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Departamento de Fisioloxía Vexetal
Facultade de Bioloxía
Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la
pared celular de Arabidopsis thaliana
Natalia Iglesias Méndez
Santiago de Compostela, 2008
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTADE DE BIOLOXÍA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOXÍA VEXETAL
Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de Arabidopsis thaliana
Memoria que presenta para optar al grado de Doctora en Biología
NATALIA IGLESIAS MÉNDEZ
Santiago de Compostela, 2008
Los doctores D. Ignacio Zarra Cameselle, catedrático de Fisiología Vegetal de la Universidad
de Santiago de Compostela, y Dña. Gloria Revilla López, profesora titular del Departamento
de Fisiología Vegetal de la Universidad de Santiago de Compostela
CERTIFICAN QUE:
D. Natalia Iglesias Méndez realizó bajo nuestra dirección, en el Departamento de Fisiología
Vegetal de la Facultad de Biología (Universidad de Santiago de Compostela), el trabajo
titulado “Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de Arabidopsis
thaliana”, que presenta para optar al grado de Doctora en Biología.
El Director
La Directora
Fdo: Ignacio Zarra Cameselle
Fdo: Gloria Revilla López
La Doctoranda
Fdo: Natalia Iglesias Méndez
Capítulo I: Introducción general
I.1. Introducción general………………………………………………………………………….1
I.2. Objetivos……………………………………………………………………………………..28
Capítulo II: β-glucosidasas de Arabidopsis thaliana
II.1. Introducción………………………………………………………………………………...31
II.2. Materiales y métodos……………………………………………………………………….33
II.2.1. Material vegetal……………………………………………………………..........33
II.2.2. Análisis filogenético……………………………………………………………...35
II.2.3. Extracción de RNA total…………………………………………………...…….35
II.2.4. Síntesis de cDNA…………………………………………………………………36
II.2.5. PCR semi-cuantitativa en tiempo real…………………………………………..36
II.2.6. Obtención del extracto apoplástico……………………………………………...38
II.2.7. Preparación de XXXG……………………………………………..……………..38
II.2.8. Actividad apoplástica frente a XXXG……………………………………………38
II.2.9. Siembra de mutantes……………………………………………………………..39
II.2.10. Análisis de paredes celulares de hojas………………………………………….39
II.2.11. Análisis de oligosacáridos de xiloglucano: MALDI-TOF MS………………….40
II.2.12. Análisis de componentes principales…………………………………………..40
II.3. Resultados y discusión……………………………………………………………………...41
II.3.1. β-glucosidasas de la familia 3 de las glicosil hidrolasas en Arabidopsis
thaliana…………………………………………………………………………………………...41
II.3.2. PCR semi-cuantitativa en tiempo real…………………………………………..43
II.3.3. Actividad apoplástica frente a XXXG……………………………………………45
II.3.4. Análisis de mutantes knockout mediante MALDI-TOF MS…………………...47
II.3.5. Análisis de componentes principales………………………………………........49
Capítulo III: Estudio de mutantes knockout de las β-glucosidasas de Arabidopsis thaliana
III.1. Introducción………………………………………………………………………………..55
III.2. Materiales y métodos………………………………………………………………………57
III.2.1. Material biológico utilizado…………………………………………………….57
III.2.2. Actividad β-glucosidasa frente a xiloglucano…………………………………..57
III.2.3. Extracción de DNA……………………………………………………………...58
III.2.4. Análisis de los mutantes mediante PCR………………………………………..58
III.2.5. Niveles de transcritos…………………………………………………………...60
III.2.6. Análisis fenotípico de los mutantes seleccionados…………………………..…60
III.2.7. Amplificación de la región promotora de los genes de interés………………..61
III.2.8. Clonación en el vector pCambia 1381z T-DNA………………………………..61
III.2.9. Transformación de Agrobacterium tumefaciens por electroporación…...........63
III.2.10. Transformación de Arabidopsis thaliana…………………………………...…64
III.2.11. Selección y cultivo de plantas………………………………………………....64
III.2.12. Tinción y fijado de las muestras………………………………………….........64
III.2.13. Fijación e inclusión de muestras para microscopía…………………………...65
III.3. Resultados y discusión……………………………………………………………………..66
III.3.1. Actividad de los mutantes knockout frente al sustrato XXXG………………...66
III.3.2. Análisis del mutante Atbglc1 4D mediante PCR…………………………........69
III.3.3. Expresión del gen AtBGLC2 en el mutante Atbglc1 4D……………………….71
III.3.4. Análisis fenotípico de los mutantes del gen AtBGLC1………………………...72
III.3.5. Análisis de expresión de los genes AtBGLC1 y AtBGLC2……………………..75
III.3.6. Fenotipo histológico del mutante Atbglc1 4D……………………………........77
Capítulo IV: β-galactosidasas de Arabidopsis thaliana
IV.1. Introducción………………………………………………………………………….........85
IV.2.Materiales y métodos………………………………………………………………….........88
IV.2.1. Árbol filogenético de las β-galactosidasas……………………………………...88
IV.2.2. Material vegetal……………………………………………………………........88
IV.2.3. PCR semi-cuantitativa en tiempo real…………………………………….........91
IV.2.4. Obtención del extracto apoplástico…………………………………………….92
IV.2.5. Preparación de sustratos: XLLG y XLFG……………………………………….92
IV.2.6. Análisis de paredes celulares de hojas………………………………………….93
IV.2.7. Análisis de oligosacáridos mediante MALDI-TOF…………………………….94
IV.2.8. Análisis de componentes principales…………………………………………...94
IV.2.9. Análisis de la actividad β-galactosidasa de los mutantes…………………........94
IV.2.10. Análisis fenotípico de los mutantes seleccionados……………………………95
IV.2.11.
Análisis
bioinformático
de
expresión
de
las
diferentes
β-
galactosidasas…………………………………………………………………………….96
IV.3. Resultados y discusión……………………………………………………………………..97
IV.3.1. β-galactosidasas de la familia 35 de las glicosil hidrolasas de Arabidopsis
thaliana…………………………………………………………………………...……...97
IV.3.2. Análisis bioinformático de expresión de las β-galactosidasas de Arabidopsis
thaliana……………………………………………………………………………..........98
IV.3.3. PCR semi-cuantitativa en tiempo real…………………………………...........101
IV.3.4. Análisis de los mutantes knockout de β-galactosidasas mediante MALDI-TOF
………………………………………………………………………………….103
IV.3.5. Análisis de componentes principales………………………………………….105
IV.3.6. Análisis mediante MALDI-TOF de la actividad β-galactosidasa……………..106
IV.3.7. Análisis fenotípico de los mutantes seleccionados……………………………111
Capítulo V: Discusión general………………………………………………………………….119
Capítulo VI: Conclusiones……………………………………………………………..……….126
Bibliografía……………………………………………………………………………………...131
General
ral
Capítulo I: Introducción Gene
Capítulo I: Introducción General
I.1. Introducción general
las células adyacentes se unen, esta extensión
Pared Celular Vegetal
coordinada es necesaria. En principio el
Las células de las plantas están rodeadas por
mecanismo de extensión de la pared está
una resistente, flexible y polimérica pared que
determinado genéticamente, pero además, debe
determina su forma (Bacic y col., 1988) y su
ser capaz de responder a cambios ambientales,
tamaño. Les permite soportar una alta presión
para que la planta pueda adaptarse a las
para que puedan desarrollarse y les confiere
condiciones variables de su entorno.
importantes
propiedades
mecánicas,
La pared celular es la principal estructura
contribuyendo a mantener la integridad de la
implicada en procesos de crecimiento celular
planta completa. De hecho, las propiedades
en plantas, puesto que en ella se llevan a cabo
físicas de los distintos tejidos vegetales están
los procesos de incorporación y reorganización
determinadas
la
de nuevos materiales, y está formada por una
composición y estructura de sus paredes
serie de capas. La primera que se forma es la
celulares.
lámina media, constituida por polisacáridos
en
gran
medida
por
Aunque inicialmente se consideró la pared
pécticos y responsable de la unión entre las
celular como una estructura rígida e inerte, con
células. Posteriormente entre la lámina media
posterioridad se comprobó que puede estar
y la membrana plasmática se deposita la pared
implicada en gran cantidad de procesos
celular primaria, que se forma en los estados
dinámicos. La presión osmótica aporta rigidez a
juveniles y posee capacidad de extensión,
las células mediante la tensión que crea sobre la
incrementando
pared. Cada célula está adherida a la adyacente
durante el crecimiento celular (Hayashi, 1989).
mediante
que
En algunos tipos celulares especializados se
normalmente evitan que las células se separen
deposita una tercera capa por debajo de la
bajo presiones elevadas. Las paredes celulares
pared celular primaria que es la pared celular
son capaces de llevar a cabo modificaciones
secundaria, más rígida y que ya no posee
controladas que permitan a la célula crecer de
capacidad de crecimiento (Brett y Waldron,
forma polarizada. Debido a que las paredes de
1996) (Fig. I.1).
polisacáridos
pécticos
rápidamente
su
superficie
1
Capítulo I: Introducción General
Figura I.1. Disposición de la pared celular primaria, lámina media y pared celular secundaria. Adaptado de
http://www.biologia.edu.ar
Ambos tipos de pared difieren además en
su composición, ya que la pared celular
que la pared aporta fuerza, extensibilidad y
capacidad de modulación a la célula.
primaria está compuesta mayoritariamente por
celulosa, hemicelulosas, pectinas y en menor
Pared Celular Primaria
proporción proteínas y bajos niveles de lignina,
La pared celular primaria de dicotiledóneas
en cambio, la pared celular secundaria presenta
tipo I, como Arabidopsis thaliana, se define
diferente composición dependiendo del tejido
como una estructura polimérica y altamente
al que pertenezca, y en general presenta altos
organizada formada por una red tridimensional
niveles de lignina, que le aporta rigidez. Por lo
de microfibrillas de celulosa embebidas en una
tanto, para estudiar el crecimiento de las
matriz compleja y altamente hidratada de
células vegetales debemos centrarnos en la
polisacáridos
pared celular primaria, debido a su capacidad
proteínas (estructurales y enzimáticas), y
de extenderse bajo la acción de la presión de
fenoles.
