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ENZIMOLOGIA 2010
FACULTAD DE CIENCIAS
INHIBICION ENZIMÁTICA IRREVERSIBLE
XANTINA OXIDASA Y CIANURO
Diseño y puesta a punto: Edward Suárez, Martín Fló, Laura Celano, Beatriz
Alvarez y Leonor Thomson
En el caso de la inhibición irreversible, el inhibidor no se encuentra en equilibrio con
el complejo enzima-inhibidor. Por lo tanto, no se reactiva la enzima removiendo el
inhibidor mediante diálisis, a diferencia de lo que sucede con los inhibidores
reversibles. La inhibición irreversible se caracteriza por un aumento progresivo en el
tiempo, llegando en última instancia a la inhibición completa, siempre que el inhibidor
esté en exceso con respecto a la concentración de enzima presente. La efectividad
del inhibidor no se expresa como una constante de equilibrio, sino como una
constante de velocidad, que determina la fracción de la enzima inhibida en un
período determinado de tiempo para una cierta concentración de inhibidor (Dixon, M.
& Webb, E. C. En: Enzymes 3era Ed., 1979, Academic Press, NY).
Modelo
Emplearemos como modelo experimental la inhibición de la enzima xantina oxidasa
por cianuro de potasio (KCN). La xantina oxidasa (E.C. 1.2.3.2) cataliza la oxidación
de la xantina a ácido úrico y la reducción del oxígeno a peróxido de hidrógeno (H2O2)
y superóxido (O2.-), en proporciones variables según las condiciones del ensayo.
OH
N
N
N
H
N
OH
O2.-/H2O2
O2
N
N
HO
OH
N
H
Xantina
oxidasa
N
O
Ácido úrico
Xantina
La xantina oxidasa tiene como cofactores un centro molibdopterina, una flavina y dos
centros ferrosulfurados. Posee un azufre coordinado al Mo, cuya remoción por
acción de algunos agentes como el cianuro (CN-), rinde la desulfo enzima inactiva.
CN-
O
MoIV
S
OH-
O
MoIV
SCN-
O
MoIV
SCN
OH
Objetivos
• Estudiar el desarrollo temporal de una inhibición irreversible.
• Determinar la constante de reacción de segundo orden (k) entre cianuro y xantina
oxidasa.
• Establecer el tiempo necesario para inactivar la enzima a la mitad para una
determinada concentración de cianuro (t1/2).
1
•
Estudiar el grado de reversibilidad de la inhibición de la xantina oxidasa por
cianuro mediante gel filtración.
Materiales y reactivos
• Amortiguador pirofosfato 50 mM, pH 8,3
• Xantina 3 mM
• KCN 100 mM
• Xantina oxidasa 0.14 U/ml
• Columna de Sephadex G-25
Procedimiento
1. Estudio de la evolución en el tiempo de la inhibición por cianuro
Incube a temperatura ambiente 4 mL de xantina oxidasa (1/8) en presencia de KCN
0.5 mM (concentración final). Inmediatamente después del agregado del KCN tome
una alícuota de 50 μL y determine la velocidad de la reacción. Registre el tiempo en
el que se realiza la medida.
Para medir la velocidad, adicione la alícuota (50 µL de incubado) a un tubo
conteniendo xantina (33 µL de stock, concentración final 100 µM) en pirofosfato
(c.s.p. 1 mL), siguiendo la aparición de ácido úrico a 292 nm (ε292 = 11 mM-1 cm-1)
durante 1 minuto. Realice medidas de velocidad de reacción cada 3 minutos durante
70 minutos, de tal manera de generar una tabla de velocidad o actividad versus
tiempo de incubación.
Simultáneamente, en un segundo tubo (tubo control) repita las condiciones para 1
mL de enzima en ausencia de KCN y mida actividad a t = 0 y luego de 70 minutos.
Grafique velocidad o actividad = f(tiempo). Para la reacción con el cianuro, determine
la constante exponencial de pseudo primer orden (kobs o k'), determine el t1/2 y la
constante de velocidad k para la reacción de segundo orden.
2. Exploración de la reversibilidad de la formación del complejo enzimainhibidor
Se medirá la actividad de la enzima antes y después de pasarla por una columna de
Sephadex G-25.
Lave la columna con 30 mL del amortiguador de trabajo a fin de equilibrarla. Para
conocer el factor de dilución de la enzima debido a su pasaje por la columna se debe
medir la absorbancia a 280 y 450 nm antes y después.
Tome 1.2 mL de xantina oxidasa del incubado con KCN. Antes de sembrar la
muestra, mida la absorbancia a 280 y 450 nm del volumen total incubado. Además,
tome una alícuota de 50 μL de incubado y determine su actividad.
En el momento de sembrar la muestra, trate de hacerlo con el mínimo volumen de
líquido posible presente por encima del empacado para minimizar la dilución de la
muestra a sembrar por efecto del amortiguador.
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Mida la Abs 280 y 450 en las primeras fracciones de 1 mL obtenidas luego del
pasaje por columna del tubo incubado con KCN. Determine la actividad en aquella
fracción que posea mayor Abs a 280 nm, siguiendo la aparición de acido úrico a 292
nm.
Evalúe el porcentaje de recuperación de la actividad luego de la gel filtración.
Preguntas
En la práctica se observó cómo cae la actividad de xantina oxidasa incubada con
KCN en el tiempo. ¿Cómo sabe que el efecto observado es causado por el inhibidor
y no por algún otro factor?
¿Cómo compararía la gráfica de actividad de xantina oxidasa versus tiempo de
incubación con cianuro si realiza el experimento con concentraciones mayores de
cianuro?
¿Y si lo realiza con concentraciones mayores de xantina oxidasa?
¿Qué experimento/s realizaría para determinar si un inhibidor es irreversible o
reversible?
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