Download aislamiento y caracterizacion de cepas colombianas de

BlOMEOlCA
Vol. 2, No. 3
- 1982
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE CEPAS COLOMBIANAS
DE PLASMODIUM FALCIPARUM
CARLOS ESPINAL T.,'
EDlTH MORENO.** PATRlClA GUERRA.** PATRlClA DE LA VEGA.**'
Las cepas de P. falciparum necesarias para los estudios de vacunas
antimaláricas requieren de una completa caracterización que
incluye la historia clínica del paciente, el sitio de origen y de
aislamiento de la infección. la adaptación al sistema de cultivo
continuo, la sensibilidad a los antimaláricos, la presencia de
nodulaciones íK+) en los eritrocitos infectados v la d i s ~ o n i b i l i d a dd e
las poblaciones originales de parásitos, ademés de su infectividad
en primates del genero Aotus.
Basados en estos criterios se aislaron y caracterizaron 8 cepas
colombianas de P. falciparum obtenidas en cuatro de las
principales áreas maláricas del país. Una de ellas, la capa FCB-l. ha
sido adaptada en Aotus. en el cual desarrolla infecciones de alta
virulencia. Las cepas cloroquina-resistentes parecen crecer en
mejor forma que las sensibles, durante la fase de adaptación al
cultivo continuo, representando una de las hipótesis para la rápida
dispersión de las poblaciones de parásitos resistentes a la
cloroquina.
El cultivo continuo del P. falciparum ha
permitido el a v a n c e de los estudios en
inmunologia y quimioterapia de la malaria,
ya que es posible tener una fuente constante
de p a r á s i t o s p a r a e s t e tipo de investigaciones.
drogas, a s í como el desarrollo de n u e v a s
ténicas de sensibilidad in-vitro, únicamente
pueden ser realizados con cepas adaptadas
al cultivo continuo y con diferentes grados
de susceptibilidad a los antimaláricos.
Con la disponibilidad de c e p a s d e
P. falciparum de diferentes áreas geográficas mantenidas por este sistema. la identificación de l a s proteínas del p a r á s i t o que
están involucradas en la inducción de una
a d e c u a d a r e s p u e s t a inmune, es un paso
indispensable p a r a la producción de una
vacuna antimalárica de amplia cobertura.
En la quimioterapia los estudios genéticos
sobre la resistencia del P. folciporum a las
Una cepa de P. falciparum h a sido
definida tradicionalmente como una línea de
parásitos establecida en cultivo continuo o
en primates del género Aotus, en la cual se
han determinado algunas de sus características de crecimiento in-vitro. g r a d o de
infectividad e n Aotus y sensibilidad a
algunas drogas. Durante el cultivo continuo
los parásitos pueden tener alteraciones en
su estructura y cambios en su sensibilidad a
los antimaláricos. Ha sido comunicada la
*
'*
***
Médico, Je fe de l a U n i d a d de I n r n u n o l o g i a de Malaria, Grupo de M i c r o b i o l o g i a r I n m u n o l o g i a , I n s t i t u t o Nacional
de Salud, Apartado a i r e o R o o ~ o ,Bogotá.
Bacteriólogas, U n i d a d de l n m u n o l o g í a de Malaria.
Bióloga, U n i d a d de I i i r n u l i o l o g i a de Malaria.
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE CEPAS COLOMBIANAS....
pérdida de antígenos de superficie en las
formas m a d u r a s de algunas c e p a s d e P.
falciporum (1, 2), a s í como también s e h a
informado el incremento de la resistencia de
los parásitos a la cloroquina después de un
tiempo prolongado en cultivo (3). Debida a
estos cambios durante las fases de adaptación y mantenimiento del P. falciparum al
sistema in-vitro, e s esencial conocer la
historia clínica de los pacientes de los cuales
se efectuó el aislamiento, y/o disponer de
muestras originales de parásitos obtenidos
del paciente mismo o de los pases preliminares en cultivo o en primates.
Este artículo describe la caracterización
de 8 c e p a s de P. falciparum a i s l a d a s e n
algunas de las principales zonas maláricas
del país y establecidas en cultivo siguiendo
el método de Trager y Jensen (4).