En
algunos
tipos
celulares
turgencia permitiendo el incremento del
especializados
también
están
presentes
volumen celular. Se puede afirmar entonces
sustancias como la lignina, cutina, suberina o
(hemicelulosas
sílice (Fry, 2004) (Fig. I.2).
2
y
pectinas),
Capítulo I: Introducción General
Figura I.2. Estructura de la pared celular primaria, se muestra la unión entre las cadenas de XyG (rojo) y las
microfibrillas de celulosa (lila), además de la red de pectinas (amarillo) y de proteínas fibrilares (negro) y
solubles (circulares).
En
general,
que
puentes de calcio entre las cadenas de
aproximadamente el 90% del peso seco de las
homogalacturonano (Jarvis, 1984) o puentes
paredes celulares primarias correspondería a los
difenil entre arabinogalactanos.
polisacáridos
se
considera
(celulosa,
y
Entre las funciones de la pared primaria en
pectinas) mientras que el 10% restante
las células vegetales, está la de conferir
correspondería a las proteínas (estructurales y
protección mecánica a la célula, regulando al
enzimáticas). Las microfibrillas de celulosa está
mismo tiempo su forma y su volumen (Bacic y
interconectadas
de polisacáridos
col., 1988). Constituye un soporte físico,
hemicelulósicos como el xiloglucano (XyG) o el
aportándole a la célula cierto grado de rigidez
arabinoxilano
red
(Taiz, 1984). Actúa como defensa frente al
Gibeaut,
ataque de patógenos y como barrera reguladora
a
través
dando
celulosa/hemicelulosa
1993).
Existe
polisacáridos
hemicelulosas
otra
pécticos
lugar
(Carpita
red
a
una
y
formada
por
(homogalacturonano,
de procesos de transporte (Goldberg, 1985).
Puede
actuar
además
como
lugar
de
ramnogalacturonano I y ramnogalacturonano
almacenamiento de reservas (Reid, 1984), o
II y arabinogalactanos), que contribuyen a la
como fuente de moléculas con actividad
rigidez de la pared mediante enlaces por
biológica (Ryan, 1990).
3
Capítulo I: Introducción General
Celulosa
lineales (Delmer, 1999), con un diámetro de
La celulosa es el componente mayoritario
entre 5 y 15 nm (Mccann y col., 1990b). No se
de las paredes celulares de las plantas
conoce con exactitud la longitud de las
superiores, se estructura en forma de cadenas
microfibrillas de celulosa, puesto que es
lineales no ramificadas constituidas por restos
variable,
de glucosa unidos mediante enlaces β(1-4), con
contienen más de 14000 unidades de glucosa,
una rotación de 180° entre un resto y el
lo que correspondería a una microfibrilla de
siguiente, estabilizados mediante puentes de
aproximadamente 7 μm (Fig. I.3).
pero
algunos
glucanos
simples
hidrógeno intramoleculares. Estas cadenas
La biosíntesis de celulosa tiene lugar en la
lineales de glucosa se disponen paralelamente
superficie externa de la membrana plasmática,
unidas entre si mediante puentes de hidrógeno
catalizada por un complejo multienzimático
dando lugar a microfibrillas, cada una de las
que consta de 6 subunidades en forma de roseta
cuales tiene aproximadamente 36 cadenas
(Fig. I.4).
Figura I.3. Estructura de las microfibrillas de celulosa, formadas por restos de glucosa, que forman parte de
pared celular. Adaptado de http://www.ualr.edu
4
Capítulo I: Introducción General
Figura I.4. Las microfibrillas de celulosa son sintetizadas por complejos enzimáticos situados en la membrana
plasmática. Estos complejos están formados por moléculas de celulosa sintasa que se disponen formando
rosetas embebidas en la membrana. Las microfibrillas se van alargando por el extremo por el que están unidas
a las rosetas. Las rosetas a su vez, se mueven por la membrana guiadas por microtúbulos que se encuentran en
la cara interior de esta.
Cada subunidad estaría formada a su vez
su unión con los microtúbulos para que puedan
por seis celulosa sintasas, capaces de utilizar
ser guiados a lo largo de la membrana (Lloyd y
UDP-glucosa como sustrato y unirlo al extremo
Chan, 1989). Cada una de las proteínas CesA
no reductor de la cadena de β-glucano (Brown
que constituye una roseta sintetizaría las 6
y Saxena, 2000). Con 36 subunidades, cada
cadenas de glucano simultáneamente, de
roseta podría producir 36 cadenas de celulosa
manera, que a partir de cada roseta se
simultáneamente, que se organizarían a la
formarían las 36 cadenas mencionadas (Brown
salida de la roseta para dar lugar a la
y Saxena, 2000). Es posible que hemicelulosas
microfibrilla. A finales de los 90 fueron
como
identificados los genes de la celulosa sintasa
microfibrillas
(CesA) (Pear y col., 1996), en Arabidopsis
provocando regiones desordenadas (Hayashi,
thaliana. La familia CesA cuenta con 10 genes,
1989).
que se expresan en distintos tejidos y tipos
recientes iniciaría la cadena de glucano es un
celulares.
Estas
están
esterol-glucósido que funcionaría como aceptor
embebidas
en
plasmática
inicial para la elongación de la cadena. Los
formando las agrupaciones hexagonales que
esteroles son componentes lipídicos de las
dan lugar a las denominadas rosetas (Kimura y
membranas celulares vegetales y los esterol-β-
col., 1999). Los complejos celulosa sintasa
glucósidos son comúnmente sintetizados en las
deben contener otras proteínas que favorezcan
membranas plasmáticas, donde las proteínas
proteínas
la
CesA
membrana
el
La
XyG
sean
atrapadas
durante
molécula
que
su
en
las
formación,
según
estudios
5
Capítulo I: Introducción General
CesA pueden usar un esterol-glucósido y
irregular. Por lo tanto la localización de las
uridina 5’-difosfato-Glc para formar glucanos
microfibrillas no es al azar sino funcional, ya
cortos unidos a esterol (Peng y col., 2002). Esta
que un alineamiento perpendicular de las
teoría se ve apoyada por el hecho de que
mismas es propicio para un crecimiento
defectos en la síntesis de esterol provocan una
longitudinal de la célula (Carpita y Gibeaut,
reducción en el contenido de celulosa de la
1993). Es probable que la disposición de las
pared (Schrick y col., 2004).
microfibrillas sea producto de la interacción de
Para que la síntesis de celulosa se lleve a
los microtúbulos con el complejo de la celulosa
cabo de forma correcta es imprescindible una
sintasa, ya que los microtúbulos suelen
actividad de edición, que realiza una endo-1,4-
encontrarse dispuestos perpendicularmente a
β-glucanasa
denominada
las zonas de elongación celular, de forma que
KORRIGAN (Zuo y col., 2000). Aunque su
serían los responsables de guiar a las celulosa
función no se conoce con exactitud, se ha
sintasas
propuesto que es necesaria para la correcta
moléculas de celulosa. Esto explicaría que las
terminación de la cadena una vez sintetizada,
microfibrillas se dispongan en la misma
liberando un oligo precursor unido a la
dirección que los microtúbulos, es decir,
membrana lipídica (Gillmor y col., 2002). Los
perpendicular al eje de crecimiento (Delmer,
mutantes kor tienen defectos en la citoquinesis
1999).
de
membrana
a
medida
que
estas
sintetizan
y elongación celular y a pesar de que sintetizan
β(1-4)glucano este no cristaliza de forma
Hemicelulosas
correcta en la microfibrilla. Pese a esto, la
Las
hemicelulosas
son
polisacáridos
proteína no está asociada a las rosetas (Zuo y
formados por una cadena lineal relativamente
col., 2000) y los mutantes kor tienen niveles
larga sobre la que aparecen distintas cadenas
normales de esterol-glucósido (Robert y col.,
laterales relativamente cortas. Pueden unirse a
2004).
las microfibrillas de celulosa mediante puentes
Las microfibrillas de celulosa se disponen
de
hidrógeno.
Entre
las
hemicelulosas
de forma diferente dependiendo del tipo
presentes en la pared celular, están los xilanos
celular, así, en células de tallos y raíces que son
(como el arabinoxilano), el xiloglucano, y el
alargadas,
glucano mixto que está presente sólo en
presentan
una
disposición
perpendicular al eje de crecimiento y paralela
entre si, sin embargo en células isodiamétricas
las
microfibrillas
6
se disponen de
forma
gramíneas.
Capítulo I: Introducción General
El Xiloglucano
tienen cuatro glucosas, aunque en algunas
El Xiloglucano (XyG) es la hemicelulosa
especies aparecen oligosacáridos con dos o
más abundante en las paredes celulares
cuatro glucosas (Hoffman y col., 2005).
primarias de dicotiledóneas como Arabidopsis
Algunos de los residuos de xilosa unen a su vez
thaliana.
galactosa, y estos a su vez, pueden tener unida
Está formado por glucosas unidas mediante
fucosa (Hayashi y col., 1980; Hayashi y
un enlace β(1-4) formando una cadena lineal
Maclachlan, 1984; O´Neill y Selvendran, 1983;
con una longitud de entre 300 y 3000 unidades
Nishitani y Masuda, 1982, 1983).
de glucosa (Fry, 1989). La mayoría de los restos
En la nomenclatura abreviada de los
de glucosa están unidos a restos de xilosa
oligosacáridos se utiliza una letra para cada
mediante enlace α(1-6), lo que impide la
glucosa de eje principal, que indica la cadena
formación de microfibrillas. Estas cadenas
lateral que lleva unida (Fry y col., 1993). Por
laterales
convenio,
general
no
aparecen
aparecen
tres
aleatoriamente,
restos
de
en
glucosa
sustituidos y el cuarto resto sin sustituir
la
nomenclatura
de
los
oligosacáridos empieza siempre por el extremo
no reductor (Tabla I.1).
