, 2005), lo que ha sido demostrado en el fluido peritoneal y tubárico de mujeres con procesos inflamatorios en quienes se ha demostrado la presencia de concentraciones elevadas de IL-1β (Taketami y col, 1992; Sokolov y col, 2005); IL-6 (Buyalos y col, 1992; Sokolov y col, 2005) y TNF-α (Taketami y col, 1992; Bedaiwy y col, 2001). Considerando que las citocinas son necesarias para la ovulación, fertilización y desarrollo embrionario temprano no es difícil suponer que procesos inflamatorios puedan alterar las concentraciones de las mismas y se correlacionen con la infertilidad (Vissiliadis y col, 2005). Debido a lo anteriormente mencionado planteamos cultivar embriones de ratón en estadio de pre-implantación en condiciones que asemejen un ambiente inflamatorio, caracterizado por la presencia de niveles elevados de IL-1, IL-6 y TNF- en el medio de cultivo, para evaluar el efecto de estas citocinas sobre el desarrollo embrionario, la producción de ROS y potencial daño al ADN. Es importante destacar que utilizamos citocinas humanas como ligando y los receptores de embriones murino. Se ha descrito una alta homología estructural entre las citocinas empleadas en este estudio y las de murino, así para IL-1β la homología es de76.6%, IL-6 de 77.0% y TNF-α de 82.1% según los datos reportados por UniGene, NCBL. Por otra parte se ha indicado una alta homología estructural inter-especie entre IL-1 y TNF-. Adicionalmente un estudio reportó una elevada interacción entre TNF- humano con receptores de ratón, tanto para TNF-R1 y TNF-R2 (Bossen y col. 2006). Como se indicó en la introducción la incubación de embriones de ratón con fluido peritoneal o de hidrosalpix de mujeres con endometriosis y otras enfermedades 56 inflamatorias pélvicas provoca embriotoxicicidad en embriones murino, lo que podría explicarse por la alta homología que existe entre las citocinas humanas y de ratón. Para llevar a cabo esta investigación se utilizó un intervalo de concentración de las diferentes citocinas tomando en cuenta diversas publicaciones que hacen referencia a los valores determinados tanto en condiciones fisiológicas como inflamatorias (patológicas). Las concentraciones seleccionadas para cada citocina fueron las siguientes: IL-1: 1, 10,100 pg/ml; IL-6: 50, 500, 1000 pg/ml y TNF-: 10, 100, 1000 pg/ml. En condiciones in vitro solo algunos embriones se desarrollan con buena calidad, mientras que un porcentaje muestran morfología anormal debido a una inadecuada división e incremento de la fragmentación celular (Goyanes y col, 1990), sin embargo se ha sugerido que el desarrollo inadecuado de los embriones in vitro podría deberse a condiciones inapropiadas de cultivo (Yang y col, 1998). Antes de entrar en discusión sobre los resultados de nuestro estudio hay que destacar que nuestro trabajo fue llevado a cabo bajo condiciones de cultivo óptimas, las cuales son fundamentales para el desarrollo embrionario pre-implantación, ya que es conocido que los embriones in vitro tienen un desarrollo deficiente al ser comparados con aquellos desarrollados in vivo. Los medios de cultivo óptimos deben basarse en el patrón básico de los requisitos nutricionales del embrión, así como imitar con la mayor fidelidad el entorno fisiológico del embrión durante su recorrido por el tracto reproductor femenino. Entre los requerimientos básicos del embrión y por lo tanto los componentes básicos de un medio de cultivo adecuado, se encuentran, altas concentraciones de piruvato y lactato y bajas de glucosa durante las primeras divisiones celulares y después de alcanzar las 6-8 blastómeras, bajas concentraciones de piruvato y lactato y mayores de glucosa, adicionalmente el medio debe tener aminoácidos que varían según el estadio embrionario, sales minerales, enzimas, vitaminas, EDTA, albúmina sérica, también son fundamentales 57 aspectos del sistema como, la pureza del agua, la fase de gas, volumen de incubación, temperatura, entre otros. Las condiciones de cultivo sub-óptimas han sido señaladas como un factor determinante en dos fenómenos presentes en el cultivo de embriones: el bloqueo o arresto en el desarrollo y la fragmentación (Devreker y col, 1999; Lawitts y col, 1991). Adicionalmente, el bloqueo en el desarrollo ha sido relacionado con factores como: fracaso en la activación del genoma embrionario, desbalance en la concentración de ciertos constituyentes de medios de cultivo (Lawitts y col, 1991), concentraciones de glucosa inadecuadas en cultivo (Leppens y col, 1997; Sakkas y col, 1993), concentraciones elevadas de oxígeno (Yang y col, 1998) y niveles elevados de ROS (Favetta y col, 2007), entre otros. Dado que las condiciones en nuestro estudio fueron óptimas, como lo demuestran los resultados del grupo control, podemos asegurar que los resultados observados bajo las diferentes condiciones experimentales fueron debido al efecto de las citocinas. La calidad embrionaria puede evaluarse por diferentes indicadores. Entre ellos están el índice de blastulación, el arresto y el retraso en el desarrollo y la fragmentación de las blastómeras. Se ha planteado que la fragmentación podría actuar como un mecanismo de defensa del embrión para librarse de componentes citoplasmáticos dañinos o para mantener cierta relación núcleo/citoplasma y se considera que la presencia de fragmentos podría tener un efecto pernicioso por el secuestro de proteínas reguladoras al interferir entre las blastómeras comprometiendo el proceso de compactación (Jurisicova y col, 2004). Es conocido que los embriones fragmentados típicamente contienen blastómeras de diferentes tamaños, con fragmentos celulares que parecen mantener la integridad de la membrana. El promedio del tamaño de las blastómeras en embriones fragmentados esta significativamente reducido por el grado de fragmentación conllevando a una disminución del contenido celular y teniendo así un efecto perjudicial sobre la futura masa del embrión (Jurisicova y col, 2004). 