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HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN DE YUCA MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE PREPARACIONES SOLUBLES E INSOLUBILIZADAS DE ALFA-AMILASA (Aspergillus niger) A. Peña, D. Molina & R. Torres*, PhD. Universidad Industrial de Santander, Calle 9 nº27 Ciudad Universitaria, Colombia *E-mail de correspondencia: [email protected] Resumen- Se comparó el efecto en la hidrólisis enzimática del almidón de yuca por la enzima alfa- amilasa de Aspergillus niger en forma soluble e insolubilizada como biocatalizador para el proceso. Con este propósito, se optimizaron las condiciones de pH y temperatura tanto para la actividad como estabilidad térmica de la enzima; así como el efecto del cofactor Ca+2 sobre la actividad de alfa-amilasa. Se determinaron las constantes de inactivación frente a la temperatura y los parámetros cinéticos Vmáx y Km del biocatalizador. La insolubilización consistió en la síntesis de agregados entrecruzados de alfa-amilasa (CLEA) en el que se utilizó propanol como agente precipitante y glutaraldehído como agente entrecruzante, con el fin de brindar rigidez a la enzima y poderla separar fácilmente del medio de reacción. Se determinaron los principales factores que afectaron la actividad catalítica permitiendo comparar la enzima soluble e insolubilizada estableciendo que el proceso de insolubilización afecta de forma desfavorable la catálisis y la estabilidad enzimática. Palabras clave: alfa-amilasa, almidón, inmovilización enzimática, agregados entrecruzados de enzima (CLEAs). Abstract: This study was carried out hydrolyzing starch by alpha amylase enzyme from Aspergillus niger in its soluble form. With this purpose, pH and temperature conditions were optimized; thermal stability and CaCl2 cofactor effect on the alpha-amylase activity was determined. Besides, it was established the thermal inactivation constants and the kinetic parameters Km and Vmáx of the alpha-amylase. Furthermore, the insolubilisation of the enzyme was carry out by the cross linked enzyme aggregates technique in order to provide rigidity to the alpha-amylase and easy separability from their reaction media; during this procedure propanol was used as precipitant agent and glutaraldehyde was used as the cross linker. With the experimental design developed for the insolubilisation technique, the main factor that affects the catalytic activity were identified, letting compare the soluble and insoluble enzyme, establishing that the process of insolubilisation adversely affects the stability and enzymatic catalysis. Keywords: alpha amylase, starch, enzyme immobilization, cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009 1 INTRODUCCIÓN Las enzimas en general exhiben una excelente especificidad y regio-selectividad de sustrato por lo que ha incrementado su demanda especialmente de compuestos ópticamente puros, además estos procesos de biotransformación se llevan a cabo bajo condiciones suaves de reacción reduciendo costos de producción [1]. Los procesos enzimáticos muestran plenamente su potencial en el campo de los carbohidratos, porque tienen el control regio-y-estereoespecífico, lo cual los hace superiores frente a las mismas reacciones catalizadas por tratamientos químicos [1], [2]. 1.1 Almidón El almidón es un polímero de glucosa unido por enlaces glucócidos. Este enlace es estable a pH alto pero hidrolizado a pH bajo. Al final de la cadena polimérica se encuentra un grupo aldehído conocido como el grupo reductor. [3]. El almidón está constituido por dos tipos de polímeros: la amilosa y la amilopectina (Fig. 1). La amilosa es un polímero lineal de aproximadamente 6000 unidades de glucosa con enlace α,1-4 glucosído. La amilopectina posee cadenas lineales cortas α,1-4 de 10-60 unidades de glucosa y de cadenas laterales α,1-6 con 15-45 unidades de glucosa. El número promedio de puntos de ramificación es del 5%. La molécula completa de amilopectina contiene aproximadamente 2 000 000 unidades de glucosa, por lo que es considerada una de las moléculas más grandes de la naturaleza [3], [4], [8]. Fig. 1. Estructura del almidón 1.2 Enzimas de conversión de almidón Básicamente existen cuatro grupos de enzimas en el proceso de conversión del almidón: (i) endoamilasas, (ii) exoamilasas; (iii) enzimas desramificadoras y (iv) transferasas [3]. Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 2 “Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible” Las endoamilasas son capaces de hidrolizar enlaces α,1-4 glucosídicos en la parte interior de la cadena de la amilosa o de la amilopectina. La alfa-amilasa es la endoamilasa más conocida. Los productos finales de hidrólisis por la alfa-amilasa, son oligosacáridos con longitud variable en configuración α, y dextrinas con límite- α que constituyen oligosacáridos ramificados [5]. En el segundo grupo, la exoamilasas, rompen enlaces α,1-4 glucosídicos (β-amilasa), o hidrolizan enlaces α,1-4 y α,1-6 glucosídicos (glucoamilasa y α-glucosidasa). Las exoamilasas actúan en los residuos externos de glucosa de la amilosa o amilopectina, por tanto el producto es glucosa o maltosa [3], [5]. Las enzimas amilolíticas unen los residuos glucósidos del sustrato en una serie de subsitios consecutivos que se extienden en toda la hendidura del sitio activo donde se lleva a cabo la reacción. Las enzimas desramificadoras hidrolizan exclusivamente enlaces α,1-6 glucósido (isoamilasa y pullanasa tipo I). Los principales productos son la maltosa y la maltotriosa [3], [7]. Las transferasas hidrolizan un enlace α,1-4 glucósido de la molécula donador y la transfiere al aceptor con la formación de un nuevo enlace glucósido [3]. 1.3 Alfa-amilasa La alfa-amilasa pertenece a la familia 13 glicosil hidrolasas (GH 13), de acuerdo con la clasificación de Henrissat (1991). En esta familia se comparte un grupo de características comunes tales como, una estructura (β/α)8 barril, la hidrólisis o formación de enlaces α-glucósido y un número de aminoácidos definido en el sitio activo. El mecanismo catalítico establecido para la familia α-amilasa incluye dos tipos de reacciones SN2; los aminoácidos que intervienen en la catálisis son Glu 230 que actúa como donador de protón seguido de un ataque nucleofílico por el Asp 206 [1], [3], [6]. La alfa-amilasa se compone de una cadena polipeptídica plegada en tres dominios: A, B y C. El A es el dominio catalítico (β/α)8 barril, y los dominios B y C se encuentran aproximadamente a los lados opuestos de este TIM-barril [8] (Fig. 2.). Fig. 2. Representación esquemática de la estructura en 3D de la alfa-amilasa; obtenida de banco de datos de las proteínas (PDB) Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 3 Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009 La alfa-amilasa es una enzima que requiere de la presencia de un cofactor (Ca+2) para mejorar su actividad catalítica. Con la visualización de la estructura trimensional de la enzima se conoce que el ión Ca+2 se ubica en la interfase formando puente iónico entre los dominios A y B lo que estabiliza la hendidura del sitio activo [8], [9]. 1.4 Inmovilización de enzimas La inmovilización de enzimas ha encontrado grandes aplicaciones en la vida científica [10] [3]. Varios procedimientos han sido desarrollados y diferentes biocatalizadores se han comercializado aplicando las técnicas de inmovilización. Se entiende por enzima inmovilizada aquella física o químicamente asociada a un soporte o una matriz que no es esencial para su actividad [11]. Las enzimas son usualmente inmovilizadas al soporte a través de algún tipo de interacción entre los residuos aminoacídicos de la molécula proteica y el soporte [12]. Los agregados entrecruzados de enzima (CLEA) han surgido como una nueva y versátil técnica de inmovilización de enzimas tanto en ambientes acuosos como no-acuosos [13], [14]. El CLEA se obtiene por la agregación de la enzima empleando un agente precipitante y finalmente se da el entrecruzamiento proteico por medio de reactivos bifuncionales como el glutaraldehído, el cual forma preferentemente enlaces covalentes con los residuos de lisina de la enzima [10], [15], [16]. El presente trabajo describe los resultados de la optimización de las condiciones cinéticas de hidrólisis de almidón de yuca por la enzima alfa amilasa, en su forma soluble e inmovilizada. 2 MATERIALES Y MÉTODO 2.1 Materiales Alfa-amilasa (Aspergillus niger) donada por NovoScience, el almidón de yuca fue provisto por Promisión S.A. Se empleó, ácido 3,5-dinitrosalicilico, Tartrato de Sodio y Potasio, Hidróxido de Sodio, Azul de Coomassie, Acetato de Sodio, Cloruro de Calcio, Propanol, y glutaraldehído; fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St.Louis, USA). Las mediciones de absorbancia fueron hechas en un espectrofotómetro marca Spectronic 20 Génesis. Para cuantificar azucares reductores se empleó el método del DNS (3,5-dinitrosalicílico) el cual se basa en la reacción de oxido-reducción 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílato [20]. El valor de absorbancia se leyó a una longitud de onda de 540nm y se se interpoló a la curva de calibración la cual se hizo con glucosa comercial. La concentración de proteína de la enzima soluble se determinó empleando el método colorímetro del Bradford (595nm) [19], el valor de Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 4 “Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible” absorbancia se extrapoló a la curva de calibración que se hizo empleando como patrón interno albúmina de suero bobino. 