(Vincken y col., 1997) (Fig. I.5).
De este modo la actividad de las endo-β-(14)glucanasas da lugar a la formación de
oligosacáridos de xiloglucano que normalmente
XXXG
Glucosa
Galactosa
Xilosa
Fucosa
XXFG
XLFG
XXG
Figura I.5. Estructura de la molécula de xiloglucano, se muestran los oligosacáridos más comunes resultado de
la actividad hidrolítica de las β(1→4)-glucanasas. En la parte inferior aparecen los oligosacáridos más
abundantes que se obtienen tras la digestión del xiloglucano de guisante con endoglucanasa, con su
correspondiente nomenclatura abreviada.
7
Capítulo I: Introducción General
Nomenclatura
Cadena lateral
G
Ninguna
X
α-D-xilosil
L
β-D-galactosil-(1-2)-α-D-xilosil
F
α-L-fucosil-(1-2)-β-D-galactosil-(1-2)-α-D-xilosil
S
α-L-arabinosil-(1-2)-α-D-xilosil
T
α-L-arabinosil-(1-3)-α-L-arabinosil-(1-2)-α-D-xilosil
J
α-L-galactosil-(1-2)-β-D-galactosil-(1-2)-α-D-xilosil
Tabla I.1. Nomenclatura abreviada de la estructura de los oligosacáridos de xiloglucano.
La estructura y distribución molecular de
Estas cadenas laterales determinan la estructura
las cadenas laterales varía en distintos tejidos y
del xiloglucano y las distintas funciones
plantas. La estructura química y distribución de
biológicas que presenta.
las cadenas laterales ha sido rigurosamente
establecida
de
los
mayoría de polisacáridos de la pared, tiene
que
son
lugar en el aparato de Golgi (Zhang y
obtenidos mediante digestión del polímero con
Staehelin, 1992), desde donde se liberan a la
endoglucanasa. Por ejemplo, en el caso del
pared mediante vesículas de secreción. Parece
guisante, tras la degradación del xiloglucano
que el primer paso en la síntesis de xiloglucano
polimérico,
que
es la formación del esqueleto glucosa-xilosa,
mayoritariamente se obtienen son XXXG y
que da como resultado la estructura básica
XXFG, que se van alternando a lo largo de la
XXXG. En la actualidad han sido identificadas
molécula (Hayashi y Maclachlan, 1984). Un
la mayor parte de las glicosil-transferasas
análisis más detallado permitió descubrir
implicadas en la biosíntesis de xiloglucano (Fig.
cantidades menores de: XXLG, XLFG, XXG,
I.6).
oligosacáridos
mediante
de
los
análisis
La síntesis de xiloglucano como la de la
xiloglucano
oligosacáridos
XG, GXFG y GXXG (Guillén y col., 1995).
8
Capítulo I: Introducción General
Figura I.6. Se indican los puntos de actuación de algunas de las enzimas implicadas en la síntesis de
xiloglucano, que añaden monosacáridos activados a las nuevas cadenas en síntesis. Adaptado de
http://www.prl.msu.edu/cellwallnet.shtml
Las glicosil-transferasas
mecanismo
central
de
constituyen el
la
biosíntesis
de
formarían el eje β-glicano de las hemicelulosas
como XyG, xilano o mananos entre otros.
polisacáridos (Scheible y Pauly, 2004). Estas
Además de las sintasas que ensamblan el eje
glicosil-transferasas están codificadas por genes
de los polisacáridos matriciales se requieren
denominados CSL (Cellulose synthase like
otras
genes) que se denominan según la homología
ramificaciones
de su secuencia con los genes CESA. Los genes
algunas de ellas han sido identificadas (Scheible
CSL encontrados en Arabidopsis y arroz, han
y Pauly, 2004).
glicosiltransferasas
laterales
a
para
añadir
estos
glicanos,
sido subdivididos en ocho grupos basados en su
En el proceso de síntesis de xiloglucano
secuencia génica. Las proteínas CSL contienen
interviene un complejo multienzimático que
patrones de secuencia característicos de las β-
coordina las actividades glicosiltransferasa y
glicosiltransferasas,
consideradas
xilosiltransferasa. El siguiente paso de la
buenas candidatas para las sintasas localizadas
síntesis sería la unión de residuos de fucosa y
en el aparato de Golgi. Estas proteínas
galactosa, que deben estar activados para
que
son
incorporarse al eje XXXG (Faik y col., 1997a).
9
Capítulo I: Introducción General
Dicha activación consiste en la unión a la
hasta la cebolla (monocotiledóneas) sugiere su
glucosa, galactosa y xilosa de una molécula de
importancia en la función del xiloglucano. Sin
UDP (Uridina 5’ difosfato), mientras que en el
embargo, plantas de Arabidopsis thaliana
caso de la fucosa la activación se lleva a cabo
correspondientes al mutante mur2, que carecen
mediante la unión de una molécula de GDP
de actividad AtFUT1, responsable de la
(Guanina 5’ difosfato). Estos precursores son
transferencia de fucosa al xiloglucano, crecen
transportados desde el citosol al aparato de
de forma normal en condiciones de laboratorio
Golgi
(Perrin y col., 2003).
mediante
2000),
desde
transportadores
donde
serán
(Gibeaut,
liberados
al
El
xiloglucano,
además
de
presentar
apoplasto. Han sido identificadas algunas de las
diferentes cadenas laterales, en algunos de sus
enzimas implicadas en estas reacciones, una
residuos aparece O-acetilación. Estos grupos
fucosil-transferasa (Faik y col., 1997b; Perrin y
acetilo están presentes en el C2, C3 y C6 de los
col., 1999) y una galactosil-transferasa (Madson
residuos de galactosa y pueden contener uno o
y col., 2003) identificada a partir del mutante
dos grupos acetilo (York y col., 1993). Se han
de Arabidopsis mur3. Además, el eje principal
descrito grupos acetilo en el C6 de algunas
de glucano que constituye el xiloglucano, está
glucosas (York y col., 1996). Tanto los grupos
sustituido por restos de xilosa en un patrón
acetilo unidos a los residuos de glucosa como
regular. Dichas xilosas son agregadas al menos
las cadenas laterales limitan los posibles lugares
por una, y probablemente por dos o tres
de hidrólisis del polímero. De ahí que el XyG
enzimas,
de
denominadas
xilosil-transferasas
lugar
a
diferente
tras
composición
tratamiento
de
(Cavalier y Keegstra, 2006). Se han aislado siete
oligosacáridos
con
genes candidatos a codificar las enzimas que
endocelulasa dependiendo de los lugares de
catalizan dicha actividad, de los cuales uno en
acetilación.
Arabidopsis (AtXT1) se confirmó que codifica
La acetilación de los residuos de galactosa
para una proteína con actividad xilosil-
aparece considerablemente reducida en los
transferasa (Faik y col., 2002). La proteína
mutantes deficientes en fucosa AtFUT1, mur1
codificada por el gen AtXT2, presenta la misma
y mur2, que sintetizan poco o nada de fucosa.
especificidad de aceptor que AtXT1 y además
Esto sugiere que la fucosilación del xiloglucano
genera los mismos productos in vitro. La
es
presencia de cadenas fucosiladas en un amplio
acetiltransferasa en Arabidopsis (Perrin y col.,
rango
2003).
de
especies,
desde
el
pino
(gimnospermas) o leguminosas (dicotiledóneas)
10
necesaria
para
al
menos
una
O-
Capítulo I: Introducción General
Pectinas
Son los polisacáridos más solubles de la
(Somerville y col., 2004). Las pectinas podrían
estar relacionadas con el cese del crecimiento
pared celular y pueden ser extraídos con agua
de la pared debido
un incremento de la
caliente o agentes quelantes de calcio. Al igual
rigidez, que frenaría el crecimiento, mediante
que las hemicelulosas, las pectinas también
la dimerización de los ácidos hidroxicinámicos
forman un grupo heterogéneo de polisacáridos.
que forman parte de su estructura (Zarra y col.,
Constituyen aproximadamente el 30% del peso
1999). La característica principal de las pectinas
seco de la pared de dicotiledóneas y están
es que contienen azúcares ácidos como el ácido
implicadas en las uniones intercelulares ya que
glucurónico y el ácido galacturónico, y es
están presentes en la lámina media y en la
precisamente esta acidez, la que permite la
pared celular primaria, podrían tener además
formación de complejos debido a la unión
un papel en el control de la porosidad celular
mediante puentes de calcio (Fig. I.7).
Figura I.7. Dominios principales de pectinas y estructura básica.
Algunas pectinas tienen una estructura
disacárido (1-2)α-L-Rha(1-4)α-D-GalU, donde
primaria sencilla, como el homogalacturonano
los restos de Rha funcionan como anclaje de
(HG), que es un polímero lineal formado por
largas cadenas laterales de arabinanos y/o
restos de ácido galacturónico (GalU) unidos por
arabinogalactanos. El tamaño de esta pectina
un enlace α(1-4). El ramnogalacturonano I (RG
en los entrenudos de guisante durante el
I), es una pectina formada por la repetición del
crecimiento está entre 500 y 2000 kDa (Talbott
11
Capítulo I: Introducción General
y Ray, 1992). La tercera pectina importante es
con estructura alterada (Somerville y col.,
el ramnogalacturonano II (RGII). Es un
2004). Quasimodo, un mutante de T-DNA de
polisacárido pequeño pero de estructura muy
Arabidopsis, tiene inactivado el gen de una
compleja formada por GalU, Rha, Ara, Gal y
posible glucuronosil-transferasa de pectinas
pequeñas
poco
(Bouton y col., 2002). Las paredes celulares de
frecuentes como apiosa o ácido acérico. El
este mutante presentan adherencia celular
arabinogalactano
presenta
reducida y una reducción del 25% en los
ramificaciones en C3 y C6 de Gal y en C3 y C5
niveles de ácido galacturónico comparado con
de Ara (Ridley y col., 2001). Las cadenas
el tipo salvaje. Sin embargo, en estas plantas, el
laterales contienen un alto número de residuos
resto de los azúcares pécticos no aparecen en
distintos unidos mediante diversos enlaces pero
menor cantidad, por eso los autores suponen
aun así el RGII tiene una estructura altamente
que esta actividad glucuronosil-transferasa es
conservada y puede formar dímeros mediante
específica del homogalacturonano pero no
un puente borato, con dos enlaces éster
afecta al RG II.
cantidades
del
de
azúcares
RGII
(Fleischer y col., 1999). Recientemente se ha
sugerido que el RGI sería el componente al que
Proteínas Estructurales
se unirían otras pectinas tales como el HG o el
La pared celular primaria contiene una
RGII unidas covalentemente como cadenas
cantidad mayor de proteínas que la pared
laterales.
celular
secundaria.