58 Se ha demostrado que el arresto embrionario temprano es disparado por la expresión de genes asociados con elevados niveles de estrés oxidativo, encontrando una relación entre niveles elevados de estrés oxidativo con una incidencia incrementada de arresto embrionario temprano y la sobre regulación de la molécula adaptadora de estrés p66 (Favetta y col, 2007). Los resultados de nuestro estudio demostraron que las citocinas pro-inflamatorias: IL-1β, IL-6 y TNF- ejercen un efecto deletéreo sobre el desarrollo embrionario murino preimplantación cuando son adicionadas al cultivo en concentraciones consideradas como patológicas. Sin embargo, en la primera concentración considerada como patológica (la mas cercana a la fisiológica), el efecto no es tan evidente, lográndose la obtención de blastocistos de calidad óptima (excepto en los embriones expuestos a IL-6, los cuales alcanzaron el estadio de blastocisto pero con una calidad subóptima). A medida que aumentan las concentraciones de las citocinas en cultivo disminuye proporcionalmente el porcentaje de obtención de blastocistos y aumentan tanto el retraso y el arresto en el desarrollo como los defectos morfológicos, predominando por la incubación con IL-1: la asimetría en el tamaño y forma de las blastómeras; por la incubación con IL6: la fragmentación y el deterioro de la zona pelúcida y por la incubación con TNF-: la pérdida de la relación del tamaño entre blastómera/embrión. Estudios en roedores y otras especies sugieren que citocinas y factores de crecimiento regulan la formación de blastocistos y el porcentaje de desarrollo de embriones preimplantación (Hardy y Spanos, 2002). Adicionalmente, se conoce que los embriones preimplantación expresan receptores para diferentes factores de crecimiento y citocinas durante su desarrollo, así la adición de estos factores podría afectar el desarrollo de los mismos (Hardy y Spanos, 2002). Las citocinas ejercen sus funciones a través de la unión a receptores específicos comunes o independientes presentes en las membranas celulares de las células blanco o en ocasiones el receptor es liberado y se encuentra disuelto en el contenido extracelular (forma soluble). 59 Se ha descrito que existen dos tipos de receptores para TNF-α, el TNF-R1 y TNF-R2. El TNF-R1 tiene un dominio intra-citoplasmático del receptor conocido como dominio de la muerte, mientras que el TNF-R2 carece de este dominio. La activación de TNF-R1 por TNF conduce al reclutamiento del dominio de la muerte y la activación de la cascada de cisteína proteasas llamadas caspasas llevando a la inducción de la apoptosis (Kawamura y col, 2007). Kawamura y col (2007) describen que en embriones de ratón pre-implantación en los estadios de dos y cuatro células se expresa el receptor TNF-R1 y esta expresión aumenta en los estadios de blastocisto y blastocisto expandido, sin embargo no se expresa el receptor TNR-F2. Estos resultados indican que el efecto del TNF-α observado en nuestro trabajo debe ser mediado por el receptor TNF-R1, el cual activa la ruta de la apoptosis. En cuanto a los receptores de IL-1 e IL-6 Hardy y Spanos (2002) indican que se expresan en el embrión en los estadios de una, dos y 8 células, no se detectan en estadio de mórula y se vuelven a detectar en estadio de blastocisto (Hardy y Spanos, 2002). En el presente trabajo se evaluó el efecto de las citocinas sobre la producción de especies reactivas al oxígeno y de oxido nítrico. Los ROS son los productos formados durante los pasos intermediarios de la reducción del oxígeno: el radical anión superóxido (O2-), el radical peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH·), correspondientes a los pasos de la reducción por uno, dos y tres electrones respectivamente (Guerin y col, 2001). Los ROS son producidos por el metabolismo normal embrionario por diversas rutas metabólicas y enzimáticas, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS), NADPH oxidasa y xantina oxidasa, así como por el medio que lo rodea. El anión superóxido y el radical hidroxilo son los dos principales ROS generados por los embriones con el H2O2 como un intermediario (Guerin y col, 2001). La cantidad de ROS producida por los embriones varia con el estadio de desarrollo (Nasr-Esfahani y col, 1991) e incrementa cuando son producidos in vitro comparado con los derivados in vivo (Favetta y col, 2007; Tranguch y col, 2003). 60 El efecto deletéreo que hemos evidenciado de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF- sobre el desarrollo embrionario podría ser explicado por los hallazgos encontrados en otros tejidos que demuestran que ciertas citocinas pueden inducir la producción de ROS en diversas células (Volk y col, 2000; Sugino y col, 2002): por ejemplo, se ha demostrado que IL-1 y TNF- pueden inducir la producción de ROS por las células endoteliales conllevando a peroxidación lipídica y daño al ADN (Volk y col, 2000). IL-1 e IL-6 favorecen la acumulación de peróxido de hidrógeno en la mitocondria y su posterior deterioro (MathyHartert y col, 2008). Adicionalmente trabajos en embriones indican que TNF- puede inhibir el desarrollo de embriones por activar mecanismos de apoptosis (Kawamura y col, 2007). En bovino la adición al cultivo de TNF-α afecta negativamente el desarrollo embrionario y disminuye el porcentaje de obtención de blastocisto lo que indica que en esta especie también podría expresarse tempranamente los receptores para TNF-α (Soto y col, 2003). En nuestra investigación evaluamos si la incubación de embriones de ratón con citocinas pro-inflamatorias podría inducir la producción intracelular de peróxido de hidrógeno por los embriones murino, encontrando que efectivamente, las citocinas en estudio: IL-1β, IL-6 y TNF-α en las concentraciones consideradas como patológicas inducen la producen H2O2 de una forma dosis dependiente, observándose un efecto menos notorio en los embriones incubados con la IL-6. El aumento en la producción de H2O2 en los embriones por la incubación con las citocinas pro-inflamatorias (efecto dosis dependiente) se correlaciona con los resultados observados en el desarrollo embrionario (que se ve afectado negativamente en las concentraciones consideradas como patológicas, también con un efecto dosis dependiente), lo que nos podría llevar a sugerir, que en concentraciones patológicas de citocinas pro-inflamatorias, el aumento de las concentraciones de H2O2 podría estar afectando negativamente el desarrollo de los embriones en cultivo. 