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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CAPACES DE
DEGRADAR CIANURO PRESENTES EN MUESTRAS OBTENIDAS DEL
PROCESO DE EXTRACIÓN DE ALMIDÓN DE YUCA
CATALINA MOSQUERA SALCEDO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
DEPARTAMENTO CIENCIAS QUÍMICA
PROGRAMA QUÍMICA
SANTIAGO DE CALI
2013
1
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CAPACES DE
DEGRADAR CIANURO PRESENTES EN MUESTRAS OBTENIDAS DEL
PROCESO DE EXTRACIÓN DE ALMIDÓN DE YUCA
CATALINA MOSQUERA SALCEDO
Proyecto de grado
Tutor del proyecto de Investigación:
Dr. Aram Joel Panay Escobar
UNIVERSIDAD ICESI
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
DEPARTAMENTO CIENCIAS QUÍMICA
PROGRAMA QUÍMICA
SANTIAGO DE CALI
2013
2
APROBADO POR:
_________________________
(Nombre Correspondiente)
Director del Proyecto.
___________________________
(Nombre Correspondiente)
Director ó Co-Director del Proyecto.
_________________________
(Nombre Correspondiente)
Evaluador
_________________________
(Nombre Correspondiente)
Evaluador
3
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN DEL PROYECTO ................................................................................ 5
1.
INTRODUCCIÓN. ............................................................................................ 6
2.
DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO ................................................................... 8
2.1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................ 8
2.2 MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE................................................... 9
2.3
OBJETIVOS ........................................................................................... 17
Objetivo general ................................................................................................ 17
Objetivos específicos ........................................................................................ 17
2.4
METODOLOGÍA UTILIZADA .................................................................. 18
Preparación de la muestra ............................................................................. 18
Selección e identificación .............................................................................. 18
Verificación de la capacidad degradadora de cianuro .................................... 20
Preservación de las muestras. ....................................................................... 20
Identificación bacteriana ................................................................................ 20
Optimización de la concentración de KCN para crecimiento bacteriano ....... 22
Cuantificación de degradación de cianuro .................................................... 22
2.5 RESULTADOS ............................................................................................ 24
Crecimiento bacteriano .................................................................................. 24
Selección e identificación de las UFC degradadoras de cianuro .................... 25
Identificación bacteriana ................................................................................ 29
Cuantificación de degradación de cianuro .................................................... 31
2.6 DISCUSIÓN ................................................................................................ 34
2.7 CONCLUSIONES........................................................................................ 39
2.8 RECOMENDACIONES ............................................................................... 40
3.11 REFERENCIAS ............................................................................................ 41
ANEXOS .............................................................................................................. 44
4
RESUMEN DEL PROYECTO
El cianuro es un compuesto utilizado en varios procesos en la industria de
plásticos, la producción de revelado fotográfico, productos farmacéuticos,
químicos orgánicos, además es altamente utilizado en la minería de oro y plata
(Neha Gupta, 2010). El cianuro es una sustancia tóxica, es un inhibidor
competitivo de la enzima citocromo C oxidasa, también se puede unir a
metales que son cofactores de algunas enzimas que se necesitan en varios
procesos esenciales para los seres vivos. Existen varios procesos
fisicoquímicos que permiten desactivar el cianuro de forma eficiente, como: la
cloración alcalina, la ozonización en presencia de luz ultravioleta, el tratamiento
con peróxido de hidrogeno, la adsorción en gránulos de carbono activado y
procesos de aire/dióxido de sulfuro. Todos estos procesos tienen en común
que son costosos, y algunos de los subproductos de la reacción pueden llegar
a ser más tóxicos que el mismo cianuro. Por otro lado, se sabe que existen
bacterias que presentan la capacidad de degradar el cianuro introduciéndolo a
su metabolismo. Estos microorganismos son la base para procesos de
biorremediación, menos costosos, más limpios e igualmente efectivos que su
contraparte sintética en la remoción del cianuro.
En este estudio se aislaron bacterias degradadoras de cianuro presentes en
una rallanderia de yuca, puesto que esta tiene glucosidos cianogenicos y en el
proceso de extracción, se libera cianuro. Las bacterias fueron aisladas en un
medio astringente que tenía como única fuente de carbono y nitrógeno el
cianuro. Después las bacterias fueron seleccionadas de acuerdo a su
morfología externa, se realizaron pruebas bioquímicas y MALDI-TOF para su
identificación. Por último, se cuantifico la cantidad de cianuro degradado en los
cultivos líquidos.