Se
pueden
distinguir
La síntesis de pectinas al igual que la de
básicamente dos tipos de proteínas de pared, las
otros polisacáridos de la pared se lleva a cabo
estructurales y las enzimáticas. Las proteínas
en el aparato de Golgi. Las proteínas que
estructurales más conocidas están relacionadas
intervienen en la síntesis presentan en su
con el cese de la extensión de la pared y en su
mayoría segmentos transmembrana o forman
gran
complejos con otras proteínas implicadas en
inusual, la hidroxiprolina y se caracterizan por
este proceso, por este motivo su purificación se
la presencia de secuencias repetitivas. Las más
complica. Al no haber mutantes específicos,
conocidas son las glicoproteínas ricas en
resulta difícil el estudio de la biosíntesis y de su
hidroxiprolina (HRGPs) o extensinas, en las
papel in vivo. Por esta razón, los genes
que la secuencia repetitiva es Ser-(HO-Hyp)4,
implicados en la síntesis de pectinas que
de forma que un 40% de sus aminoácidos
conocemos se han identificado a partir de
corresponde a hidroxiprolina y el resto serían
mutantes de la pared que presentan pectinas
mayoritariamente serina y lisina. Los residuos
12
mayoría
contienen
un
aminoácido
Capítulo I: Introducción General
de
hidroxiprolina
pueden
a
pueden atravesar la lámina media que separa
oligosacáridos de arabinosa, que formarían la
células vegetales adyacentes (Stafstrom y
parte glicídica, mientras que los residuos de
Staehelin, 1988).
serina serían puntos de unión para residuos de
Otro tipo de proteínas estructurales son las
galactosa.
abundantes
proteínas ricas en glicina (GRPs) y en prolina
residuos de tirosina, los cuales parecen estar
(PRPs). Las proteínas ricas en glicina presentan
implicados
repeticiones
Además
en
isoditirosina
contienen
la
formación
enlaces
tipo
(Gly-X)n,
donde
responsables de la insolubilización de las
puede ser alanina o serina, y su función está
HRGPs en la pared (Lamport y Epstein, 1983).
relacionada con el sistema vascular y la
El estudio de las extensinas ha demostrado que
curación de heridas. Las proteínas ricas en
cada una de ellas es sintetizada en uno o pocos
prolina presentan repeticiones Pro-Pro-X-Y-
tipos celulares en la planta.
Lys, donde X e Y pueden ser valina, tirosina,
está
histidina y ácido glutámico. Parecen estar
del
implicadas en procesos de lignificación (Ye y
crecimiento de la pared celular (Lamport y
col., 1991) y se expresan en determinados tipos
Kieliszewski, 1994), la expresión de las
celulares o solamente en un tipo celular en
expansinas no sólo está regulada por el
cierto estado de desarrollo.
claramente
de
propuestos
del
frecuentemente X es glicina, aunque también
función
son
de
como
La
que
unirse
implicada
las
en
extensinas
el
cese
desarrollo sino también por el ataque de
Las arabinogalactanoproteínas (AGPs) son
patógenos. Se considera que las HRGPs son un
proteínas solubles y glicosiladas (Fincher y col.,
componente importante el mecanismo de
1983; Showalter, 1993). Se han encontrado
defensa, ya que su expresión no sólo se produce
múltiples formas de las AGPs en tejidos
cuando cesa el crecimiento sino también tras
vegetales, en la pared o asociadas a la
una infección de las células epidérmicas o
membrana plasmática y presentan patrones de
corticales,
son
expresión diferentes dependiendo del tipo de
componentes de un mecanismo de resistencia
célula y tejido (Pennell y col., 1989; Serpe y
(Keller, 1993).
Nothnagel, 1995). Presentan un dominio
lo
que
demuestra
que
Las extensinas se localizan distribuidas
central rico en hidroxiprolina (Hyp) y una
uniformemente en la pared primaria y están
secuencia de anclaje a la membrana plasmática
ausentes en la lámina media. Esto pone en
en el extremo C-terminal. También presentan
evidencia que estas proteínas son producidas
una especial unión a las pectinas, por ello se
por cada célula de forma independiente y no
piensa que podrían estar implicadas en la
13
Capítulo I: Introducción General
adhesión celular, sin embargo no son un
las
componente estructural importante en la
modificar distintos sustratos en la pared, como
célula. Las AGPs intervendrían también en
las peroxidasas o las fosfatasas. La función
otras
crecimiento,
precisa de muchas enzimas de la pared aun está
nutrición, así como en otros procesos de
por determinar, pero sin duda intervienen en
desarrollo (Pennell y Roberts, 1990).
numerosos procesos, desde la modificación de
funciones
tales
como
quitinasas
o
las
β(1-3)glucanasas,
o
la pared hasta el transporte de metabolitos o la
Enzimas de la Pared Celular
señalización celular. Toda esta diversidad de
Además de las proteínas estructurales, en la
enzimas apoya el hecho de que la pared es un
pared celular destacan las proteínas con
compartimento metabólico muy activo en la
actividad enzimática que catalizan al menos
célula, y el flujo de materiales a través de la
cuatro tipos de reacciones, transglicosilación,
membrana
hidrólisis, desesterificación y reacciones redox
actividad de las enzimas de la pared.
plasmática
puede
modular
la
(Fry, 1995). Casi todas estas enzimas son
Todas las enzimas han de estar reguladas ya
proteínas glicosiladas que intervienen en el
que de lo contrario, la elevada actividad
metabolismo de la pared celular (Fry, 1988)
glicanasa podría llevar a cabo la degradación de
aunque su función puede ser muy diferente.
componentes de la pared celular provocando su
Estas enzimas pueden ser solubles en el
desintegración. El mecanismo que regula estas
apoplasto o bien estar unidas a la pared celular.
actividades enzimáticas de la pared celular, no
Se caracterizan por presentar mayor estabilidad
se conoce con exactitud, lo que si es
que las enzimas citoplásmicas y por actuar
indiscutible
sobre sustratos simples como el O2, H2O2 o H2O
regulación.
es
la
necesidad
de
dicha
(Fry, 1995).
Son numerosas las enzimas que pueden
encontrarse asociadas a la pared celular (Cassab
Ensamblaje y Estructura de la Pared Celular
Después
de
su
secreción
al
espacio
y Varner, 1988; Fry, 1995). Algunas pueden
extracelular, los polímeros que constituyen la
modificar los polisacáridos de la pared celular,
pared se ensamblan de forma cohesiva, para dar
por ejemplo, las endoglucanasas, xilosidasas,
lugar a la estructura final característica de la
pectinasas, pectin-metil-esterasas o xiloglucano
pared. Una vez sintetizados dichos polímeros
endotransglicosilasas. Otras pueden actuar en
tienden a agregarse para dar lugar a estructuras
la pared como potenciales defensas frente a
organizadas (Roland y col., 1977; Lapasin y
patógenos fúngicos o bacterianos, es el caso de
Pricl, 1995). De hecho, cuando la celulosa es
14
Capítulo I: Introducción General
regenerada
in
vitro
forma
fibras
muchas que sean específicas para la unión de
espontáneamente. Además, cuando se disuelve
polímeros
de
la
la fracción hemicelulósica de la pared y
potenciales
posteriormente se precipita, se agrega formando
xiloglucano endotransglicosilasas (XETs), las
redes ordenadas y concéntricas similares a las
esterasas o las oxidasas entre otras. La XET (Fry
de las paredes originales (Roland y col., 1977).
y col., 1992; Nishitani y Tominaga, 1992),
Las pectinas, por el contrario forman redes
cataliza la ruptura de cadenas de xiloglucano
isotrópicas mucho más dispersas. Aunque el
(entre un resto de glucosa no sustituido y el
xiloglucano, en general, está fuertemente unido
siguiente) y la unión del nuevo extremo
a la pared, una vez solubilizado no forma
reductor formado al extremo no reductor de
fácilmente agregados de nuevo, y los complejos
una
cadena
de
formados con la celulosa in vitro son menos
Originalmente
se
estables que los que se forman en la pared
transglicosilasa podría relajar la pared de forma
celular in vivo (Hayashi, 1989; Hayashi y col.,
limitada y controlada, aunque los experimentos
1994). Los complejos xiloglucano-celulosa, de
in vitro no pudieron detectar la relajación de la
los que se hablará con detalle posteriormente,
pared por acción de la XET (McQueen-Mason y
reconstituidos in vitro, contienen sólo un 7%
col., 1993). Un papel alternativo de la XET
del xiloglucano encontrado en los complejos
puede ser el integrar nuevos XyGs sintetizados
nativos (Hayashi y col., 1987), esto implica que
en la pared (Nishitani y Tominaga, 1991;
se requieren determinadas condiciones físicas
Okazawa y col., 1993). Los XyGs sintetizados
para formar la estructura que presenta la pared
son más pequeños que los que constituyen la
in vivo. Una interpretación posible es que el
pared (Talbott y Ray, 1992). Por otro lado, la
xiloglucano se entrelaza con las microfibrillas
composición de XyG de diferentes tamaños
de celulosa durante su síntesis (Hayashi y col.,
varía a lo largo de diferentes segmentos del tallo
1994). Los enlaces que forma el xiloglucano con
de guisante, y puede cambiar de forma rápida y
la celulosa no son mecánicamente fuertes, sino
reversible en respuesta a la auxina, cortes o
que son enlaces débiles, fáciles de romper,
cambios de turgencia (Nishitani y Masuda,
permitiendo el crecimiento de la pared, y a su
1981; Nishitani y Masuda, 1983; Talbott y Ray,
vez numerosos, aportando resistencia mecánica
1992). Sería la XET la que provocaría estos
global a la pared.