61 Adicionalmente, se ha demostrado que IL-1 e IL-6 disminuyen las defensas antioxidantes en el citocromo provocando acumulación de peróxido de hidrógeno en la mitocondria y su posterior deterioro (Mathy-Hartert et al, 2008). Otras investigaciones apoyan nuestros resultados y el hecho de que altas concentraciones de ROS pudieran afectar el desarrollo embrionario pre-implantación, reportando que la presencia de un desarrollo retrasado (menos de 7 células al día tres de cultivo), la alta fragmentación (mas del 10%) y la formación reducida de blastocistos con características normales están asociados con niveles de ROS incrementados al día 1 de cultivo (Bedaiwy y col, 2004). Adicionalmente evaluamos si la incubación de embriones de ratón con citocinas proinflamatorias podría inducir la producción intracelular de anión superóxido por los embriones murino, encontrando que en los embriones incubados con IL-1β y TNF-α hubo producción intracelular de este radical libre solo en la concentración mas baja considerada como patológica, es decir, aquella cercana a la considerada como fisiológica y donde encontramos que el desarrollo embrionario fue óptimo, alcanzando estadios de blastocistos con una buena calidad, mientras que en las concentraciones superiores de ambas citocinas (donde el desarrollo embrionario fue drásticamente afectado negativamente) no evidenciamos la producción intracelular del anión superóxido como era de esperarse. Li y col (2009), en un estudio reciente proponen un mecanismo por el cual IL-1β podría generar ROS, indicando que la estimulación de esta citocina induce la endocitosis de IL-1 R1 dependiente de MYD88 y conlleva al reclutamiento de NOX2 (una oxidasa NADPH fagocítica) en el compartimiento endosomal de forma dependiente de Rac1 (una GTPasa fundamental en la producción de (O·) por oxidasas NADPH). Así el (O·) producido en el compartimiento endosomal se dismuta espontáneamente hasta H2O2 para difundir fuera del endosoma. Este estrés oxidativo local es el que dispara la activación de IKK y NF-kB (Li y col, 2009). 62 Adicionalmente se ha propuesto que la estimulación de TNF-α en células deficientes de NF-kB induce la producción de ROS causando la inactivación de las MKPs (fosfatasas cinasas MAP), lo que conduce a la activación sostenida de la vía JNK y a la apoptosis; sin embargo en células con presencia de NF-kB se induce la eliminación de ROS por la codificación de genes para enzimas antioxidantes, lo que inhibe la activación de la vía JNK y favorece la supervivencia celular (Gloire y col, 2006). En los embriones incubados con IL-6 el patrón de producción del anión superóxido fue totalmente diferente al que mostraron los embriones incubados tanto con IL-1β como con TNF-α. En los embriones incubados con IL-6 se evidenció la producción intracelular del anión superóxido en todas las concentraciones consideradas como patológicas, sin encontrarse alguna diferencia importante entre las concentraciones estudiadas. Nos parece importante destacar que el desarrollo embrionario se vió afectado negativamente por la incubación con la IL-6, pero que sin embargo, hasta a la mayor concentración considerada como patológica se logró la obtención de blastocistos, aunque se observaron altos porcentajes de fragmentación, lo que podría indicar un efecto menos embriotóxico sobre el desarrollo embrionario, o por lo menos en las concentraciones estudiadas. Por otro lado, el oxido nítrico (ON) ha sido identificado como una molécula mensajera de difusión rápida que esta involucrada en algunos procesos fisiológicos y su síntesis a partir de L-arginina es catalizada por la oxido nítrico sintasa (NOS) en tejidos mamíferos. La NOS y el ON tienen importantes funciones en la reproducción: el ON regula la secreción de las hormonas sexuales, los embriones murino pre-implantación producen ON y el desarrollo normal de embriones es inhibido con inhibidores de (NOS) (Cao y col, 2007). Dado que el ON es también un radical libre hemos determinado las concentraciones de ON en el medio de cultivo donde fueron incubados los embriones con las citocinas proinflamatorias en concentraciones patológicas, sin encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de los grupos estudiados y el grupo control. Sin embargo, en el medio de cultivo donde fueron incubados los embriones con TNF-α encontramos un 63 aumento en las concentraciones de ON que se correlacionó con el aumento en las concentraciones de TNF-α, que aunque no fue significativo, al comparar en promedio con el grupo control, si demostró una correlación positiva (0,82) al relacionar la dosis de TNF-α con la concentración de ON, lo que nos permite inferir que esta citocina induce en el embrión la producción intracelular de ON. Adicionalmente, Gouge y col, 1998 también demostraron la producción de ON en embriones de ratón pre-implantación, determinando los metabolitos del ON como nitrato y nitrito en el medio de cultivo de los embriones por la reacción de Greiss (Gouge y col, 1998), como lo hicimos nosotros. Sin embargo, Athanassakis y col. (2000) no lograron detectar la producción de ON en medio de cultivo de embriones por la reacción de Greiss en el desarrollo normal, no obstante, cuando se aplicaba un estimulo tóxico al embrión, con INF-γ, TNF-α y lipopolisacárido lograron detectar una inducción significativa de ON por los embriones a una concentración detectada por la reacción de Greiss. Sería importante en futuros estudios repetir los ensayos realizados en presencia de los anticuerpos para cada una de las citocinas evaluadas, para comprobar que el incremento de los ROS sea debido a las mismas. Por otra parte se podrían realizar ensayos empleando enzimas antioxidantes, como por ejemplo la superoxido dismutasa, para evaluar si el efecto observado en el desarrollo embrionario es mediado por la liberación de ROS. Para complementar los datos aportados por los ensayos de ROS y poder explicar la acción de estas moléculas sobre el embrión, realizamos la técnica de TUNEL para evidenciar la posible presencia de apoptosis en los embriones incubados con las citocinas evaluadas en las concentraciones consideradas como patológicas, encontrando que todos los embriones sometidos a la incubación con las citocinas en estudio fueron apoptosis positivo. En la mayoría de estudios donde han aplicado ensayos de apoptosis por TUNEL marcan las células y posteriormente los núcleos fragmentados, nosotros no marcamos las células, sino que evaluamos directamente las blastómeras con fragmentación de ADN, como lo hicieron Yang y col, 1998. 