Se encontraron 7 morfologías diferentes de las cuales, las pruebas bioquímicas
reportaron 4 microorganismos diferentes Rhizobium radiobacter, Acinetobacter
Iwoffii, Cupriavidus pauculus y Methylobacterium spp y una cepa no fue
identificada. Las 7 cepas presentaron un porcentaje de remoción de cianuro
mayor al 95 % del medio líquido al cabo de 10 días.
5
1. INTRODUCCIÓN.
El cianuro es un compuesto utilizado en varios procesos en la industria de
plásticos, la producción de productos químicos orgánicos, revelado fotográfico,
productos farmacéuticos y minería de oro y plata (Neha Gupta, 2010). Es una
sustancia tóxica, es inhibidor competitivo de la enzima citocromo C oxidasa,
también se puede unir a metales que son cofactores de algunas enzimas que son
necesarias en varios procesos vitales para los seres vivos.
Colombia es un país con gran explotación de minería aurífera. Gran parte de la
explotación se ha venido realizando a cielo abierto de forma artesanal y en la
mayoría de los casos no se tiene el cuidado adecuado ni el tratamiento de los
residuos del proceso, haciendo que los mismos se depositen en ríos y suelos
contaminando profundamente el medio ambiente (Slee, Birss, Lefebvre, & Bauer,
2011). El cianuro y el mercurio son los principales subproductos de la minería
aurífera.
El ácido cianhídrico es incoloro, es un ácido débil con pKa 9,2. Es volátil y en
medios acuosos se disocia parcialmente y produce cianuro (CN -). El cianuro
también es producido en procesos como la extracción de almidón de yuca. La
yuca tiene la capacidad de producir ácido cianhídrico (HCN), puesto que produce
dos, glucosidos cianogenicos la linamarina y la lotaustralina. En el proceso de
extracción del almidón de yuca, estas dos moléculas son hidrolizadas por la
enzima linamarasa y el HCN se evapora dejando el almidón apto para el consumo
humano (S. A. J. A. Essers,1993). La presencia de cianuro en este proceso nos
lleva a proponer que una planta de producción de almidón de yuca es un buen
lugar para encontrar bacterias que sean capaces de tolerar y metabolizar el
cianuro.
Se ha reportado que existen diferentes bacterias que tienen la capacidad de
degradar cianuro. Algunas son capaces de utilizarlo como fuente de nitrógeno y
carbono incorporándolo en sus rutas metabólicas normales. Estos
microorganismos podrían ser usados como una estrategia de biorremediación
para descontaminar ambientes afectados con cianuro. Comparado con los demás
tratamientos existentes para reducir desechos de cianuro, la biorremediación es
una buena alternativa puesto que contrariamente a los tratamientos físicoquímicos (Cloración alcalina, la ozonización en presencia de luz ultravioleta, el
tratamiento con peróxido de hidrogeno, la adsorción en gránulos de carbono
activado y procesos de aire/dióxido de sulfuro) los subproductos como amino,
dióxido de carbono, ácido fórmico y formamida, son prácticamente inocuos.
Adicionalmente, para la biorremediación la relación costo/efecto es menor
comparada con otras metodologías, porque generalmente no requiere gran
6
inversión en los componentes mecánicos y estructurales ni el tratamiento de los
desechos generados.
Los reportes de bacterias degradadoras de cianuro como Alcaligenes xylosoxidans
subsp. Denitrificans DF3 y Bacillus pumilus C1; sumado a la apremiante realidad
nacional donde diariamente se están depositando litros de cianuro en los ríos y
zonas vírgenes afectando de forma irreparable la biodiversidad han despertado el
interés de subrayan la necesidad de estandarizar una metodología para la
selección y el aislamiento de bacterias capaces de degradar cianuro. Por lo tanto,
se espera que las bacterias encontradas en este proyecto de investigación
puedan ser utilizadas como futuras alternativas de biorremediación para degradar
el cianuro de una forma eficiente y más limpia.
7
2. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO
2.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El cianuro es un compuesto tóxico que inhibe la enzima citocromo C oxidasa, esta
enzima es la última proteína en la cadena de transporte de electrones, al inhibir la
cadena de transporte se inhibe la síntesis de ATP. Adicionalmente, el cianuro
presenta la capacidad de unirse a metales que son cofactores de algunas enzimas
necesarias en los procesos vitales, por ejemplo, níquel, hierro, cobalto, zinc, entre
otros (M. Barclay, 1998). Actualmente la contaminación por cianuro en los suelos
del suroccidente colombiano aumenta como consecuencia de la explotación
aurífera.