MATERIALES Y METODOS
Nomenclatura de las cepas
La nomenclatura seguida en la denominación de las cepas de P. falciparum aisladas
en el Instituto Nacional de Salud está basada
en la propuesta por Jensen y Trager (5). en la
cual debe incluirse la especie del parásito, el
país d e origen y el sitio d e adaptación a l
cultivo. además de un número que indique
l a s s e c u e n c i a s d e los aislamientos. En
nuestro caso, las letras F (P. falciparum).
C (Colombia). B (Bogotá) y los números 1. 2.
etc., seguidos por le letra inicial del departamento de procedencia de la infección.
identificarán las cepas aisladas en nuestro
laboratorio.
antimaláricos y se colocaron los parásitos en
cultivo. El resto de la sangre infectada fue
dividida e n aliquotas y congelada por e l
método modificado de Rowe (7). conserv4ndose así la población original de parásitos.
Los pacientes fueron seguidos diariamente
mediante u n examen d e gota g r u e s a y
extendido de s a n g r e periférica por un
periódo máximo de 30 d í a s , c o n e l fin d e
determinar la respuesta in-vivo a los tratamientos administrados. Las o t r a s c u a t r o
cepas fueron remitidas a Bogotá a temperatura ambiente. La sangre infectada de un
paciente proveniente de Tarazá, Antioquia.
fue enviada al laboratorio de la Unidad de
Inmunología de Malaria por el Dr. Alberto
Restrepo del Hospital San Vicente de Paul de
Medellin. Tres muestras del Valle del Cauca,
obtenidas de pacientes provenientes de
Juanchaco, Mojarra y Buenaventura, fueron
enviadas por el Dr. Guillermo Sarmiento,
Jefe del Servicio d e Erradicación de la
Malaria e n Cali. Una vez recibidas l a s
m u e s t r a s d e s a n g r e , s e siguió el mismo
procedimiento descrito anteriormente para
las infecciones obtenidas en el laboratorio.
Para el establecimiento de los parásitos en
el sistema de cultivo se determinó el grupa
sanguíneo, el factor Rh y el porcentaje de
parasitemia de las sangres infectadas y de
los pacientes observados en el laboratorio.
El plasma se retiró después de una centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos. Luego
de dos lavados con medio RPMI -1640 y
bicarbonato de sodio al 5%, se procedió a
h a c e r la dilución d e la s a n g r e infectada
mediante la adición d e glóbulos rojos
normales compatibles con los del paciente.
Estos eritrocitos normales estaban suspenObtención y aislamiento de las cepas
didos e n medio de cultivo compuesto d e
RPMI-1640, Hepes como tampón además de
Las 8 cepas fueron aisladas de pacientes bicarbonato d e sodio a l 5 % , 5OUg/ml d e
con diagnóstico certero de infección por P. sulfato de gentamicina y 15% de s u e r o
falciparum. Cuatro de ellas se aislaron de humano normal compatible con los glóbulos
pacientes vistos en la Unidad de Inmunología rojos en cultivo. Posteriormente, los paráde Malaria. a los cuales, luego de confirmar sitos fueron colocados en cajas de petri de 35
el diagnóstico de especie, s e les hizo una mm e incubados a 37-38°Cen un ambiente de
determinación de parásitos por microlitro de 3-5% deCU2, de acuerdo con la descripción
sangre. Posteriormente y antes de iniciar e l original de la técnica de Trager y Jensen (4).
tratamiento indicada según la severidad de Cada 24 horas se hizo cambio del medio de
la infección (6), se tomaron de 10 a 15 cc de cultivo y c a d a 72 o 96 h o r a s , d e s p u é s d e
sangre en EDTA y con 1-2 cc se realizaron determinar la parasitemia, se diluyeron los
las pruebas de susceptibilidad in-vitro a los glóbulos rojos infectados con eritrocitos
CARLOS ESPINAL T.. EDlTH MORENO, PATRlClA GUERRA. PATRlClA DE LA VEGA
normales. La concentración d e s u e r o
humano normal se redujo a un 10% luego del
primer mes de cultivo, cuando los parásitos
crecieron con r e g u l a r i d a d e n el sistema
in-vitro.