64 Cabe destacar que la IL-1β y el TNF-α ejercieron un efecto dosis dependiente en la apoptosis observada en los embriones, a diferencia de la IL-6. Encontramos una correlación en nuestros datos con respecto a la producción de H2O2 y la presencia de apoptosis en los embriones expuestos a las citocinas en concentraciones patológicas (efecto también observado de forma dosis dependiente, exceptuando en los embriones incubados con IL-6). Yang y col (1998), encontraron una relación directa entre las concentraciones elevadas de H2O2 y un número elevado de embriones fragmentados, sugiriendo que los ROS podrían también inducir apoptosis en los embriones, sin embargo, encontraron apoptosis solo en embriones fragmentados, sugiriendo que los embriones humanos tempranos desarrollados en altas condiciones de oxígeno in vitro sufren fragmentación citoplasmática debido a la elevación de H2O2 y eventualmente sufren apoptosis (Yang y col, 1998). Sin embargo, en nuestra investigación, evidenciamos apoptosis en todos los embriones sometidos a la incubación con las citocinas pro-inflamatorias estudiadas (en concentraciones consideradas como patológicas), tanto en los fragmentados como en los no fragmentados, pero por supuesto, nuestros embriones habían sido sometidos a una incubación previa con citocinas por 72 horas, lo cual indujo el aumento en la producción de H2O2 que podría haber conducido a la posterior apoptosis. Cabe destacar que en los embriones expuestos a IL-6, la fragmentación fue altamente encontrada y en ellos la producción de H2O2 fue menos evidente que en los embriones expuestos a las otras citocinas, adicionalmente en los embriones incubados con IL-6 la apoptosis fue observada pero no de una forma dosis dependiente, esto nos hace asumir que esta citocina actúa en los embriones murino pre-implantación por una vía y de una manera distinta que la IL-1β y el TNF-α, los cuales si mantienen un patrón de comportamiento bastante similar. Se ha reportado que la respuesta de la célula contra el estrés oxidativo puede diferir dependiendo de la intensidad del estrés y de su duración y esta respuesta varía desde la estimulación de la proliferación celular al arresto o la muerte celular por apoptosis o necrosis (Karja y col, 2006). 65 Nuestros resultados indican que el TNF-α podría tener un efecto inductor sobre el embrión en la producción intracelular y liberación al medio de cultivo de ON que podría también activar vías de señalización conducentes a la muerte celular programada, ya que el ON es también un radical libre y un importante bio-regulador de apoptosis (Chung y col, 2001). Algunos estudios indican que las altas concentraciones de ON podrían ser uno de los factores que inducen la apoptosis en embriones y retarda el desarrollo embrionario bajo condiciones de microgravedad simulada (Cao y col, 2007). Es importante destacar que evidenciamos apoptosis en embriones desde estadios de 2 células hasta el estadio de blastocisto, mientras que en otros estudios han demostrado la presencia de apoptosis solo en embriones en estadios avanzados del desarrollo embrionario, mórula o blastocisto. Algunos estudios han evidenciado que embriones tempranos arrestados (hasta 6 células) no muestran cambios bioquímicos o morfológicos de apoptosis o características que concuerden con la ruta apoptótica (Favetta y col, 2007), mientras que otro estudio ha evidenciado cariólisis detectada por TUNEL en embriones murino en estadio temprano luego de una incubación de 96 horas con TNF-α (Byrne y col, 2002). Las divergencias en los resultados podrían deberse a diferencias en la especie o cepas utilizadas, así como a las condiciones de cultivo, fuente de TNF-α o al sistema de evaluación de muerte celular (Fabian y col, 2006). Lo que si esta claro parece ser que ovocitos y embriones en proceso de división celular poseen todos los componentes de la maquinaria apoptótica, tanto los miembros de la familia Bcl-2 como las caspasas (Gjorret y col, 2007). A nivel molecular se ha demostrado que el TNF-α es el principal efector en la respuesta inflamatoria y que como las otras citocinas pro-inflamatorias al unirse a su receptor específico de membrana puede activar diversas vías de señalización celular para regular componentes de la inflamación e invasión, entre estas vías se encuentran: MEK, p38 y NFkB (Grund y col, 2008). 66 Así como recientemente se ha identificado la proteína p66Shc, que es una proteína proveniente de la familia Shc que responde a señales de trasducción mitogénicas y apoptóticas. La p66Shc es considerada un punto de integración en algunas rutas de señalización que afectan la función mitocondrial y debido a que genera H2O2 mitocondrial y dispara la apoptosis se ha considerado fundamental en la regulación de la ruta de señalización en la disfunción celular mediada por ROS (Betts y col, 2008). Basándonos en la ruta de señalización de la p66Shc propuesta por Betts y col, 2008, proponemos que, las citocinas pro-inflamatorias al estar elevadas en los procesos inflamatorios y al unirse a sus receptores específicos de membrana podrían activar mecanismos que conlleven a la activación de varias cinasas que posteriormente podrían activar la p66Sch (por la fosforilación de la serina 36), llevándola al espacio intermembrana mitocondrial donde interactúa con el citocromo c reducido para producir H2O2 y abrir los poros de permeabilidad de transición, lo cual lleva a la generación y liberación de ROS dentro del citosol. La producción intracelular de ROS mediada por p66Sch puede conducir a arresto en los embriones cuando las concentraciones de ROS son moderadas o inducir apoptosis si las concentraciones de ROS son elevadas (Betts y col, 2008). En resumen los resultados del presente estudio indican que la incubación de embriones de dos células con TNF-α provoca una disminución en el índice de blastulación, un incremento en el