2.2 Inmovilización enzimática El proceso de elaboración de agregados entrecruzados de enzima alfa-amilasa, se realizo empleando la metodología que describe Sheldon y colaboradores [14], [15]. Para la elaboración de los CLEAs se realizó un diseño experimental multifactorial multinivel 33; los pasos se dividieron en dos etapas: Etapa de precipitación, utilizando propanol para agregar la enzima; y Etapa de entrecruzamiento, adicionando el reactivo bifuncional glutaraldehído. Luego se separó el CLEA por centrifugación y se midió la proteína contenida en el CLEA por el método de Bradford [19]. 2.3 Actividad de la alfa-amilasa soluble e inmovilizada El efecto del pH en la actividad de la enzima fue estudiado en un rango de pH 3.0-7.0. Se hicieron preparados enzimáticos, incubados en solución buffer acetato de sodio 16mM a diferentes valores de pH y se empleó como sustrato almidón de yuca. Para determinar el rango de linealidad se hizo incubando la enzima por diferentes períodos de tiempo de reacción observando la eficiencia de la catálisis. Para cuantificar los productos de reacción se empleó el método de azucares reductores [20], y para determinar la concentración de proteína el método de Bradford [19]. 2.4 Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima soluble e inmovilizada El efecto de la temperatura se evaluó en un rango de 45-60ºC. Para esto se incubó la enzima a las diferentes temperaturas en un baño de agua termostatado por periodos de tiempo hasta de 2 horas. Para observar la variación de la actividad catalítica de la enzima por el calentamiento, se tomaron alícuotas a intervalos de tiempo y se evaluó la actividad sobre la hidrólisis del almidón de yuca. . Para cuantificar los productos de reacción se empleó el método de azucares reductores [20]. Con los datos obtenidos se determinaron las constantes de inactivación. 2.5 Determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmáx para la alfa-amilasa soluble e inmovilizada Para determinar las constantes cinéticas se tuvo en cuenta la velocidad de reacción inicial de la enzima con la solución de almidón de yuca utilizando diferentes concentraciones de sustrato (0.540 mg/ml) y en condiciones óptimas de reacción. Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 5 Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009 3 RESULTADOS 3.1 Efecto del Ca+2 en la actividad de la enzima alfa-amilasa Para determinar la influencia del cofactor lo primero que se hizo fue observar el efecto de pH sobre la enzima; para esto se incubo la enzima en un rango de pH cuyos valores variaron entre 3 y 7 (Fig.3), estableciendo que el pH óptimo para la alfa-amilasa soluble es de 4.7 expresando un valor de actividad específica de 535 (U/mg). Fig. 3. Determinación del pH óptimo para la alfa-amilasa soluble. Se observó un efecto positivo del cofactor empleado (ión Ca+2), sobre la actividad específica de la enzima alfa-amilasa [3], [6]. Cuando la enzima cataliza en ausencia del cofactor el descenso de actividad es aproximadamente de la mitad en comparación con la actividad de la misma en presencia del ión Ca+2 [6]. (Fig.4). Fig. 4. Efecto del ión Ca+2 en la actividad de la alfa-amilasa soluble. Esto indica que la estructura terciaria de la enzima requiere del ión Ca+2 para mejorar la catálisis sobre el sustrato ya que este está permitiendo establecer el puente iónico entre los dominios A y B que intervienen en la catálisis, lo cual garantiza que a medida que la enzima realiza su función, el sitio activo no está cambiando su configuración y por ende la hendidura del sitio activo está más rígida, lo que permite que se exprese una mejor actividad y la enzima sea más estable en el tiempo de reacción [8]. Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 6 “Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible” 3.2 Eficiencia de la inmovilización Con los resultados estadísticos obtenidos del diseño de experimentos, empleando propanol como agente precipitante y glutaraldehído como agente entrecruzante, se obtuvo que la inmovilización por medio de la técnica de elaboración de agregados entrecruzados de enzima (CLEA) bajo las diferentes condiciones de estudio, mostró descenso drástico en la actividad aproximadamente del 90%, frente a la enzima soluble. Empleado el programa Statgraphis 5.1 se realizó un análisis de varianza ANOVA con el fin de identificar las variables significativas estadísticamente en el proceso de elaboración de agregados entrecruzados. Haciendo uso del diagrama de Pareto (Fig. 5), se estableció que la variable que tiene un efecto significativo y de forma desfavorable es la concentración del solvente orgánico. Esta variable se obtuvo un valor de P= 0,0068 para un intervalo de confianza del 95%. Gráfico de Pareto estandarizado para actividad B:precipitante BB A:[proteina] AB CC AC C:glutaraldehido BC AA + - 0 1 2 3 4 Efectos estandarizados Fig. 5. Gráfico de Pareto obtenido después del diseño experimental multinivel 33 para los CLEAs Entre las posibles razones se encuentra que el solvente orgánico empleado como agente precipitante afectó directamente el microambiente acuoso que posee la enzima, de tal forma que se pudo presentar desnaturalización o cambio conformacional ya que los aminoácidos que estan especialmente en el sitio activo de la enzima se ven afectados por las fuerzas intermoleculares que genera el solvente [11], [17]. Otra posible razón puede ser por la restricción difusional que se genera al entrecruzar la enzima y que el sustrato no puede acceder de la misma forma al sitio activo puesto que el almidón de yuca es una molécula muy grande [11]. 3.3 Efecto de la temperatura en la actividad La actividad de la enzima soluble fue ensayada a varias temperaturas entre el rango de temperatura de 35-60ºC (Fig. 6). El máximo de actividad para la enzima soluble se observó a 50ºC. Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 7 Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009 Fig. 6. Influencia de la temperatura en el porcentaje de actividad relativa de la alfa-amilasa soluble Evidentemente la actividad de la enzima se perderá más rápidamente a mayor temperatura dada su inherente labilidad; por tanto este fenómeno de inactivación térmica puede ser modelado en función de una constante de inactivación [11]. Las constantes de inactivación para la enzima soluble son: a 45ºC k=0,048 min-1, 50ºC k=0,072min-1, 55ºC k=0,127min-1. Considerando los valores de las constantes de inactivación, se puede confirmar que el aumento de temperatura disminuye la estabilidad de la enzima; sin embargo aunque la alfa-amilasa sea más estable en el tiempo a 45ºC la actividad de la misma es superior a 50ºC con un valor de 519 U/mg frente un valor de 535 U/mg respectivamente. 3.4 Estudios cinéticos Las propiedades cinéticas de la enzima libre e inmovilizada fueron evaluadas usando almidón soluble como sustrato. La constante de Michaelis-Menten Km y el valor máximo de actividad Vmáx de la enzima soluble y el CLEA fue estimada a pH 4,7 y 50ºC. Los valores encontrados para Km fueron 10 y 6,7 mg/ml, respectivamente. El valor más pequeño de la Km indica que hay mayor afinidad por el sustrato [10]; en este caso se puede establecer que el menor valor de la constante no se debe a la afinidad del CLEA por el almidón sino posiblemente por las restricciones difusionales que se presentan impidiendo que el sustrato entre fácilmente al sitio activo de la enzima y se lleve a cabo la transformación [18]; esto debido a que los valores de Vmáx son inversos ya que son 1000 y 1,27 U/mg, respectivamente. Por tanto considerando las restricciones difusionales que se tienen en cuenta para la enzima inmovilizada y el gran tamaño molecular del sustrato se puede decir que la enzima alfa-amilasa libre es la que mejor afinidad tiene por el sustrato, indicando además que el complejo ES estará más fuertemente enlazado y no se disociará sin llevarse a cabo la transformación y dar lugar al producto [18]. Esto se evidencia comparando la velocidad máxima de catálisis en cada caso. Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia 8 “Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible” 4. CONCLUSIÓN Los ensayos demostraron que la inmovilización de la alfa-amilasa desde ningún punto de vista es adecuada por medio de la técnica de elaboración de agregados entrecruzados enzimáticos CLEA. Para la técnica de inmovilización, se pudo establecer cuál fue la variable que influyó directamente en el proceso, concretamente el propanol empleado como agente precipitante en la elaboración de los CLEAs afectó negativamente la actividad enzimática. Con la estimación de los parámetros cinéticos se reflejó una marcada disminución de la velocidad máxima de catálisis para la alfa-amilasa inmovilizada respecto a la enzima soluble. Así mismo se pudo obtener los valores óptimos para la elaboración del CLEA permitiendo maximizar la actividad catalítica de la enzima alfa-amilasa inmovilizada. 5. REFERENCIAS [1]. Seibel, J.; Buchholz, K. 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