cambios en la composición de oligosacáridos de
para
pared.
esta
Las
función
xiloglucano
propuso
candidatas
son
las
aceptora.
que
esta
En el ensamblaje de la pared también hay
XyG, ya que rompería cadenas de XyG para dar
enzimas implicadas, aunque no se conocen
lugar a fragmentos de diferentes tamaños. En
15
Capítulo I: Introducción General
solución, la XET parece cortar al azar en
inducción a la extensión de la pared por
diferentes localizaciones a lo largo de la cadena
incorporación de nuevos polímeros secretados.
principal del XyG, aunque probablemente las
A microscopía electrónica la estructura
condiciones de la pared celular, como la
dominante que se observa en la pared celular
conformación del propio XyG o el ambiente
primaria es una trama de microfibrillas de
electrostático de la pared modulan la acción de
celulosa, que presentan un diámetro de unos 3
esta enzima para formar fragmentos más
nm y que se extienden sobre las células,
grandes o más pequeños de XyG. Por lo tanto
manteniéndose unidas mediante hemicelulosas,
esta enzima tendría capacidad para alterar la
tales como el xiloglucano, pectinas y proteínas,
matriz que constituye la pared, y además podría
a modo de gel, puesto que el agua representa un
realizar tres funciones diferentes. La más
alto porcentaje en el contenido global de dicha
importante sería la que tiene que ver con la
matriz (Carpita y Gibeaut, 1993). Estaría
biosíntesis y modulación de la pared, ya que
formada
esta no puede perder grosor, y por ello será
independientes:
necesario incorporar nuevo material a la pared
matriz
en expansión. Entonces, las cadenas de XyG de
estructurales(Carpita y Gibeaut, 1993).
nueva síntesis son liberadas al apoplasto,
procedentes
del
aparato
de
Golgi,
La
por
de
tres
redes
red
xiloglucano-celulosa,
pectinas
mayoría
de
relativamente
y
los
glicoproteínas
polímeros
que
y
constituyen la pared durante el crecimiento no
entrelazadas a las cadenas ya existentes gracias a
están unidos covalentemente, y la integridad de
estas enzimas, manteniendo así la integridad de
la pared se mantiene mediante una gran
la pared celular (Nishitani, 1997).
cantidad de uniones no covalentes entre estos
La deposición de nuevo material en la pared
polímeros. Esto implica que la integridad y
es claramente necesaria para mantener la fuerza
propiedades mecánicas de la pared estarían
e
determinadas por tres factores: el tamaño de los
integridad
de
la
misma
durante
el
crecimiento. Aunque in vitro se ha podido
polímeros
separar la extensión de la pared de la deposición
entrecruzamiento
(Rayle y col., 1970) parece que ambos son
interacción entre ellos. Cambios en estos tres
inseparables in vivo. Por ello se cree que la
factores,
deposición de nuevo material en la pared
extensibilidad de la célula aunque estaría
permitiría deslizarse entre si a los componentes
implicada también alguna actividad enzimática
de la pared ya existentes, aunque no existen
(Fry, 1998).
evidencias
16
demostradas
para
explicar
la
de
en
la
pared,
de
teoría,
los
el
grado
polímeros
podrían
y
alterar
de
la
la
Capítulo I: Introducción General
El modelo de pared primaria más aceptado
Los estudios sobre la composición de
(Carpita y Gibeaut, 1993) considera que la red
azúcares de paredes de distintos tejidos de
xiloglucano-celulosa es la principal responsable
Arabidopsis han demostrado que cada tejido
de las propiedades mecánicas de la pared,
presenta distinta composición polisacarídica.
siendo el xiloglucano el componente que
Estudios inmunológicos utilizando anticuerpos
soportaría la mayor parte de la tensión. Como
monoclonales
ya
de
epitopos de los polisacáridos proporcionan
xiloglucano se unen a las microfibrillas de
ejemplos de la diferenciación espacial y
celulosa mediante puentes de hidrógeno, de
temporal de los polisacáridos de la pared. Estos
forma que una cadena de xiloglucano se une a
y otros estudios demuestran que la composición
varias microfibrillas,
que una
de la pared está altamente controlada en los
microfibrilla estaría unida a su vez a numerosas
distintos tipos celulares en relación con el
cadenas de xiloglucano.
crecimiento y el desarrollo. Los estudios
Como se ha comentado previamente, las
inmunológicos han demostrado además que
microfibrillas de celulosa se sintetizan en la
diversos
membrana plasmática y son insolubles, porque
uniformemente dentro de la pared. El RGII, por
las cadenas laterales de glucanos unidas
ejemplo, aparece en mayor proporción cerca de
mediante puentes de hidrógeno o fuerzas de
la membrana plasmática, mientras que el HG
Van der Walls dan lugar a estructuras
aparece mayoritariamente en la lámina media
cristalinas formadas por cadenas laterales,
donde
mientras
son
adyacentes. Estas diferencias en composición y
secretados en forma soluble, para que puedan
estructura en las paredes de distintas células,
difundir a lo largo de la pared hasta su destino
podría indicar diferencias en las necesidades de
final. Algunos polímeros son insolubles cuando
elasticidad de dichas células, la movilidad de
se extraen de la pared, por ello se piensa que
distintos tipos de moléculas en las paredes
podrían ser modificados tras la secreción, por
celulares o la respuesta a patógenos.
se
ha
mencionado,
que
los
las
cadenas
al tiempo
demás
polímeros
que
polímeros
contactan
reconocen
no
las
están
paredes
diferentes
distribuidos
de
células
eliminación de los componentes estructurales
que favorecían dicha secreción (Somerville y
La Red XiloglucanoXiloglucano-Celulosa
col., 2004). Se ha propuesto que algunos
Como se ha mencionado en el apartado
polímeros darían lugar a polisacáridos de mayor
anterior, la pared celular primaria está formada
tamaño (y menos solubles) tras la liberación a la
por tres redes relativamente independientes:
pared.
red de pectinas, glicoproteínas estructurales, y
17
Capítulo I: Introducción General
la red xiloglucano-celulosa (Carpita y Gibeaut,
primaria,
1993).
la
conformación plana que facilita la unión del
interrelación entre esta última red y la matriz
xiloglucano a la celulosa (Levy y col., 1991). De
de pectinas, pero aproximadamente una tercera
hecho, Levy y colaboradores (1991) utilizando
parte del xiloglucano estaría covalentemente
programas
unido a pectinas (Thompson y Fry, 2000).
predicciones conformacionales, describieron
Aunque la celulosa y el xiloglucano se
una velocidad de unión del xiloglucano
sintetizan
diferentes
fucosilado a la celulosa superior con respecto al
localizaciones, hay una estrecha interacción
que no lo está, demostrando posteriormente sus
No
se
y
conoce
con
ensamblan
exactitud
en
informáticos
adopte
para
una
obtener
teorías en ensayos in vitro (Levy y col., 1997).
xiloglucano previene la formación de complejos
Sin embargo, nuevos trabajos informáticos han
más grandes de celulosa (Mccann y col., 1990a;
visto estas predicciones como no reales, y no
Acebes y col., 1993), y además hay muy
han encontrado a nivel teórico cambios en la
pequeñas cantidades de celulosa libres (Hayashi
adsorción de la celulosa por parte de los oligos
y Maclachlan, 1984). La red xiloglucano-
fucosilados con respecto a los no fucosilados
celulosa parece ser el factor más importante que
(Hanus y Mazeau, 2004). Por otro lado, se ha
controla la extensión de la pared celular, de tal
demostrado que la presencia de residuos de
modo que posee la capacidad de regular el
galactosa limita la unión del xiloglucano a la
crecimiento celular. Parece que el xiloglucano
celulosa, e in vitro, la modificación del
tendría un papel estructural importante en la
xiloglucano por acción de una β-galactosidasa
determinación
las
incrementa la unión del xiloglucano a la
microfibrillas de celulosa y la formación de la
celulosa (Reid y col., 1988), aunque además del
red (Hanus y Mazeau, 2006). El xiloglucano se
tamaño, la configuración de las cadenas
une a celulosa mediante puentes de hidrógeno,
laterales
y se ha demostrado que se necesita una cadena
importante en la adsorción del xiloglucano a la
de xiloglucano de al menos 5 residuos glicosil
celulosa. Cuando el xiloglucano excede la
consecutivos para que pueda unirse. Esta unión
capacidad de unión de la celulosa, se produce
estaría afectada además, por el grado de
una adsorción preferencial de las moléculas más
ramificación de la molécula, de forma que el
grandes, ya que su unión es más favorable en
tipo de cadena lateral que presenta determina
términos de entropía.
ambos
polisacáridos
de
la
orientación
vivo.
que
El
entre
in
favorece
de
también
puede
jugar
un
papel
una unión más o menos fuerte. La presencia de
La red xiloglucano-celulosa es, por lo tanto,
fucosa en el xiloglucano de la pared celular
esencial para comprender los procesos de
18
Capítulo I: Introducción General
extensión, pero hay que tener en cuenta otros
al extremo no reductor recién formado en dicha
componentes de la pared (Cosgrove, 1987). Se
cadena.
ha observado que la celulosa no parece sufrir
extremo al extremo no reductor de una cadena
grandes modificaciones durante el crecimiento
preexistente,
(Fry, 1988), por lo que es en la red en la que se
oligosacárido de xiloglucano. La unidad mínima
producen los cambios. El xiloglucano participa
aceptora es el oligosacárido XXG. Se puede
en el mantenimiento de la estructura de la
establecer
pared celular, de modo que un menor grado de
transglicosilaciones
polimerización
integradora, mediante la cual se incorporan
Lorences
y
(Lorences
col.,
y
1989)
Zarra,
1987;
implicaría
una
nuevas
Posteriormente
recién
por
lo
cadenas
transfieren
sintetizada
tanto,
de
o
dos
(Nishitani,
dicho
a
tipos
1998),
xiloglucano
un
de
una
recién
disminución en el número de puentes de
sintetizadas a las cadenas preexistentes, y otra
hidrógeno que le unen a la celulosa, facilitando
reestructuradora, que da lugar a la modificación
su desplazamiento bajo la presión de turgencia
de las cadenas de xiloglucano ya existentes, de
y por lo tanto el crecimiento.
forma que se utilizaría dichas cadenas, con
función tanto donadora como aceptora. Esta
Enzimas que actúan sobre la red XiloglucanoXiloglucano-
característica de las XTHs es fundamental en el
Celulosa
proceso de extensión de la pared, ya que
Sobre la red Xiloglucano-Celulosa actúan
permite la relajación de la misma sin provocar
enzimas incluidas dentro de tres grupos
su
fundamentales:
pueden
XTHs (Xiloglucano endotransglicosilasas/
hidrolasas)
(Rose
y
col.,
desestabilización
actuar,
endoglucanasas,
completa.