arresto en el desarrollo, llegando al 100% en la concentración de 1000 pg/ml. Adicionalmente las concentraciones de 100 y 1000 pg/mL causaron un incremento de la producción de H2O2, pero pocas modificaciones en la producción de radical superoxido (O·). Adicionalmente se observó una correlación estadísticamente significativa entre el aumento en la concentración de TNF-α y niveles de oxido nítrico en el medio de cultivo. Por su parte la incubación de los embriones con IL-1 arroja resultados muy similares a los TNF-α en cuanto a la disminución de los índices de blastulación, producción de peróxido de hidrógeno y anión superóxido. Todos estos hallazgos parecen indicar que la ruta por la 67 cual actúan estas dos citocinas puede ser muy similar, desencadenando en ambos casos las rutas apoptóticas. Por su parte la IL-6 también estimula la producción de peróxido de hidrógeno y además de anión superóxido, conllevando también a la apoptosis, sin embargo el efecto de la IL-6 sobre la disminución en el índice de blastulación es menor, lográndose un porcentaje mayor de blastocistos que con las otras citocinas, aunque los blastocistos presentan una alta fragmentación. Estos resultados parecen indicar que el efecto perjudicial las citocinas sobre el desarrollo embrionario es mediado por ROS y generación de apoptosis. En conclusión podemos decir que las citocinas pro-inflamatorias estudiadas: IL-1β, IL-6 y TNF-α, en concentraciones que asemejan los procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino, afectan negativamente el desarrollo embrionario pre-implantación murino. La IL-1β y el TNF-α estimulan en embriones pre-implantación murino la producción de especies reactivas de oxígeno como H2O2 comprometiendo la integridad y las funciones del embrión conduciendo a la apoptosis del mismo. Sin embargo, estos resultados deben ser tomados con precaución debido a que in vivo hay mas de una citocina y factores de crecimiento presentes en el tracto reproductor y es muy difícil determinar cual de ellas podría ser responsable de un efecto u otro, particularmente si consideramos que algunas citocinas pueden tener una acción inhibitoria o sinérgica sobre otras citocinas. Además en condiciones in vivo el organismo cuenta con mecanismos enzimáticos y no enzimáticos para defenderse de los radicales libres, lo que podría modificar los resultados encontrados en este estudio. Por lo tanto, nuestras conclusiones se limitan a describir el efecto de una citocina en particular, cuando se ha evaluado individualmente. Adicionalmente, es importante tener claro que no existe un modelo experimental capaz de simular todo lo ocurrido in vivo en cuanto a los mecanismos de supervivencia del embrión, ya que la interacción entre los factores de crecimiento es muy compleja y podría ser influenciada tanto por ciertos estadios de desarrollo como por mecanismos hormonales. 68 XI-CONCLUSIONES ♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α afectan adversamente el desarrollo embrionario murino preimplantación de forma dosis dependiente. ♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α poseen la capacidad de inducir la producción intracelular de peróxido de hidrógeno en embriones de ratón de forma dosis dependiente. ♦ La IL-1β y TNF-α poseen la capacidad de estimular la producción intracelular del anión superóxido en embriones de ratón en concentraciones de 1 y 10 pg/mL respectivamente. ♦ La IL-6 es capaz de provocar la producción intracelular del anión superóxido en embriones de ratón en todas las concentraciones consideradas como patológicas. ♦ La IL-1β e IL-6 no estimulan la producción de óxido nítrico en los embriones murino preimplantación. ♦ El TNF-α es capaz de inducir la producción de óxido nítrico en embriones de ratón en cultivo. ♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α en las concentraciones consideradas como patológicas inducen la apoptosis en los embriones de ratón en cultivo y de ellas solo la IL-6 no lo hace de manera dosis dependiente. ♦ Estos resultados parecen indicar que el efecto perjudicial que ejercen las citocinas sobre el desarrollo embrionario es mediado por ROS y generación de apoptosis. 69 XII- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS -Adamson, GM and Billings, RE. Cytokine toxicity and induction of NO synthase activity in cultured mouse hepatocytes. Toxicol Appl. Pharmacol. 1993: 119:100-7. -Agarwal, A., Gupta, S., and Sharma, R. Role of oxidative stress in female reproduction. Reproductive Biology and Endocrinology 2005 3: 1-49. -Agarwal, A., Ramadan, A., Saleh, A., and Bedaiwy T. Role of reactive species in the pathophysiology of human reproduction. Fertility and Sterility 2003 4: 829-843. -Alikani, M., Calderon, G., Tomkin, G., Garrisi, J., Kokot, M., and Cohen, J. (2000). Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolongad culture-in vitro. European Society of Human Reproduction and Embryology. 2634-2643. -Athanassakis, I., Aifantis, I., Baritakis, S., Farmakiotis, V., Koumantakis, E., Vassiliadis, S. Nitric oxide production by pre-implantation embryos in response to embryotoxic factors. Cell. Physiol. Biochem. 2000 10: 169-76. -Barmat, L., Nasti, K. Are cytokines/grow factors responsible for the detrimental effects of hydrosalpingeal fluid on in vitro fertilization-embryo transfer pregnancy rates. Fertility and Sterility 1999 72: 1110-1112. -Bedaiwy, M., Falcone, T., Goldberg, J., Attaran, M., Sharma, R., Miller, K., Nelson, D., Agarwal, A. Relationship between cytokines and the embryotoxicity of hidrosalpingeal fluid. Journal Assisten Reproduction Genetits 2005 22: 161-165. 70 -Bedaiwy, T., Falcone, J., Goldberg, M., Attaran, R., and Sharman, D. Local cytokine production and reactive species in the peritoneal fluid of endometriosis patients: prospective controlled study. Fertility and Sterility 2001 174: 65. -Bedaiwy, M; El-Nashar, S; Sharma, R and Falcone, T. Effect of ovarian involvement on peritoneal fluid cytokine concentrations in endometriosis patients. Reproductive BioMedicine Online. 