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Tema 17 Reacciones multisustrato Reacciones enzimáticas con dos sustratos 1. Introducción 2. Nomenclatura 3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos. 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos 4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. 4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado. 4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong 1.Introducción Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación enzimática de un sustrato en un único producto. S + E <==> ES <==> EP <==> E + P Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales, restringidos a reacciones de isomerización. Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato, transformándolos en varios productos son las más frecuentes. - Por ejemplo: A+BP+Q - Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas: Adenilato ciclasa Citrato sintasa Alcohol-DH Malato-DH Ribitol-DH Lactato-DH Coenzima-A transferasa Glutamato-alanina transaminasa Glucosa oxidasa etc. .... Estudio cinético: A) Velocidad inicial S v V `max K `S B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los reactantes (Resto saturación). Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno 2. Nomenclatura a) En cuanto al número de sustratos y productos: Reacción Nombre A -----> P Uni-Uni A + B -----> P Bi-Uni A + B -----> P + Q Bi-Bi A + B + C -----> P + Q Ter-Bi b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los productos: * Reacciones secuenciales: - al azar - ordenadas * Reacciones de desplazamiento: - Ping-Pong El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser bastante complicado a la hora de representar los esquemas de las reacciones A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland. De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la reacción se simboliza por una línea horizontal. La entrada de sustratos y la salida de productos se representan por flechas verticales que indican la dirección de entrada o salida de la reacción. - Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos y se forman 2 productos: B A E P EA EAB EPQ Q EQ E Secuencial: Bi-Bi ordenada P A E EA B E Q EB Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong E ¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos? a) A B C P Q E b) E A B P C Q R E c) E A E P B Q C R E 3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi: A + B --- P + Q -Mecanismos secuenciales - al azar - ordenadas - Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento A) Mecanismos secuenciales, Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo ternario EAB o EBA debe formarse como requisito indispensable antes de que se produzca la formación de productos. La formación del complejo ternario es independiente del orden de unión de los sustratos. Este tipo de reacciónes se denominan reacciones secuenciales al azar, La formación del complejo ternario debe producirse en un orden determinado para que el complejo sea productivo desde el punto de vista catalítico. Este tipo de reacción se denomina reacciones secuenciales ordenadas). Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos de reacciones secuenciales. Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico: Bi-Bi al azar P E + A <=> EA B EQ <=> E + Q EAB <=> EPQ E + B <=> EB A Q EP <=> E + P Bi-Bi ordenado E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland: Bi-Bi al azar A B P EA EQ E EB B Q EAB EPQ EBA EQP A E EP Q P Bi-Bi ordenada B A E EA P EAB EPQ Q EQ E - Un caso especial, es el siguiente: B A E EA P Q EQ E - Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni EPQ La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se genera una forma modificada de la enzima. (acil enzimas, fosforil enzimas) Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del segundo producto con regeneración de la forma nativa de la enzima. E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q - Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es decir en reacciones de transferencias. * Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones Ping-Pong, tenemos: P A E EA B E Q EB Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping Pong E E Succinil-E E-P GTP GDP Succinato Pi HSCoA Succinil-CoA ¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la siguiente reacción? E 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido: entre la E y los S b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la enzima: (Eo) = (EXi) c) Supondremos la existencia de condiciones de estado estacionario 4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. A KA A+B B KMAB EA E EAB EBA EB KB v = kcat [EAB=EBA] kcat E + P+ Q KMBA B A E A E B KA KB EA EB EAB EBB KM KM EAB EBA ET E EA EB EAB AB P +Q KA KM BA AB KB KM BA KM es la concentración de Substrato en el cual v=1/2 Vmax cuando el otro substrato está saturante KM AB EAB EAB EAB EAB A KA B EA E KM AB EB KB AB EAB [ E ] AB KM KA ET E EA EB EAB ET E E A E B [ E ] AABB KA KB KM KA v kcatET KAKM AB KMAB EAB EBA E + P+ Q KMBA v = kcat [EAB] v kcatE AB A KM BKM AB kcat BA AB KAKM AB AB Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar v kcatET KAKM Vmax = kcat [ET] AB AB A KM BKM AB BA AB Concentraciones saturante de A y B ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar v V max KAKM AB AB A KM BKM AB BA AB Un substrato constante pero no saturante v V max KAKM AB AB A KM BKM AB Constante [A] BA AB B v V ´max K ´B V max A V ´max KM BA A K ´ KM AB KA A KM BA A Ver anexo 1 Constante [B] Igual se hace para [B] constante pero no saturante v V max KAKM AB AB A KM BKM AB A v V ´max K ´A V max B V ´max KM AB B K ´ KM BA KB B KM AB B BA AB Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas [A] cte Vmax [B] cte Vmax V`max V`max B v V ´max K ´B v V ´max KMAB KMBA [A] V max A V ´max KM BA A V max B V ´max KM AB B KMAB K` [A] =0 KMBA K` KB KA [A] K´ KM AB KA A KM BA A [B] K´ KM BA KB B KM AB B [B] A K ´A Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante [B] se hace muy grande, --> , condición de saturación v V max KAKM AB V max B V ´max KM BA B K ´ KM AB KA A AB A KM BKM AB V ´max [B] Muy grande K ´ BA V max B V max B KM AB A AB A KM AB KM BA A v V max A KM AB A Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante [A] se hace muy grande, --> , condición de saturación v V max KAKM AB V max A V ´max KM BA A K ´ KM AB AB A KM BKM AB V ´max [A] Muy grande KA B K ´ AB V max A V max A KM BA B KM BA B v V max BA B KM BA B KM BA B Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten 4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado E A EA B EAB E P Q KA KmAB kcat V=kcat[EAB] E A AB KA v kcatET EA KAKM A KM AB EAB AB Km EAB E E EA EAB v AB AB T v V max AB KAKM A KM AB AB AB v V max Constante B V `max V max B KM AB B KAKM AB K ` KM AB B AB KAKM AB A KM AB AB v V `max A K ` A Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B Vmax V`max Regresión No-linear Vmax KMAB [B] K` KA [B] v V max Constante A V `max V max AB KAKM A KM AB AB AB v V `max KAKM AB K ` KM AB A B K `B Pendiente es igual: KA KAB K` KMAB [A] ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO BIBI ORDENADO: Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato: Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima 4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong No hay complejo ternario k1 E +A Q k2 EA k3 P + E* + B k -1 k4 E*B E+ k-3 KMA KMB O con la nomenclatura de Cleland: P A E EA B E* Q E*B - Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales. E k1 E +A k2 EA k3 k4 P + E* + B k -1 E*B E+Q k-3 KMA KMB La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB v = k4 [E*B] kcat k 4 Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario k 1 k 2 E A K EA k1 k 3 k 4 E *B B KM E´B k3 ET E EA E * E * B A M Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO BI BI PING PONG v V max AB k4 A k4 B K M B K M A AB 1 k2 k2 kcat k 4 k 2 k 4 k4 k2 Paso limitante V max AB v A B K M B K M A AB v V max Constante B KM B A KM B KM B KM BA A AB A v V `max K `A V max B V `max KM B B K ` AB AB Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B B Vmax Regresión No-linear V`max Vmax KMB KMB [B] KMA K` KMB [B] v V max Constante A V max A KM A A KM B A K ` KM A A AB KM AB B KM BA A AB A v V `max K `A V `max Regresión No-linear Vmax V`max Vmax KMA KMA KMB K` KMA [B] DIFERENCIACIÓN MECANISMOS Al azar Ping-Pong K` Ordenada [B] Al azar K` Ping-Pong Ordenada [A] Mecanismo Bi-Bi al azar Enzima Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3) Creatin quinasa (EC 2.7.3.2) Citrato sintasa (EC 4.1.3.7) Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56) Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27) Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7) Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2) Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4) Inhibición por productos Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones que transcurren con dos substratos y dos productos A + B --- P + Q Mecanismo Inhibidor Substrato A (B saturante) Substrato B (A saturante) Bi-Bi ordenado P Q Acompetitiva Competitiva No competiva ------------------ Ping Pong P Q Competitiva ----------------- -----------------Competitiva Bi-Bi al azar P Q No competitiva No competitiva No Competitiva No competitiva RESUMEN Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos ,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero con respecto a todos los reactantes menos uno. En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato (mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado). Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes cinéticas que describen el proceso enzimático. La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos probables de reacción. En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular. Anexo 1 v V max A KAKM AB constante AB A KM BKM AB AB KAKM A KM B KM AB B V max v KM A KAKM A KM B KM AB KM A B V max v KM A KAKM A KM ( KM A)B KM A B V max v KM A KAKM A KM B KM A B V max v KM A KM ( KA A ) B KM A v V max AB AB AB BA BA AB BA AB Se divide BA BA AB BA AB BA AB BA AB BA BA AB BA V ´max BA K ´ V max A KM BA A KM AB KA A KM BA A B v V ´max K ´B PROBLEMAS. 1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma AX +B Bx + A Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de substrato AX. Los resultados obtenidos. INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM 2.0 250 286 300 2.5 278 323 341 3.3 313 371 395 5.0 357 435 469 10.0 417 526 577 ¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?