Las
XTHs
como
por
lo
tanto,
XEH,
ya
que
rompen
2002a),
xiloglucano de una cadena donadora, o como
pertenecientes a la familia 16 de las
transglicosilasas, XET, ya que vuelven a unir ese
glicosil hidrolasas (Henrissat, 1991).
extremo reductor al extremo no reductor de
Celulasas o endo-β-(1-4)glucanasas (del
otra molécula de xiloglucano. No obstante, sería
Campillo, 1999) pertenecientes a la
esta última actividad la que daría lugar a la
familia 9 de las glicosil hidrolasas
pérdida de rigidez de la pared, al romper las
(Henrissat, 1991)
cadenas de xiloglucano, unirlas de nuevo dando
Expansinas (Cosgrove, 2000)
Cuando
actúan
como
lugar a moléculas más largas y permitiendo la
xiloglucano
separación de
las moléculas de
celulosa
endotransglicosilasas, las XTHs, rompen las
(Thompson y Fry, 2001). Si se une la cadena de
cadenas de xiloglucano y se mantienen unidas
xiloglucano aceptora a un oligo soluble,
19
Capítulo I: Introducción General
entonces se produce la rotura de la cadena (Fig
I.8).
Figura I.8. Actividad endotransglicosilasa de la XTH, que corta y une cadenas de xiloglucano, permitiendo la
expansión de la pared celular, debido a la posibilidad de separación de las microfibrillas de celulosa. (a)
cadenas de xiloglucano (b) la XTH corta la cadena de xiloglucano dando lugar a un extremo reductor (c) la
XTH une dicho extremo con el extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano.
En relación a la capacidad de usar un
Se estudió la preferencia de las XTHs por
oligosacárido como aceptor, se podría decir que
diferentes moléculas aceptoras, y parece que
esto permitiría una mayor extensión de la
existe una amplia gama de isoenzimas en
pared, ya que al unirse las cadenas portadas por
función de dichas preferencias (Rose y col.,
la XTHs impedirían que estas se uniesen a las
2002b). Esto podría significar que el tipo de
cadenas
el
oligosacárido o el tipo de xiloglucano presente
espacio entre las microfibrillas. De esta forma,
en la pared en un determinado momento del
la concentración de oligosacáridos suficiente
desarrollo sería determinante en la consecución
para competir con las cadenas preexistentes
del estado requerido. En cuanto a la relación de
podría influir de manera importante en los
estas
mecanismos de extensión de la pared celular.
encontró una buena correlación entre los
20
preexistentes
aumentando
así
isoenzimas
con
el
crecimiento,
se
Capítulo I: Introducción General
niveles de actividad de las XTHs y la tasa de
entre glucosas no sustituidas. Se supone, en
crecimiento (Potter y Fry, 1993; Catala y col.,
principio, que estas enzimas actúan sobre
1997; Takano y col., 1999). Pero curiosamente,
moléculas de celulosa, aunque en plantas no se
al añadir XTHs a paredes aisladas no se
han encontrado celulasas activas frente a
consiguió la extensión esperada (McQueen-
celulosa cristalizada. Además tampoco se han
Mason y col., 1993). Pese a que las expansinas
encontrado dominios de unión a celulosa
han sido propuestas para llevar a cabo la
(Brumell y col., 1994). En cambio, sí se ha
extensión de la pared celular, las XTHs estarían
encontrado
también implicadas en dicha función. La
solubles de celulosa. Existe una correlación
expresión de algunos genes de XTHs se han
entre
correlacionado a menudo con el crecimiento,
xiloglucano y la actividad de las endoglucanasas
además una expresión baja de los genes
(Ohmiya y col., 2000). Junto con esta liberación
AtXTH18 y AtXTH27 da lugar a cambios
se produce la solubilización de las cadenas de
fenotípicos. Estas observaciones apoyan la idea
xiloglucano, lo cual facilitaría la extensión de la
de que las XTHs están implicadas en la
pared.
la
actividad
liberación
frente
de
a
derivados
oligosacáridos
de
relajación de la pared celular (Van Sandt y col.,
Algunos investigadores se inclinan por
2007). El grupo I purificado de XTH, presenta
pensar que el verdadero sustrato de las celulasas
exclusivamente
puede
son las moléculas de xiloglucano. Sin embargo,
estimular la extensión de paredes celulares tipo
ensayos de actividad enzimática frente a esta
I. No se puede generalizar dicha actividad para
molécula muestran que dicha actividad sobre
todas
estar
ella es escasa (Ohmiya y col., 1995) o nula
especializadas funcionalmente al igual que pasa
(O´Donoghue y Huber, 1992). También existen
con las expansinas (Choi y col., 2006). La
datos a favor de esta hipótesis, ya que se ha
diversidad funcional es sugerida por los
encontrado en guisante una endocelulasa activa
patrones de expresión de varios genes de XTH,
frente a xiloglucano y no frente a celulosa
incluso en tejidos que no se expanden
soluble (Matsumoto y col., 1995), aunque no se
(Vissenberg y col., 2005; Becnel y col., 2006).
sabe si pertenece a la familia de las celulasas. En
Cada XTH debe ser analizada de forma
numerosas ocasiones, sin embargo, se asume
individual para revelar su papel exacto en la
que el principal sustrato de las celulasas es el
mecánica de la pared celular.
xiloglucano, a pesar de que las enzimas tienen
las
actividad
XTHs,
ya
XET,
que
y
pueden
Las endocelulasas o endo-β-(1-4)-glucanasas
son enzimas que rompen los enlaces β(1-4)
más actividad frente a carboximetil celulosa
(Hayashi, 1989).
21
Capítulo I: Introducción General
En cuanto a las expansinas, poco después
vivas, donde inducen la extensión de la pared
del descubrimiento de las XTHs, fueron
celular (Link y Cosgrove, 1998; Fleming y col.,
purificadas estas proteínas capaces de provocar,
1999), lo que indicaría que el nivel de
por sí solas, la extensión de paredes aisladas
expansinas
sometidas a tensión, en las que previamente se
crecimiento (Fig. I.9).
inactivaron por calor todas las enzimas nativas
La acción combinada de las expansinas y las
(McQueen-Mason y col., 1992). No se sabe
XTHs, daría lugar a una relajación de la pared
realmente como actúan estas proteínas, aunque
que permitiría el crecimiento celular, así pues,
en principio romperían puentes de hidrógeno
la rotura de alguna cadena de xiloglucano por
entre las microfibrillas de celulosa y las
parte
moléculas de xiloglucano. Al parecer sólo son
distanciamiento
capaces de romper estos enlaces cuando las
produciéndose así la tensión necesaria para que
moléculas de xiloglucano están en tensión y
las expansinas rompan los puentes de hidrógeno
sería esta tensión la que evitaría que volvieran a
presentes entre las cadenas de xiloglucano y
unirse
dichas microfibrillas.
mediante
puentes
de
hidrógeno.
de
es
las
un
factor
XTHs,
entre
limitante
propiciaría
las
del
un
microfibrillas,
También se comprobó su actividad en células
Figura I.9. Modo de actuación de las expansinas. (a) pueden separar las hemicelulosas y compuestos de la
superficie de la celulosa (b) separar unas hemicelulosas de otras (c) bajo tensión mecánica la acción de las
expansinas da lugar a un desplazamiento de los polímeros de la pared.
22
Capítulo I: Introducción General
Enzimas que actúan sobre los oligosacáridos de
incorporarían al interior celular (Baydoun y
xiloglucano
xiloglucano
Fry, 1989). Estas exoglicosidasas presentan una
En la pared celular existen varias enzimas
actividad relacionada con cada uno de los
capaces de modificar el xiloglucano y/o sus
residuos monoméricos que liberan, de esta
oligosacáridos (Fry, 1995). Estas exoglicosidasas,
forma
son capaces de degradar los oligosacáridos de
galactosidasas, α-xilosidasas y β-glucosidasas
xiloglucano
(Fig. I.10).
hasta
sus
monómeros
tendríamos,
α-fucosidasas,
β-
correspondientes, debido a que estos no se
A
B
glucosa
xilosa
C
galactosa
D
fucosa
Figura I.10. Actividad secuencial de las distintas glicosil hidrolasas sobre el oligosacárido XXFG, A: αfucosidasa, B: β-galactosidasa, C: α-xilosidasa, D: β-glucosidasa
La primera α-fucosidasa se purificó en
implicadas en la eliminación de residuos β-
plantas de guisante (Farkas y col., 1991) y es
galactosil no sustituidos, presentes en los
activa frente al oligosacárido XXFG (Augur y
oligosacáridos o en la propia molécula de
col., 1993). También se purificó una α-
xiloglucano. Dicha actividad rompería los
fucosidasa de repollo con actividad tanto frente
enlaces α(1-2) presentes entre los restos β-
a oligosacáridos como frente al xiloglucano
galactosil y α-xilosil. Esta enzima intervendría
polimérico. En Arabidopsis thaliana se clonó el
en la degradación de oligosacáridos como
gen correspondiente (AtFXG1) (de la Torre y
XLFG. Este es uno de los oligosacáridos más
col.,
frecuentes,
2002),
que
hidroliza
oligosacáridos
fucosilados.