2007 14: 620-625. -Ben-Shlomo, I., Kokia, E., Jackson, M., Tayne, DW. Interleu 1 beta stimulates nitrite production in the rat ovary: evidence for heterilogous cell-cell interaction and insulinmediated regulation of the inducible isoform of nitric oxide synthasa. Biology of Reproduction 1994 51: 310-318. -Ben-Yosef, D., Amit, A., Azem, F., Schaurtz, T., Cohen, T., Mei-Raz, N., Carmon, A., Lessing, J., and Yaron,Y. (2004). Prospective Randomized Comparison of two embryo culture systems: P1 medium by Irvine Scientific and the Cook IVF medium. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 21 291-295. -Betts, D and Madan, P. Permanent embryo arrest: molecular and cellular concepts. Molecular Human reproduction. 2008 14: 445-453. -Bos-Mikich, A., Mattos, AC and Ferrari, AN. Early cleavage of human embryos: an effective method for predicting successful IVF/ICSI outcome. Hum. Reprod. 2001 16:2658-61. -Bossen, C., Ingold, K., Tardivel, J., Gaide, O., Hertig, S., Ambrose, C., Tschopp, J and Schneider, P. Interactions of Tumor Necrosis Factor (TNF) and TNF Receptor Family Members in the Mouse and Human. The Journal of Biological Chemistry. 2006 281:1396413971. 71 -Braun, D.P., Gebel, H., House, R., Rana, N. and Dmowski, W.P. Spontaneous and induced synthesis of cytokines by peripheral blood monocytes in patients with endometriosis. Fertility and Sterility. 1996 65: 1125-1129. -Buyalos, R.P., Funari, V.A., Azziz, R., Watson, J.M. and Martinez-Maza, O. Elevated interleukin-6 levels in peritoneal fluid of patients with pelvic pathology. Fertility and Sterility. 1992 58:302-306. -Byrne, AT., Southgate, J., Brison, DR and Leese, HJ. Effects of insulin-like grouth factors I and II on tumor-necrosis-factor-alpha-induced apoptosis in early murine embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2002 14: 79-83. -Cao, Y; Fan, X; Shen, Z; Ma, B and Duan, E. Nitric oxide affects preimplantation embryonic development in a rotating wall Wessel bioreactor simulating microgravity. Cell Biology International. 2007 31: 24-29. -Carmona Fabio. Patogenesis de la enfermedad pelvica inflamatoria. Modelo animal con la biovariedad murina de Chlamydia trachomatis. Colombia Medica 1998 29: 62-73. -Carrasca, I., Cebral, E., Benitez, R., Lopez, P., Vantnian, D. Hydrosalpinx fluid effect on the murine embryonic development in a coculture system with epithelial endometrial cells. Fertility and Sterility 2000 101. -Chang, L., Chiu, P., Lau, T. Hydrosalpinx fluid induced embryotoxicity and lipid peroxidation. Reproductive Toxicology 2004 19: 147-148. -Chen, C., Yang, J., Lin, K., Chao, K., Ho, H., Yang, Y. The significance of cytokines, chemical composition and murine embryo development in hydrosalpinx fluid for predectin the IVF outcome in women with hydrosalpinx. Human Reproduction 2002 17: 128-133. 72 -Chukwuemeka, L., Yu, E., Chan, H. New insights into the mechanisms underlying hydrosalpinx fluid formation and its adverse effect on IVF outcome. Human Reproduction 2002 8: 255-264. -Chung, HT., Pae, HO., Choi, BM., Billiar, TR., Kin, YM. Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2001 282:1075-1079. -Dale, B., Menezo, Y., Cohen, J., DiMateo, L and Widing, M. Intracellular pH regulation in the human oocyte. Hum. Reprod. 1998 13:964-70. -Devreker, F., Berg, M., Biramane, J., Winston, R., Englert, Y., and Hardy, K. (1999). Effects of taurine on human embryo developmente in vitro. Human Reproduction. 14. 2350-2356. -Devreker, F., Ardí, K., Berg, M., Vanniv, A., Emiliam, S., andEnglert, Y. (2001).Amino acds promote human blastocyst developmente in vitro. Human Reproduction. 16. 749-756. -Díaz-Cueto, L and Gerton, G. The Influence of Growth Factors on the Development of Preimplantation Mammalian Embryos. Archives of Medical Research. 2001 32: 619-626. -Dube, P., Revell, P., Chaolin, D., Lorenz, R., and Miller, V. A role for IL-1 in inducing pathology inflammation during bacterial infection. Microbiology 2001 98: 10880-10885. -Dumoulin, JC., Meijers, CJ., Bras, M., Coomen, E., Geraidts, JP and Evers, JL. Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo culture. Hum. Reprod. 1999 14:465-9. -Evans, JP and Florman, HM. The state of the union: the cell biology of fertilization. Nat. Cell. Biol. 2002 4:57-63. 73 -Fabian, D; IlKova, G; Rehak, P; Czikkova, S; Baran, V and Koppel, J. Inhibitory effect of IGF-I on induced apoptosis in mouse preimplantation embryos cultures in vitro. Theriogenology. 2004 61:745-755. -Favetta, L; St. John, E; King, A and Betts, D. High levels of p66 and intracellular ROS in permanently arrested early embryos. Free Radical Biology and Medicine. 2007 42:12011210. -Gardner, DK., and Lane, M. AminoAcds and Amonium regulate embryo development in culture. Biology of Reproduction. 1993 48. 377-385. -Gardner, DK and Lane, M. Activation of the ¨2-cellblock¨and development to the blstocyst of CF1 mouse embryo: rol of amino acds, EDTA and physical parameters. Hum. Reprod. 1996 11:2703-12. -Gardner, DK. Changes in requirements and utilization of nutrients during mammalian embryo development and their signifinance in embryo culture. Theriogenology. 1998 49:83-102. -Gardner, DK and Lane, M. Noninvasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of development potential. Fertil.Steril. 2001 76: 1175-80. -Gjorret, J., Fabian, D., Avery, B and Maddox-Hyttel, P. Active Caspase-3 and Ultrastructural Evidence of Apoptosis in Spontaneous and Induced Cell Death in Bovine In Vitro Produced Pre-Implantation Embryos. Molecular Reproduction and Development. 2007 74: 961-971. -Glabowski, W; Kurzawa, R; Wiszniewska, B; Baezkowski, T; Marchlewiez, M and Brelik, P. Growth factors effects on preimplantation development of mouse embryos exposed to tumor necrosis factor alpha. Reproductive Biology. 2005 5: 83-99. 74 -Gloire, G., Legrand-Poels, S and Piette, J. NF-kB activation by reactive oxygen species: fifteen years later. Biochemical Pharmacology. 2006 72: 1493-1505. -Gouge, RC., Marshbum, P., Gordon, BE., Nurley, W and Huet-Hudson, YM. Nitric Oxide as a regulator of embryonic development. Biol. Reprod. 1998 58:875-9. -Goyanes, VT., Ron-Corzo, A and Maneiro, E. Morphometric categorization of the human oocyte and early Concepts. Hum. Reprod. 1990 5:613-618. -Grund, E., Kagan, D., Tran, C., Zeitvogel, A., Starzinski-Powitz, A., Nataraja, S and Palmer, S. Molecular Pharmacology. 