Se realizó congelación periódica d e la
sangre infectada durante la etapa inicial del
cultivo, considerándose, en forma conjunta
con los parásitos derivados del paciente,
como la población original de la cepa de P.
falciporum. Durante la fase de adaptación
se prestó especial atención a la capacidad
de las cepas para producir gametocitos, con
el fin de seleccionar posteriormente los
parásitos con mayor gametocitogénesis.
Susceptibilidad in-vitro a los antimalóricos
La respuesta de las cepas a la cloroauina
fue establecida mediante la microtécnica
descrita por Rieckmann y col (8).Brevemente.
microplacas de fondo plano (Microtest II),
fueron predosificadas con concentraciones
crecientes de difosfato de cloroquina desde 1
hasta 64 pmoles de la droga. Cinco microlitros de sangre infectada fueron colocados en
cada una de las concentraciones de la droga
y en los controles sin cloroquina: posteriormente s e adicionaron 50 microlitros del
medio de cultivo (sin suero humano normal),
a los mismos orificios de la microplaca.
Luego de una ligera agitación, la microplaca
fue colocada en un desecador de vidrio con
una vela encendida para darle el ambiente
necesario de COZ y oxígeno y s e llevó a
incuhación por 24-38 horas, a 37-38°C.
Al concluir el período de incubación se
hicieron gotas g r u e s a s y se determinó el
número de esquizontes (parásitos maduros)
en los controles sin droga y en cada una de
l a s concentraciones de la cloroquina. El
recuento de esquizontes se hizo contra 300
leucocitos, o preferencialmente contra 200
parásitos. La susceptibilidad al sulfato de
quinina s e determinó mediante la misma
técnica a d a p t a d a en nuestro laboratorio
para este medicamento. Concentraciones
crecientes d e quinina desde 1 h a s t a 100
pmoles fueron colocados en los orificios de
las microplacas, siguiendo el procedimiento
anteriormente descrito para la cloroquina.
Microscopía Electrónica
Los estudios de microscopía electrónica
realizados con el fin d e d e t e r m i n a r la
presencia o ausencia de nodulaciones en la
membrana de los glóbulos rojos infectados,
han sido parcialmente desarrollados. Para
la cepa FCB-1, el análisis fue realizado por la
doctora Susan Langreth del Uniformed
Services University of the Health Sciences,
U.S.A. Siete c e p a s e s t á n e n proceso de
estudio en el Instituto Nacional de Salud.
RESULTADOS
La distribución geográfica de las cepas de
P. falciparum establecidas en cultivo, está
representada en la Fig. No. 1, incluyendo así*
4 de las principales áreas maláricas del país
con distintas características geográficas.
Los pacientes d o n a n t e s d e l a s 4 c e p a s
obtenidas en Bogotá, FCB-1, FCB-2 y 3M y
FCB-SV, tenían cuadros clínicos diferentes, y
su tratamiento fue establecido de acuerdo a
la severidad de la infección (Fig. No. 2). La
cepa FCB-1, proveniente del Caquetá. fue
obtenida del paciente identificado con la
historia clínica No. 195, el cual tenía una
infección aguda con un recuento de parásitos de 50.000 por microlitro d e s a n g r e ,
cuando se tomó la muestra para su establecimiento en cultivo. La infección respondió
bien a l tratamiento con sulfadoxinapirimetamina. Posteriormente, el paciente
regresó con otro tipo de infección, clasific a d a como u n a reinfección e n periódo
crónico debido al bajo recuento de parásitos
y a la presencia de- gametocitos en sangre
periférica. Esta reinfección cedió nuevamente a la combinación d e sulfadoxinapirimetamina, permaneciendo negativo por
30 días.
Las infecciones de los pacientes H-200 y
203. donantes d e l a s c e p a s FCB-2 y 3M
provenían del Departamento del Meta y de
los Municipios de S a n M a r t í n y Vista
Hermosa, respectivamente. Estas eran infecciones agudas, con alto recuento de parásitos y con algunas complicaciones clínicas,
especialmente en el paciente H-200, quien
presentó una insuficiencia renal aguda. Este
cuadro cedió con el tratamiento con dicloro-
AISLAMIENTO Y CARACTERlZAClON D E CEPAS COLOMBIANAS..