Colombia produce alrededor de 40 toneladas anuales de oro y el plan visión
pronostica que para el año 2019 se espera que alcance las 80 toneladas, gran
parte de este oro tiene un proceso de explotación de baja calidad (Slee, Birss,
Lefebvre, & Bauer, 2011). Es decir, los residuos que se generan por la explotación
de la minería no son tratados como deberían, puesto que, la explotación minera se
realiza a campo abierto, los residuos se depositan en ríos y suelos contaminando
profundamente el medio ambiente.
Existen diversas técnicas que permiten degradar el cianuro de forma eficiente,
pero muy costosa, como por ejemplo la cloración alcalina, ozonización en
presencia de luz ultravioleta, peróxido de hidrogeno, adsorción en gránulos de
carbono activado, procesos de aire/dióxido de sulfuro, entre otros (Neha Gupta,
2010). Una de las potenciales herramientas de remediación de la contaminación
por explotación aurífera es la biorremediación. Ésta representa una solución
económica y eficiente para la degradación de cianuro, además de ser una
estrategia amigable con el medio ambiente. En esta propuesta se busca
establecer una metodología que permita la selección de bacterias capaces de
reducir la concentración de cianuro por acción metabólica, con el fin de identificar
potenciales herramientas de biorremediación.
8
2.2 MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE
Uno de los mayores contaminantes producidos por la minería aurífera es el
cianuro. Éste es un anión monovalente, que presenta un triple enlace entre un
átomo de carbono y un átomo de nitrógeno (Figura 1). El cianuro es una sustancia
altamente tóxica, por ser un inhibidor competitivo de la enzima citocromo c
oxidasa, ya que reacciona con la forma férrica del hemo a3, la inhibición de la
cadena transportadora finalmente inhibe la síntesis de ATP porque no puede
producirse la fuerza protón motriz. Adicionalmente, el cianuro se puede unir a
metales como el hierro, el cobalto, y el molibdeno, entre otros. Estos metales son
cofactores de muchas enzimas que son necesarias en varios procesos vitales (M.
Barclay, 1998).
Figura 1. Estructura química y distribución electrónica del cianuro.
Con el fin de remover el cianuro se han implementado diferentes tecnologías que
consisten en tratamientos físicos y químicos; estas técnicas son muy efectiva pero
altamente costosas y algunas de éstas pueden generar subproductos que pueden
ser mucho más nocivos que el cianuro para el ser humano y el medio ambiente.
Entre estos métodos esta la cloración alcalina, la ozonización en presencia de luz
ultravioleta, el peróxido de hidrogeno, la adsorción en gránulos de carbono
activado, hipoclorito de calcio y los procesos de aire/dióxido de sulfuro, entre otros
(Neha Gupta, 2010).
Una de las tecnologías utilizadas es el tratamiento con hipoclorito de calcio, se
oxida el cianuro a cianato de calcio y a pH acido, éste se descompone y forma
bicarbonato y amino. El tratamiento tiene como desventaja la formación de
compuestos intermedios tóxicos como organoclorados y, al medio ambiente se
libera cloro residual y cloruros. Adicionalmente, se requieren condiciones alcalinas
muy fuertes, alto consumo de oxidante y parámetros, tales como sólidos en
9
suspensión, concentración de metales y las concentraciones de complejo
formados con cianuro (A. Khodadad, 2008).
En las últimas décadas se han ido desarrollando nuevas tecnologías de
descontaminación de cianuro que son más amigables con el medio ambiente. La
biorremediación consiste en utilizar hongos, plantas o microrganismos en medios
que presentan algún tipo de contaminación con el fin de aprovechar los procesos
catabólicos de estos organismos para minimizar los desequilibrios creados en el
medio ambiente. Los primeros casos de biorremediación se observaron en los
vertimientos de petróleo, cuando se descubrieron microrganismos que podían
sobrevivir en estas condiciones y eran capaces de degradar compuestos
orgánicos (Alfreda O. Nwadinigwe, 2012). La biorremediación además de ser un
proceso amigable con el medio ambiente también es económico y en algunos
casos se han logrado remociones altas (>90%) de los contaminantes.
La biorremediación elimina los residuos de forma permanente y ésta tecnología
puede ser acoplada con otros tratamientos fisicoquímicos. La técnica utilizada
debe adaptarse a las condiciones específicas del lugar donde se va a llevar a cabo
el proceso, esto significa que se tiene que realizar estudios de tratamiento en una
pequeña escala antes de implementar el saneamiento al sitio expuesto. Por lo
que antes de llevar a cabo el proceso, se deben plantear las siguientes preguntas:
¿Son las condiciones ambientales apropiadas para la biodegradación? Si el
residuo no es completamente biodegradable, ¿A dónde va a ir? Las respuestas a
éstas preguntas se obtienen haciendo la caracterización del sitio y estudios acerca
de las rutas (Boopathy, 2000).