Existen numerosos datos sobre la actividad
producto
de
la
degradación
mediante endoglucanasas de las cadenas de
xiloglucano. En los cotiledones de Tropaeolum
β-galactosidasa en extractos de plantas. Algunas
majus,
β-galactosidasas de plantas parecen ser activas
galactosidasa capaz de actuar sobre los residuos
se
identificó
una
actividad
frente al xiloglucano. Se supone que estarían
23
β-
Capítulo I: Introducción General
de galactosa del xiloglucano (Edwards y col.,
1988).
La actuación de estas enzimas, puede ser
muy importante en la regulación del control del
En epicótilos de guisante se purificó una α-
crecimiento de la pared celular, dado que
xilosidasa activa frente a oligosacáridos de
pueden modificar la cantidad y tipo de
xiloglucano (O´Neill y col., 1989), que elimina
oligosacáridos presentes en el apoplasto, que es
restos de xilosa unidos al resto de glucosa más
determinante en la expansión de la pared. La α-
alejado del extremo no reductor. También se
xilosidasa, por ejemplo, eliminando el resto de
purificó otra α-xilosidasa en Tropaeolum majus
xilosa más alejado del extremo reductor de la
(Fanutti y col., 1991) y más recientemente en
molécula de xiloglucano podría hacerla incapaz
Brassica oleacea (Sampedro y col., 2001). A
de actuar como aceptor de la XTH. La molécula
nivel génico, el gen AtXYL1, de Arabidopsis
de xiloglucano o el oligosacárido, podrían ser
thaliana, codifica la proteína AtXYL1 con
activados posteriormente como blanco de la
actividad α-xilosidasa (Sampedro y col., 2001),
XTH mediante la actividad β-D-glucosidasa. La
y en Pinus pinaster el gen PpXYL1 codifica la
inactivación-activación
proteína PpXYL1 con actividad α-xilosidasa
cadenas de xiloglucano por parte de la α-D-
(Sanchez y col., 2003).
xilosidasa y la β-D-glucosidasa puede ser
secuencial
de
las
Finalmente, se aisló a partir de cotiledones
bloqueada por una cadena lateral F o L. Para
Tropaeolum majus, una β-glucosidasa
eliminar este bloqueo se necesita la actividad de
perteneciente a la familia 3 de las glicosil
las otras dos enzimas α-L-fucosidasa y β-D-
hidrolasas (GH3), con actividad frente a
galactosidasa. Podría existir en la planta un
oligosacáridos de xiloglucano que presentan
mecanismo que regulase todas estas actividades
una glucosa no sustituida en su extremo no
exoglicosidasas, de forma que la planta pudiese
reductor (Crombie y col., 1998). Cuando la
modular la capacidad de las moléculas de
glucosa contigua lleva unida una galactosa, esta
xiloglucano como aceptoras de la XTH (Fry,
enzima no puede actuar, por lo tanto es activa
1995).
de
frente al oligosacárido XXXG pero no frente a
GLXG. Esto lleva a pensar que primero
Oligosacáridos de xiloglucano: Control del
actuarían el resto
crecimiento
crecimiento celular
de las
exoglicosidasas
eliminando la ramificación del extremo no
La degradación del xiloglucano ha sido
reductor para que posteriormente actuasen las
estudiada en detalle en semillas de Tropaeolum
glucosidasas sobre los restos de β-glucosa.
majus
(capuchina),
donde
constituye
el
principal polisacárido de reserva. Presenta una
24
Capítulo I: Introducción General
estructura similar al xiloglucano de las paredes
estructura y grado de polimerización (Hayashi
primarias
y Maclachlan, 1984), ya que sobre ellos actúan
de
tejido
vegetativo
con
la
particularidad de que no está fucosilado.
las
Durante
la
monosacáridos pueden estimular el crecimiento
movilización del xiloglucano, y se pudo
de la pared, siempre que estén presentes en la
comprobar que ésta ocurre en dos pasos. En
concentración adecuada. En este proceso,
primer lugar se hidrolizada en fragmentos
podrían intervenir las XTHs, que los utilizarían
grandes,
como
la
germinación
por
tiene
una
endotransglicosilasa
(XTH)
lugar
xiloglucano
con
exoglucanasas.
aceptores
de
Algunos
la
de
estos
transglicosilación
actividad
(Lorences y Fry, 1993). Estos oligosacáridos
hidrolítica, que rompe enlaces internos en los
pueden competir con las cadenas de xiloglucano
que participa el C1 de restos de glucosa no
preexistentes o recién sintetizadas, permitiendo
sustituidos, de modo que se generan nuevos
una mayor separación de las microfibrillas de
extremos reductores. Esta enzima es altamente
celulosa, con el consiguiente debilitamiento de
específica para el xiloglucano, siendo inactiva
la pared, sin llegar a desestructurarse, pero
frente a otros sustratos, tales como la celulosa
permitiendo que actúe sobre ella la presión de
abundante en la pared. Además combina la
turgencia. Por otro lado la separación de las
actividad endotransglicosilasa con la actividad
microfibrillas de celulosa produciría una mayor
glucanasa, y es similar a la enzima XTH que
tensión
actúa en tejidos vegetativos (Fanutti y col.,
propiciando la actuación de las expansinas.
1993).
en
las
cadenas
de
xiloglucano,
Como hemos visto con anterioridad, el
El segundo paso de la degradación del
xiloglucano presenta enlaces sobre los que
xiloglucano como vimos anteriormente consiste
puede actuar la endo-β-(1-4)-glucanasa, para
en la hidrólisis total para dar lugar a
dar lugar a oligosacáridos como XXFG, XXXG
monosacáridos, y requiere la actividad de tres
(Hayashi y col., 1984), XLXG, XXLG (Guillen y
enzimas hidrolíticas la β-galactosidasa, la α-
col., 1995), que podrían tener un papel
xilosidasa y la β-glucosidasa.
importante como reguladores del crecimiento.
La
presencia
de
Se ha comprobado que el oligosacárido XXFG, a
debe
una concentración 1nM, actúa como inhibidor
principalmente a la degradación de las cadenas
del efecto de la auxina 2,4-D, que estimula el
de xiloglucano polimérico por parte de las
crecimiento en condiciones normales (York y
endoglucanasas presentes en la pared. Los
col., 1984). Además, este oligosacárido inhibe
oligosacáridos obtenidos presentan distinta
también el estímulo de crecimiento producido
xiloglucano
en
de
el
oligosacáridos
apoplasto,
se
25
Capítulo I: Introducción General
mediante incubación en medio ácido (Lorences
determinada
y col., 1990), o en ácido giberélico (Warneck y
estructurales (Davies y Henrissat, 1995). Debido
Seitz, 1993). Esta capacidad inhibitoria parece
a que la estructura en sí, viene determinada por
estar relacionada con los restos de fucosa, ya
la secuencia, la estereoquímica y el resultado de
que se produce con oligosacáridos de fucosa,
la reacción se conserva dentro de cualquier
pero no con otros carentes de la misma.
familia de glicosil hidrolasas. No se encontró
Además, en concentraciones mayores (1μM), el
hasta el momento, ninguna excepción a esta
XXFG no sólo deja de inhibir el crecimiento en
afirmación, desde que fue propuesta por
respuesta a auxinas, sino que lo favorece.
Withers y colaboradores (Gebler y col., 1992).
por
mínimas
variaciones
Una de las características más importantes
Clasificación de las glicosil hidrolasas
de la clasificación es que, pese a la similitud de
Las glicosil hidrolasas (GH) y glicosil
la
secuencias,
algunas
familias
son
contienen
enzimas
con
transferasas (GT) son enzimas que actúan sobre
poliespecíficas,
carbohidratos (Carbohydrate Active enZymes,
diferente especificidad de sustrato o producto,
CAZy) y que se clasifican en base a la similitud
lo que es indicativo de una divergencia
en su secuencia aminoacídica (Henrissat, 1991;
evolutiva que propició la adquisición de nuevas
Henrissat y Bairoch, 1993; Davies y Henrissat,
funciones. Por ejemplo, las celulasas, aparecen
1995; Henrissat y Bairoch, 1996; Campbell y
en las familias GH5-GH9, GH12, GH26, GH44,
col., 1997; Henrissat y Davies, 1997; Coutinho y
GH45, GH48 y GH61, con lo cual las
Henrissat, 1999). Hasta octubre 2007 se han
estructuras 3D que presentan son muy variadas,
descrito 110 familias de glicosil hidrolasas y 90
por pertenecer a familias distintas. De las 110
familias de glicosil transferasas.
familias de glicosil hidrolasas, se conocen las
La clasificación de las familias basada en la
estructuras 3D de muchas de ellas.
similitud de la secuencia aminoacídica fue
Las glicosil hidrolasas son las mejor
extremadamente útil para la caracterización
caracterizadas de todas las enzimas que actúan
tridimensional de las enzimas incluidas en cada
sobre carbohidratos. Llevan a cabo la hidrólisis
familia (Henrissat y Davies, 1997), ya que se
ácido-base de los enlaces glucosídicos que
comprobó con posterioridad, que dentro de una
pueden conducir a la inversión o retención de
familia
la configuración anomérica, dependiendo de la
determinada,
tridimensional
se
estructura
Como
familia de enzimas. Numerosas revisiones de su
resultado del análisis funcional de las enzimas,
estructura, función y mecanismos catalíticos,
se observó que la especificidad de sustrato viene
están disponibles (Sinnott, 1990; McCarter y
26
(3D)
la
conserva.