2008 73: 1394-1404. -Guerin, P., mouatassim, S., and menezo, Y. Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Human Reproduction Update. 2001 7: 175-188. -Hao, Y; Lai, L; Mao, J; Im, G; Bonk, A and Prather, R. Apoptosis and In Vitro Development of Preimplantation Porcine Embryos Derived In Vitro or by Nuclear Transfer. Biology of Reproduction. 2003 69:501-507. -Hawk, S; Lnoue, L; Keen, C; Kwik-Uribe, C; Rucker, R and Urio-Adams, Y. CopperDeficient Rat Embryos Are Characterized by Low Superoxide Dismutase Activity and Elevated Superoxide Anion. Biology of Reproduction. 2003 68:896-903. -Hardy, K and Spanos, S. Growth factor expressión and function in the human and mouse preimplantation embryo. Journal of Endocrinology. 2002 172:221-236. -Hukkanen, M; Hughes, F; Buttery, L; Gross, S; Evans, T; Seddon, S; Riveros-Moreno, V; Macintyre, I and Polak, J. Cytokine-Stimulated Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase by Mouse, Rat, and Human Osteoblast-Like Cells and Its Functional Role in Osteoblast Metabolic Activity. Endocrinology. 1995 136:5445-5452. 75 -Jurisicova, A and Acton, B. Deadly decisions: the role of genes regulating programmed cell death in human preimplantation embryo development. Reproduction. 2004 128:281291. -Kably, A., Carballo, E., Karchmer, S. Laboratorio de gametos. Factores determinantes de éxito en fertilización in Vitro. Ginecol Obstret Mex. 2001 69: 1-14. -Kalu, E., Sumar, N., Giannopoulos, T., Patel, P., Croucher, C., Sherriff, E and Bansal, A. Cytokine profiles in serum and peritoneal fluid from infertile women with and without endometriosis. J. Obstet. Gynaecol. Res. 2007 33: 490-495. -Karja, N; Kikuchi, K, Fahrudin, M, Ozawa, M; Somfai, T; Ohnuma, K; Noguchi, J; Kaneko, H and Nagai, T. Development to the blastocyst stage , the oxidative state, and the quality of early developmental stage of porcine embryos cultured in alteration of glucose concentrations in vitro under different oxygen tensions. Reproductive Biology and Endocrinology. 2006 4:1-12. -Kawamura, K; Fukuda, J; Kodama, H; Kumagai, J; Kumagai, A and Tanaka, T. Expression of Fas and Fas ligand mRNA in rat and human preimplantation embryos. Molecular Human Reproduction. 2001 7:431-436. -Kawamura, K; Kawamura, N; Kumagai, J; Fukuda, J and Tanaka, T. Tumor Necrosis Factor Regulation of Apoptosis in Mouse Preimplantation Embryos and its Antagonism by Transforming Growyh Factor Alpha/Phosphatidylionsitol 3-Kinase Signaling System. 2007 76:611-618. -Koong, M., Jun, J., Lee, H., Song, I., Kang, I. A second look at the embryotoxicity of hydrosalpingeal fluid: an in-vitro assement in a murine model. Human Reproduction 1998 13: 2852-2856. 76 -Koga, K., Osuga, Y., Yoshino, O., Hirota, Y., Tsutsumi, O andTaketami, Y. Elevated interleukin-6 levels in the peritoneal fluid of women with endometriosis may be a mechanism for inflammatory reactions associated with endometriosis. Fertility and Sterility. 2005;83:878-882 -Lane, M., Hooper, K and Gardner, DK. Effect of essencil aminoacds on mouse embryo viability and ammonium production. J. assist. Reprod. Genet. 2001 18:519-25. -Larson, R., Ignotz, G and Currie, W. Platelet derived growth factor (PDGF) stimulates development of bovine embryos during the fourth cell cycle. Development. 1992 115:821826. -Lawitts, J., and Biggers. Overcoming the 2-cell block by modifying standard components in a mouse embryo culture medium. Biology of Reproduction. 1991 45.245-251. -Lebovic, D., Mueller, M and Taylor, R. Inmunobiology of endometriosis. Fertility and Sterility. 2001; 75:1-10. -Leppens-Luiser and Sakkas, D. Development, glycolytic activity and viability of preimplantation mouse embryos subject to different periods of glucose starvation. Biol. Reprod. 1997 56: 589-96. -Li, Q., Harraz, M., Zhou, W., Zhang, L., Ding, W., Zhang, Y., Eggleston, T., Yeaman, C., Banfi, B and Engelhardt, J. Nox2 and Rac 1 Regulate H2O2-Dependent Recruitment of TRAF6 to Endosomal Interleukin-1 Receptor Complexes. Molecular and Cellular Biology. 2009 26: 140-154. -Lonergan, P., Rizos, D., Ward, F and Boland, M. Factors influencing oocyte and embryo quality in catle. Reprod. Nutr. Dev. 2001 41: 427-437. 77 -Lundin, K., Bergh, C and Hardarson, T. Early embryo cleavage is a strong indicator of embryo quality in human IVF. Hum. Reprod. 2001 16:2652-7. -Mathy-Hartert, M., Hogge, L., Sanchez, C., Deby-Dupont, G., Crielaoud, JM and Henratin, Y. Interleukin-1beta and interleukin 6 disturb the antioxidant enzyme system in bovine chondrocytes: a possible explanation for oxidative stress generation. Osteoarthritis Cartilage. 2008 16: 756-63. -McKierman, SH and Bavister, BD. Environmental variables influencing in vitro development of hamster 2-cell embryos to the blastocisto stage. Biol. Reprod. 1990 43:40413. -Maisey, K., Nardocci, G., Imarai, M., Cardenas, H., Rios, M., Croxatto, H., Heckels, J., Christodoulides, M., Velasquez, L. Expression of proinflammatory cytokines and receptors by human fallopian tubes in organ culture following challenge with Neisseria gonorrhoeae. Infection and Inmunity 2003 71: 527-532. -Mercader, A., Mínguez., Y., Herrer, R., Remohi, J., Pellicer, A y Simon, C. Cultivo embrionario prolongado: métodos, estrategias y resultados. Cuad. Med. Reprod. 2000 6:100-103. -Miesel, R., Drzejczac, P., and Kurpisz, M. Oxidative stress during the interaction of gametes. Biology of Reproduction 1993 49: 918-923. -Mikkelsen, AL and Linderberg, S. Morphology of in vitro matured oocytes: impact on fertility potential and embryo quality. Hum. Reprod. 2001 16:1714-18. -Mio, Y., Toda, T., Herada, T., and Terakawa, N. Luteinized unruptured follicle in the early stages of endometriosis as a cause of unexplained infertility. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1992 167: 271-273. 78 -Moshage, H., Kok, B., Huizenga, JR., Jansen, PL. Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clinical Chemestry 1995 41: 892-896. -Nasr-Esfahani, M and Johnson MH. The origen reactive oxygen species in mouse embryos cultured in vitro. Development. 1991 113:551-560. -Nixon, B., Asquith, KL and Atken J. The role of molecular chaperones in mouse spermegg interactions. Mol. Cell. Endocrinol. 