Fig. No. 1.
Distribución geográfica de las cepas de P. fnleipnrurn. Unidad Inmunología de
Malaria, l. N. S.
CARLOS ESPINAL T.. EDlTH MORENO. PATRlClA GUERRA. PATRlClA DE LA VEGA
hidrato de quinina I.V. y sulfadoxinapirimetamina, a d e m á s de una a d e c u a d a
hidratación y medidas de soporte.
La infección de la paciente H-203 se trató
inicialmente con cloroquina p a r e n t e r a l
(I.M.), 200mg cada 6 horas por 1 día, debido
a la no disponibilidad de c a m a s p a r a
hospitalización, impidiendo el tratamiento
c o i el diclorohidraio de quinina. La infección cedió dramáticamente a la medicación
elegida, mostrando una gran sensibilidad
in-vivo a la cloroquina, la cual fue corroborada mediante las pruebas in-vitro, 28 horas
después de iniciado el tratamiento [Cuadro
No. 1).La gametocitemia, como es lo normal
en el curso de una infección azuda. a ~ a r e c i ó
en ambos casos durante la segunda Semana
de infección.
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La cepa FCB-5V, proveniente del área de
Juanchaco, Valle, fue aislada de la paciente
H261 la cual tenía una infección aguda, con
alto recuento de parásitos pero sin manifestaciones importantes diferentes a la fiebre,
malestar general y escalofríos. Tratada con
200 mg de cloroquina I.M. cada 6 horas, la
parasitemia no presentó un descenso rápido,
ya que aún en el tercer día de tratamiento
tenía un recuento de 22.000 parásitos por
microlitro de sangre. Por este motivo y en
vista de la aparición de ictericia en piel y
mucosas y del descenso en su hematocrito,
se cambió s u medicación inicial p o r la
asociación de sulfadoxina-pirimetamina,
respondiendo bien tanto clínica como parasitológicamente. Las pruebas in-vitro mostraron una resistencia a la cloroquina de grado
moderado (Cuadro No. 1).
I C B ~ S "i H - 2 ó I 1
Susceptibilidad o los antimoláricos
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La sensibilidad in-vivo d e l a s c e p a s
FCB-1, 2, 3 y 5 a los t r a t a m i e n t o s establecidos durante el curso de la infección puede
observarse en la Figura No. 2, siendo las 4
infecciones sensibles a la combinación
sulfadoxina-pirimetamina, asociada a la
quinina en la FCB-2M, y a la cloroquina en la
FCB-3M.
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE CEPAS COLOMBIANAS.
El P. falciparum e s sensible in-vitro
cuando se inbibe su maduración entre 1 y 6
pmoles de cloroquina. La microtécnica
demostró un grado variable de resistencia
en 6 de las 8 cepas evaluadas y únicamente
2, provenientes una de Vista Hermosa, Meta
y otra de Buenaventura, Valle, mostraran
una gran sensibilidad a la droga (Cuadro No.
11.
La respuesta a la quinina también fue
variable en las cepas de diferentes áreas
geográficas, e incluso e n t r e l a s de una
misma región como e s el caso de l a s
infecciones aisladas en el Valle del Cauca;
sin embargo, todas fueron sensibles a la
droga in-vitro. (Cuadro No. 1).
P A R A S l TOS
RESISTENTES
O
A
3
El crecimiento del P. falciparum en cultivo
parece estar directamente relacionado con
la resistencia a los antimaláricos. Durante la
fase de adaptación de las cepas al sistema
del cultivo continuo s e observó u n mejor
crecimiento de las cepas resistentes (Fig. No.
3); las parasitemias fueron más elevadas en
los primeros 30 días de crecimiento, pero
una vez a d a p t a d a s a l cultivo, la multiplicación in-vitro fue similar en las sensibles y
en las resistentes a la cloroquina (Figs. Nos.
4 y 5). Se observó gametocitogénesis en todas
las cepas en tiempos diferentes durante la
fase de a d a p t a c i ó n y a ú n e n la f a s e de
PARAS ITOS
SENSl BLES
FCB
-1
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U)
Adaptación de las cepas al
sistema de cultivo continuo
o
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E folciporum
de
sensibles
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parósitcs de
y
resistentes
F i a hP-4 crecimiento de varias -as
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4
....... .