Capítulo I: Introducción General
Withers, 1994; Davies y Henrissat, 1995;
biosintéticas
Zechel y Withers, 2000). Las reacciones de
transglicosilasas responsables de la hidrólisis y
inversión emplean un solo mecanismo clásico
creación
de dislocación, mientras que la retención se
hidrólisis del almidón es realizada por α y β-
lleva a cabo por una vía doble que implica la
amilasas y β-glucosidasas. En Arabidopsis, la
formación e hidrólisis consecuente de un
maquinaria
intermediario covalente. Una característica
degradación del almidón se encuentra entre las
importante del mecanismo de retención, de
familias GT5, GT35, GH13, GH14, GH31 y
importante relevancia para la bioquímica de la
GH77. La familia GH17, en cambio, está
planta es que el intermediario de reacción,
relacionada con mecanismos de defensa, en
puede ser interceptado por nucleófilos en un
concreto con la respuesta patógeno-huésped.
proceso denominado transglicosilación. En
Enzimas hidrolíticas, β-glucosidasas, tales como
plantas, esta reacción puede desempeñar un
la mirosinasa, se encuentran en la familia GH1.
importante
las
Otro ejemplo, serían las enzimas que llevan a
xiloglucanoendotransferasas que se relacionan
cabo la glicosilación con función de defensa,
con la familia GH16. Arabidopsis contiene un
que están mayoritariamente en la familia GT1.
total de más de 730 glicosil hidrolasas y glicosil
Estas
transferasas, que son muchas más de las que
nucleótido
contienen ningún otro eucariota estudiado
adecuado. La multiplicidad de enzimas en GT1
hasta el momento.
refleja la gran variedad de aceptores específicos.
papel,
como
ocurre
con
(sintasas
de
puntos
completa
glicosil
y
de
fosforilasas),
ramificación.
para
transferasas
correspondiente
la
síntesis
reconocen
y
el
y
La
y
el
aceptor
Las enzimas incluidas en estas familias
El número de enzimas incluidas en las
desempeñan muy diversas funciones, por
diferentes familias se ha ido incrementando a lo
ejemplo, las plantas usan como material de
largo del tiempo y probablemente continuará
reserva
aumentando.
el
almidón,
una
macromolécula
compleja que se sintetiza por acción de enzimas
27
Capítulo I: Introducción General
Objetivos
El objetivo general de este trabajo es el
3.
Estudio
de
ambas
actividades
estudio y caracterización de las β-glucosidasas y
exoglicosidasas en el apoplasto de Arabidopsis
β-galactosidasas apoplásticas de Arabidopsis
thaliana y sobre oligosacáridos de xiloglucano,
thaliana. Ambos tipos de enzimas están
así como los posibles efectos fenotípicos de la
implicadas en el metabolismo del xiloglucano,
ausencia de dichas actividades.
de forma que pueden jugar un papel importante
en el crecimiento celular y por lo tanto en el
4. Caracterización estructural de diferentes
desarrollo de la planta. Los principales objetivos
mutantes knockout de las β-glucosidasas y β-
de este trabajo se pueden resumir en los
galactosidasas de interés.
siguientes puntos:
5. Análisis de la actividad de diferentes
1. Caracterización de las β-glucosidasas,
mutantes seleccionados, tanto de β-glucosidasas
pertenecientes a la familia 3 de las glicosil
como de β-galactosidasas, frente a diferentes
hidrolasas, y β-galactosidasas, pertenecientes a
oligosacáridos de xiloglucano.
la familia 35 de las glicosil hidrolasas, de
Arabidopsis
thaliana
que
puedan
Los puntos anteriores serán ampliamente
estar
desarrollados a lo largo de este trabajo a fin de
implicadas en el metabolismo del xiloglucano
caracterizar en detalle ambas actividades y
y/o de sus oligosacáridos.
determinar su papel en el metabolismo del
xiloglucano.
2. Análisis de expresión de las posibles βglucosidasas
y
β-galactosidasas
objeto
de
estudio, en diferentes regiones de la planta y en
diferentes estados de desarrollo.
28
Capítulo II: β-glucosidasas de
Arabidopsis thaliana
Capítulo II: β-glucosidasas de Arabidopsis thaliana
o xiloglucano endotransglicosilasas (Edwards y
II.1. Introducción
Es
indiscutible
col., 1986; Farkas y col., 1992; Fanutti y col.,
la
importancia
del
1993; De Silva y col., 1993; Fanutti y col., 1996;
xiloglucano, ya que es el principal polisacárido
Chanliaud y col., 2004), pueden liberar
hemicelulósico de la pared celular primaria de
oligosacáridos de xiloglucano, algunos de los
plantas de tipo I, como Arabidopsis thaliana
cuales tienen capacidad para modular el
(Hayashi, 1989; Fry, 1989; Zablackis y col.,
crecimiento de la planta (Creelman y Mullet,
1995). Por un lado, es fundamental para el
1997). La formación de dichos oligos in vivo,
mantenimiento de la arquitectura de la pared
por hidrólisis del XyG preexistente, fue
(Cosgrove, 2001), y por otro, es blanco de
observada en cultivos de células en suspensión
enzimas implicadas en la extensión de la pared
(Fry, 1986; Baydoun y Fry, 1989; McDougall y
celular. Mediante la rotura y reestructuración
Fry, 1991).
de sus cadenas permite la separación de las
Hay varias exoglicosidasas capaces de
microfibrillas de celulosa al mismo tiempo que
actuar
mantiene la estructura de la pared. El
oligosacáridos en las paredes celulares de
xiloglucano es un polímero constituido por una
plantas (Fry, 1995) que son capaces de
cadena lineal de β-(1→4)-D-glucano, en la que
degradarlos
la mayoría de los residuos de glucosa están
correspondientes. Estas glicosidasas son las α-
sustituidos con una α-(1→6)-D-xilosa que a su
fucosidasas, β-galactosidasas, α-xilosidasas y β-
vez puede estar sustituida con residuos de
glucosidasas. Estas glicosidasas actuando sobre
galactosa, que pueden llevar unido o no un
los oligosacáridos del xiloglucano (XXFG,
resto de fucosa.
XLFG, XXXG, etc) por el orden mencionado
sobre
el
hasta
xiloglucano
sus
y/o
sus
monómeros
Las cadenas de xiloglucano se unen a las
con anterioridad darán lugar a la degradación
microfibrillas de celulosa de la pared celular,
de los mismos. En este capítulo estudiaremos
mediante puentes de hidrógeno, para dar lugar
las β-glucosidasas y su acción eliminando la
a la red XyG-Celulosa (Bauer y col., 1973;
glucosa no susbtituída del extremo no reductor
Hayashi y Maclachlan, 1984). La naturaleza
de los oligosacáridos del xiloglucano.
dinámica de esta red es el factor más
A partir de los cotiledones de Tropaeolum
importante que controla el grado de extensión
majus L. se purificó una β-glucosidasa capaz de
de la pared. Las moléculas de xiloglucano, por
hidrolizar
acción específica de endo-β-(1→4)-glucanasas
disacáridos de glucosa y ciertos oligosacáridos
p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido,
31
Capítulo II: β-glucosidasas de Arabidopsis thaliana
de xiloglucano. Esta β-glucosidasa actúa frente
glucosidasas en Arabidopsis thaliana, con el
a oligos que presentan una glucosa no
objeto de identificar cuál o cuáles de ellas
sustituida en su extremo no reductor (Crombie
podrían participar en la degradación del
y col., 1998), como GXXG, GXLG. Sin
xiloglucano. De estas, se han seleccionado las
embargo, cuando la glucosa contigua lleva
cuatro de mayor similitud a la identificada por
unido un resto de galactosa, esta enzima no
Crombie y col. que son las codificadas por los
puede actuar, por lo tanto no es activa frente a
genes At5g20950, At5g20940, At5g04885 y
oligosacáridos tales como GLXG o GLLG. Esto
At3g62710 que a partir de ahora pasamos a
lleva a pensar que primero actuarían el resto de
denominar AtBGLC1, AtBGLC2, AtBGLC3 y
exoglicosidasas, que eliminarían la ramificación
AtBGLC4 respectivamente.
del extremo no reductor, para permitir la
En este capítulo, estudiaremos las posibles
actividad de las glucosidasas, que eliminarían
variaciones
finalmente el residuo de β-glucosa. En el caso
glucosidasas en diferentes órganos de la planta
de la β-glucosidasa de Tropaeolum, se obtuvo
y en diferentes estados de desarrollo. Para
un DNA completo de 1962 bp, que codifica un
comprobar si su expresión es mayor en zonas
polipéptido de 654 aminoácidos, incluyendo el
en crecimiento activo, lo que sería indicativo
extremo N-terminal y una región de señal
de su implicación en el crecimiento de la
hacia el apoplasto, el número de acceso de
pared. Además se caracterizará la acción in
dicha proteína es EC 3.2.1.21. Además, las
vivo, en el fluido apoplástico de Arabidopsis
búsquedas en la base de datos revelaron que
thaliana, de las glucosidasas utilizando como
presentaba homología con otras glucosidasas de
sustrato específico XXXG y analizando los
bacterias, plantas y levaduras. El estudio de la
productos de degradación mediante MALDI-
secuencia, permitió incluirla dentro de la
TOF MS. Se estudiarán además mutantes
familia 3 de las glicosil hidrolasas (GH3) de
knockout de Arabidopsis para los cuatro genes
acuerdo con la clasificación de Henrissat
citados, mediante la degradación de sus paredes
(Henrissat, 1991).
con una endo-β-(1-4)-glucanasa y el análisis de
En función de la similitud con la βglucosidasa de Tropaeolum majus, que ha sido
clonada y cuya actividad frente a oligosacáridos
de xiloglucano ha sido demostrada, hemos
realizado
32
una
búsqueda
de
posibles
β-
en
la
expresión
de
dichas
los oligosacáridos producto de la degradación.
Capítulo II: β-glucosidasas de Arabidopsis thaliana
II.2. Materiales y Métodos
Los mutantes correspondientes a los locus
II.2.1. Material vegetal
AtBGLC2 y AtBGLC3 se obtuvieron de
Plantas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh
Syngenta Arabidopsis Insertion Library (SAIL),
ecotipo Columbia 0, se crecieron en cámara a
y actualmente están disponibles en Arabidopsis
25°C con un fotoperíodo de 16:8 luz/oscuridad,