Download 211.SREDNIK,M. VET-UBA. Identificación de

XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR
Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR – UNL 250º Aniversario de la Enseñanza Veterinaria
Identificación de especies de Estafilococos Coagulasa
Negativos Aislados de muestras de leche de Mastitis
Bovina por PCR-RFLP del gen gap (Comunicación
Preliminar)
Srednik, M.; Bentancor, A.; Gentilini, E.
Cátedra de Microbiología. Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Subsidio
UBACyT V011, Mastitis Bovina
La mastitis bovina es una enfermedad de distribución mundial que afecta la
salud de los animales y produce grandes pérdidas económicas en la
industria lechera. Los estafilococos coagulasa negativos (ECN) son un
grupo heterogéneo de bacterias aislados frecuentemente de mastitis bovina.
Para la identificación fenotípica de los ECN se utilizan una variedad de
métodos incluyendo tests comerciales (API STAPH, Staph-Zym, Vitek
2,3
system, entre otros) y el esquema convencional de Kloos y Schleifer .
Estos métodos, basados en reacciones fenotípicas, muchas veces dan
resultados contrapuestos en la identificación de las distintas especies de
ECN. Métodos alternativos basados en características moleculares han sido
1,4
propuestos para la identificación de Staphylococcus spp . El objetivo de
este estudio es aplicar polimorfismo en el largo de los fragmentos de
restricción (PCR-RFLP) del gen gap para la identificación de las diferentes
especies de ECN aisladas de leche de mastitis bovina. Se analizaron n=29
aislamientos de ECN identificados fenotípicamente, provenientes de leches
mastíticas. Las cepas de referencia incluídas en los ensayos fueron
pertenecientes al American Type Culture Collection (ATCC): S. simulans
ATCC 27851, S. warneri ATCC 49954, S. capitis ATCC 35661, S. sciuri
subsp. sciuri ATCC 29060, S. cohnii subsp cohnii ATCC 35662, S.
saprophyticus ATCC 15305, S. xylosus ATCC 29972, S. haemolyticus
ATCC 29970, S. epidermidis ATCC 12228. La extraccion de ADN en todas
las cepas se realizó con Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega) de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se amplificó por PCR un
fragmento de ~933 bp correspondiente al gen gap: Gap1- for 5’ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA
y
Gap2-rev
5’GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG. Mediante RFLP in sílico se
determinaron los patrones RFLP del amplicón del gen gap y la enzima de
restricción AluI utilizando el programa Restriction Mapper a partir de 20
secuencias de 20 especies ECN obtenidas de la base de datos del
GenBank: S. xylosus DQ321700.1, S. warneri DQ321699.1, S. simulans
DQ321698.1, S. sciuri DQ321697.1, S. lentus DQ321692.1, S. hycus
DQ321689.1, S. hominis DQ321688.1, S. haemolyticus DQ321687.1, S.
cohnii DQ321681.1, S. chromogenes DQ321680.1, S. caprae
DQ321677.1, S. capitis subsp. urealyticus HM352966.1, S. epidermidis
GU968738.1, S. cohnii subsp. urealyticus HM352971.1, S. intermedius
XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR
Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR – UNL 250º Aniversario de la Enseñanza Veterinaria
DQ321690.1, S. saccharolyticus HM352969.1, S. aureus DQ647036.1, S.
saprophylitus DQ321695.1, S. epidermidis DQ321683.1, S. succinus
FJ578003.1. Los diferentes amplicones del gen gap obtenidos por PCR
fueron digeridos con AluI. Los fragmentos de ADN resultantes se analizaron
por electroforesis en gel de agarosa 2,5%. Con esta metodología de PCRRFLP se identificaron 82,8% de los aislamientos (24/29). De los 29
aislamientos evaluados se identificaron 7 especies: S. haemolyticus (3/29),
S. hominis (1/29), S. caprae (1/29), S. chromogenes (12/29), S. cohnii
(2/29), S.simulas (2/29) y S. xylosus (3/29) porque presentaron igual
patrón que las cepas de referencia y los patrones RFLP in sílico. A su vez,
las identificadas como S. chromogenes y S. caprae obtuvieron un perfil de
RFLP compatible in sílico con S. intermedius y S. saprophyticus
respectivamente. El 6,9% de los aislamientos (2/29) presentaron un patrón
no compatible con ninguna especie. Del 10,3% de los aislamientos (3/29) no
se obtuvo el amplicón del gen gap. Del análisis de los resultados hasta el
momento se hace necesario el uso de otra enzima de restricción para poder
diferenciar aquellas especies que mostraron idéntico patrón de digestión. La
correcta identificación es esencial para conocer la participación de los ECN
en las infecciones intramamarias y tomar decisiones apropiadas para su
manejo.
BIBLIOGRAFÍA
1. Ghebremedhin, B.; Layer, F.; König, W.; König, B. Genetic Clasification
and Distinguishing of Staphylococcus Species Based on Different Partial
gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf Gene Sequences. J. Clin.
Microbiol. 46, 3: 1019-1025. 2008.
2. Ieven, M.; Verhoeven, J.; Pattyn, S.R.; Groossens, H. Rapid and
economical method for species identification of clinically significant
coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol. 33, 1060-1063, 1995.
3. Kloos, W.E.; Schleifer, K.H. Simplified scheme for rutine identification of
human Staphylococcus aureus species. J. Clin. Microbiol. 1: 82-88, 1975.
4. Yugueros, J.; Temprano, A.; Sánchez, M.; Luengo, J.M.; Naharro, G.
Identification of Staphylococcus spp. by PCR-Restriction Fragment Length
Polymorphism of gap Gene. J. Clin. Microbiol. 39, 10: 3693-3695, 2001.