A d i ~ i Ó n da q l d b ~ l o rojos.
~
~ ~ ~ e t o c i t s ~ i a
de
5
folciparvm sn
-
cultivo
CARLOS ESPINAL T.. EDITH MORENO. PATRlClA GUERRA. PATRlClA DE LA VEGA
mantenimiento, con una buena maduración
de los gametocitos en cultivo.
Estudios de Microscopío Electrónico
Los eritrocitos infectados con parásitos
maduros de la cepa FCB-1 mostraron
nodulaciones de superficie (knobs), que
permiten clasificar la cepa como K+
[Microfotografías 1 y 2).
m
Ib4t444b44bb44b444b444bt4
FcB.6v
/
m
A
P
o
Fig. N' 5 . crecimiento
cwtinuo
~
...... .. ..
de variar sepas d. P. s l c i w r u m en c ~ t i r o
--
DISCUSION
La investigación en malaria ha sido
desarrollada principalmente con cepas de P.
folciporum obtenidas en Africa y en el Asia.
Estas líneas de parásitos fueron adaptadas y
mantenidas en primates del género Aotus
antes de ser establecidas en el sistema de
cultivo continuo y h a n sido ampliamente
distribuidas a los laboratorios de investigación, sin conservarse la población original
de los parásitos.
La necesidad de establecer nuevas cepas
con una historia conocida t a n t o sobre el
paciente donante como sobre su adaptación
in-vitro y en Aotus, representa un objetivo
prioritario en la red de laboratorios que
realizan investigaciones sobre inmunología
de la malaria. Unicamente 5 c e p a s d e P.
folciporum de diferentes áreas geográficas
del mundo incluyendo la FCB-1 de Colombia,
han sido seleccionadas como las cepas de
referencia, debido a l a s c a r a c t e r í s t i c a s
anteriormente s e ñ a l a d a s 191. La FCB-1.
además de su historia en cdlt'ivo. sensibilidad a los antimal6ricos y presencia d e
prominencias (Kf) e n la superficie d e los
eritrocitos infectados. tiene un alto nrado de
virulencia y desarrolla elevadas parasitemias en los Aotus (101, criterios necesarios
p a r a s u utilización en las p r u e b a s da
protección.
La reducida sensibilidad de las 8 cepas
colombianas a la cloroquina, revela la
amplia distribución d e este fenómeno y
corrobora los estudios in-vivo e in-vitro
realizados en Colombia [11.12]. La respuesta
in-vitro a la quinina e s a d e c u a d a a u n q u e
a ú n e s necesario definir los g r a d o s d e
resistencia en la microtécnica. La concentración inhibitoria de la maduración de los
parásitos está directamente relacionada con
la dosis de 7-10 mg/kg empleada p a r a e l
tratamiento de l a infección aguda por
P. folciporum. Hasta el presente ninguna de
las infecciones evaluadas para su sensibilidad a la quinina in-vitroha mostrado valores
en picomoles que superen la concentración
requerida in-vivo para el tratamiento de la
infección.
El hecho de que aparentemente las cepas
resistentes tienen un mejor crecimiento en
cultivo durante la fase de adaptación puede
tener un importante significado, d a d a la
rápida y amplia distribución de las cepas
resistentes en nuestro país. Es posible que en
una infección d e un paciente que tenga
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION D E CEPAS COLOMBIANAS
Microfotografía No. 1.
....
Nodulaciones (K+) en la superficie de un eritrocito infectado con
las formas segmentarias del P. foleipariim, cepa FCB-1 (x 30.000).
.--
1
Merozoitos
intracelulares.
125
CARLOS ESPINAL T.. EDlTH MORENO. PATRICIA GUERRA. PATRICIA DE LA VEGA
Microfotografía No. 2.
-,
Nodulaciones (Kt) en la superficie de u n eritrocito infectado con
un esquizonte joven de P. faleiparum, cepa FCB-1 (x 30.000).