2005 240:1-10. -Noriega, J., Bedaiwy, M., Worley, S., Sharma, R., Agarwal, A., Falcone, T. Differential contribution of reactive oxygen species and tumor necrosis factor- to the fluid-induced embryotoxicity in endometriosis patients. Fertility and Sterility 2003 80: 226. -Packham, G and Cleveland, J. c-Myc and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1995 1242:11-28. -Podgaec, S; Abrao, M; Dias, J; Rizzo, L; De Oliveira, R and Baracat, EC. Endometriosis: an inflammatory disease with a Th2 immune response component. Human Reproduction. 2007 22:1373-1379. -Rasmussen, S., Eckmann, L., Quayle, A., Shen, L., Zhang, Y., Anderson, D., Fierer, J., Stephens, R., Kagnoff, M. Secretion of proinflammatory cytokines by cells in response to Chlamydia infection suggest a central role for epithelial cells in Chlamydial pathogenesis. The Journal of Clinical Investigations 1997 99: 77-87. -Remohi, J., Cobo, A., Romero, J., Pellicer, A., Simón, C. Manual Práctico de Esterilidad y Reproducción Humana. 2da edición. Mc. Graw-Hill. Interamericana. 2005. -Romero, L; Tatro, JB; Field, JA and Reichlin, S. Roles of IL-1 and TNF-alpha in endotoxin-induced activation of nitric oxide synthase in cultured rat brain cells. American Journal Physiology. 1996 270:326-32. 79 -Sakkas, D., Urner, F., menezo, Y., and Leppens, G. Effects of glucose and fructose on fertilization, clivage, and viability of mouse embryios in vitro. Biology of Reproduction. 1993 49. 1288-1292. -Sakkas, D and Vassalli, JD. The preimplantation embryo: Development and experimental manipulation. Reproductive health 2003. -Sakkas, D., Umer, F., Bizzarro, D., Manicardi, G., Branchi, PG., Shoukin, Y and Campana, A. Sperm nuclear DNA damage nd altered chromatin structure: effect on fertilization and embryo development. Hum. Reprod. 1998 4:11-9. -Salas-Vidal, E., Lomeli, H., Castro, S., Cuervo, R., Escalante, D., and Covarrubias, L. Reactive oxygen species participate in the control of mouse embryonic cell death. Experimental Cell Research 1998 238: 136-147. -Singh, M., Azab, H., Goldberg, J., Sharma, R., Attaran, M., Falcone, T. Is there a relationship between oxidative stress embryotoxicity of hidrosalpingeal fluid on mouse embryo development.?. Fertility and Sterility 2000 74: 64. -Sokolov, D., Solodovnikova, N., Pavlov, O., Niauri, D., Volkov, N and Sel´kov, S. Study of Cytokine Profile and Angiogenic Potential of Peritoneal Fluid in Patients with External Genital Endometriosis. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2005 140: 541544. -Soller, J., Murua-Escobar, H., Willenbrock, S., Janssen, M., Eberle, N., Bullerdiek, J and Nolte, I. Comparation of the Human and Canine Cytokines IL-1(α/β) and TNF-α to Orthologous Other Mammalians. Journal of Heredity. 2007 98:485-490. -Soto, P., Natzke, RP and Hansen, PJ. Actions of Tumor Necrosis Factor-α on Oocyte Maturation and Embryonic Development in Cattle. American Journal of Reproductive Immunology. 2003 50:380-388. 80 -Spandorfer, S., Liu, H., Neuer, A., Barmat, L., Davis, O., Rosenwaks, Z. The embryo toxicity of hydrosalpinx fluid is only apparent at concentrations: an in vitro model that simulates in vivo events. Fertility and Sterility 1999 71: 619-626. -Strandell, A., Sjgren, A., Ley, U., Thorburn, J., Hamberger, L., Brannstrom, M. Hydrosalpinx fluid does not adversely affect the normal development of human embryos and implantation in vitro. Human Reproduction 1998 13: 2921-2925. -Sugino, N., Karube-Harada, A., Sakata, A., Takiguchi, S., Kato, H. Nuclear factor-Kappa B is required for tumor necrosis factor-alpha-induced manganese superoxide dismutasa expression in human endometrial stromal cells. Journal Clinical of Endocrinology and metabolism. 2002 87: 3845-3850. -Takentani, Y., Kuo, T-M. And Mizuno, M. Comparison of cytokine levels and embryo toxicity in peritoneal fluid in infertile women with untreated or treated endometriosis. American Journal Obstet Gynecol. 1992; 167: 265-270. -Taylor, C. Antioxidants and reactive oxygen species in human fertility. Environmental toxicology and Pharmacology 2001 10: 189-198. -Thaler, C and Epel, D. Nitric Oxide in Oocyte Maduration, Ovulation, Fertilization, Cleavage and Implantation: A little dab’ll do ya. Current Pharmceutical Desing. 2003 9: 399-409. -Tranguch, S; Steuerwald, N and Huet-Hudson, Y. Nitric Oxide Synthase Production and Nitric Oxide Regulation of Preimplantation Embryo Development. Biology of Reproduction. 2003 68:1538-1544. -Van Langendonckt, A., Casanas-Roux, F. and Donnez, J. Oxidative stress and peritoneal endometriosis. Fertility and Sterility. 2002; 77: 861-870. 81 -Vassiliadis, S; Relakis, K; Papageorgiou, A and Athanassakis, I. Endometriosis and infertility: A multi-cytokine imbalance versus ovulation, fertilization and early development. Clinical and Developmental Immunology. 2005 12:125-129. -Velez-Pardo, C; Tarzona Morales, A; Jimenez del Rio, M and Olivera-Angel, M. Endogenously generated hydrogen peroxide induces apoptosis via mitochondril damage independent of NF-kB and p53 activation in bovine embryos. Theriogenology. 2007 67:1285-1296. -Vitrolife. (2002). Closer to Nature. Learning from the embryo and the mother. GIII Series. A new era in ART media composition. Pp4-7. -Volk, T., Hensel, M., Schuster, H., Kox, WJ. Secretion of MCP-1 and IL-6 cytokine stimulated production of reactive oxygen species in endothelial cells. Molecular cell Biochemical. 2000: 206: 105-112. -Wang, Y., Sharma, R., Falcone, T., Goldberg, J., and Agarwal, A. Importance of reactive oxygen species in the peritoneal fluid of women with endometriosis or idiopathic infertility. Fertility and Sterility 1997 68: 826-830. -Wassaman PM., Jovine, L., Williams, Q and Litcher, ES. Recents aspects of mammalian fertilization research. Mol. Cell Endocrinol. 2005 234:95-103. -Weels, P; Bhuller, Y; Chen, C; Jeng, W; Kasapinovic, S; Kennedy, J; Kim, P; Laposa, R; McCallum, G; Nicol, C; Parman, T; Wiley, M and Wong, A. Molecular and biochemical mechanisms in teratogenesis involving reactive oxygen species. Toxicology and Applied Pharmacology. 2005 207:s354-s366. -Yang, H., Hwang, K., Kwon, H., Kim, H., Choi, K., and Oh, K. Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos. Human Reproduction 1998 13: 998-1002. 82