126
AISLAMIENTO Y CARACTERlZAClON DE CEPAS COLOMBIANAS ....
poblaciones s e n s i b l e s y r e s i s t e n t e s d e
p a r á s i t o s , e l c r e c i m i e n t o in-vivo d e los
resistentes sea superior y elimine los parásitos sensibles.
Ha s i d o d e m o s t r a d o q u e e x i s t e n
poblaciones de parásitos sensibles y resistentes a la droga en una misma infección, ya
que tanto en nuestro laboratorio como en
otros sitios, algunas cepas han disminuído su
g r a d o d e s e n s i b i l i d a d o s e h a n vuelto
resistentes después de un tiempo de cultivo
prolongado (3). Debido a estos cambios en la
susceptibilidad a las drogas y a la desaparición de antigenos de superficie durante el
mantenimiento in-vitro, e s necesario efectuar congelaciones periódicas de las cepas,
reduciendo el tiempo de cultivo continuo a
4-6 m e s e s , con c o n t r o l e s f r e c u e n t e s d e l a
formación de nodulaciones y de sensibilidad
a los antimaláricos.
Dos de las 8 cepas con gametocitogénesis
e s p o n t á n e a , l a FCB-2M y l a FCB-8V. h a n
demostrado una gran producción de gametocitos siguiendo v a r i a s d e l a s t é c n i c a s
descritas para el desarrollo de estas formas
en cultivo (13). Este e s un paso indispensable
para una continua producción de esporozoitos d e P. f o l c i p o r u m e n el l a b o r a t o r i o .
Mediante los métodos de alimentación artific i a l a t r a v é s d e m e m b r a n a s , e s posible
infectar los mosquitos del género Anopheles
con el cultivo q u e c o n t i e n e l a s f o r m a s
s e x u a l e s m a d u r a s d e l p a r á s i t o (4), r e d u ciendo el número de primates infectados que
son necesarios p a r a el desarrollo del ciclo
esporogónico del Plosmodium.
Las cepas de P. falciparum obtenidas en
d i s t i n t a s regiones d e Colombia, p u e d e n
representar el patrón de referencia necesario p a r a el análisis comparativo del comportamiento d e l P. f o l c i p o r u m e n d i f e r e n t e s
á r e a s maláricas.
and the history of the isolate, the adaptahility in c u l t u r e . t h e s p e c t r u m of d r u g
sensitivity, the normal morphology including
knobs f o r m a t i o n (K-), t h e a v a i l a h i l i t y of
samples of original infected hlood a n d the
adaptahility in Aotus monkeys.
On this basis eigth isolates of P. folciporum
from Colombia have been partilly charact e r i z e d . To d a t e , o n e s t r a i n . t h e FCB-1,
fulfills most of the above criteria a n d is well
adapted to intact Aotus monkeys, producing
very virulent infections.
Chloroquine-resistant strains a p p e a r to
develop h i g h e r p a r a s i t e m i a s d u r i n g t h e
adaptation to continuous culture. This may
be a n important fact due to the rapid spread
of p o p u l a t i o n of p a r a s i t e s r e s i s t a n t t o
chloroquine.
AGRADECIMIENTOS
Los a u t o r e s d e s e a n e x p r e s a r s u s
agradecimientos a la Doctora S u s a n
Langreth del Uniformed Services University
of the Health Sciences, U.S.A., por su trabajo
en microscopía electrónica de la cepa FCB-1.
Asimismo, agradecemos al personal técnico
de la Unidad de Inmunología de Malaria por
s u c o o p e r a c i ó n e n el d e s a r r o l l o d e e s t e
trabajo y a las señoritas Angela Quintero y
Elizaheth Rojas R. por su colaboración e n la
preparación de este manuscrito.
Este trabajo ha sido realizado con fondos
del subcontrato AID/DSP-E-D-0036 con la
U n i v e r s i d a d d e New Mexico, U.S.A. y e l
Instituto Nacional d e Salud, Bogotá.
1. Lanprcth S et al. P i a r m o d i u m I a l c i p a r u m : L O S = of knobs
on +he infacted erythrocyte i u r f a c e after long-tsrm
SUMMARY
The selection of strains of P. folciparum
wich a r e to be used in antigenic analysis and
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characterization that includes the following
criteria: The clinical history of the patient
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