Se conocen microorganismo que tienen la capacidad de degradar cianuro, los
cuales usan el cianuro como fuente de nitrógeno y carbono. Estos organismos no
presentan envenenamiento por causa del cianuro, puesto que, algunos de ellos
cuentan con rutas alternativas para la producción de ATP y otros poseen una
oxidasa diferente a la citrocromo C oxidasa, enzima inhibida directamente por el
cianuroJ.N. Siedow, 1995).
La figura 2 muestra las tres enzimas que pertenecen a la ruta metabólica
hidrolitica conocidas para la degradación del cianuro, en las cuales las enzimas
que actúan catalizan la degradación de cianuro a moléculas orgánicas e
inorgánicas más simples como amonio, dióxido de carbono, acido fórmico y
formamida (Neha Gupta, 2010)
10
HCN
Cianuro
dihidratasa
Cianasa
Cianuro
Hidratasa
CO2 + NH3
HCOOH + NH3
HCONH2
Figura 2 Rutas metabolicas hidroliticas conocidas para la degradación del
cianuro
La primera ruta metabólica encontrada principalmente en hongos, es la ruta
hidrolítica. La primera enzima de esta ruta es la cianuro hidratasa (EC 4.2.1.66). La
cual degrada el CN en un mecanismo que consta de dos pasos: El primero es la
conversión de cianuro en formamida. El segundo paso es la descomposición de la
formamida en dióxido de carbono y amonio, Esta reacción está a cargo de la
formamida hidratasa, estas reacciones se favorecen en ambientes alcalinos. Hasta
el 2010 se han registrado 5 microrganismos que presentan la cianuro hidratasa,
pero funcionan a temperaturas y pH diferentes, todos esos organismos utilizan el
cianuro como fuente de nitrógeno (Neha Gupta, 2010).
La ruta de degradación hidrolitica del HCN está encabezada por la enzima nitrilo
hidratasa (EC. 4.2.1.84), esta enzima tiene la capacidad de degradar gran
variedad de nitrilos, por ejemplo los nitrilos alifáticos. La enzima necesita usar
cobalto como cofactor. Para degradar compuestos que contengan cianuro se ha
observado la presencia de la nitrilo hidratasa con otra enzima llamada amidasa
(EC 3.5.1.4). Primero la nitrilo hidratasa convierte los diferentes nitrilos en una
amida intermediaria, que es usada como sustrato de la amidasa y es transformada
en el ácido correspondiente liberando amonio. Los organismo encontrados que
presentan acopladas estas dos enzimas han sido utilizados en la industria para la
producción de acrilamida a partir de acrilonitrilo, adicionalmente ha sido usada
con fines de biorremediación (Neha Gupta, 2010).Estas enzimas se han
encontrado en bacterias que viven en medios con diversas características por
ende las condiciones de pH y temperatura optimas de las enzimas dependen de
la especie a la que pertenecen (Neha Gupta, 2010).
La tercera ruta hidrolitica es la iniciada por la cianuro dihidratasa (EC 3.5.5.1) o
cianidasa, que cataliza la hidrólisis de cianuro a ácido carboxílico y amonio sin la
necesidad de formación de una amida intermedia. Estas enzimas están
involucradas en la biosíntesis de proteínas y hay modificaciones posttranscripcionales en plantas, animales, hongos y algunos procariotas. Esta enzima
11
no necesita de un cofactor pero se ha observado que la presencia de iones como
Sc3+ , Cr+`, Fe3+ o Th3+ mejora su rendimiento. Esta enzima convierte
directamente el cianuro al ácido orgánico correspondiente y amonio. Esta ruta se
ha encontrado en bacterias como Alcaligenes xylosoxidans subsp. Denitrificans
DF3, Bacillus pumilus C1 y Pseudomonas stutzeri AK61 (Neha Gupta, 2010).
Finalmente existe la ruta oxidativa de degradación de cianuro. En ésta se
convierte el cianuro en dióxido de carbono y amonio generalmente usando
NADPH. Debido a la volatilización del CO 2, los microrganismo que presentan la
ruta oxidativa necesitan otra fuente de carbono aparte del cianuro. Se conocen
solamente dos enzimas que participan en esta ruta, la cianasa y la cianuro
dioxigenasa. La reacción que cataliza la primera enzima se muestra a
continuación: (Raybuck, 1992)
HCN + O2 + 2 H+ + NADPH → NADH + CO2 + NH3
Esta enzima se ha observado principalmente en hongos como Trametes versicolor
ATCC 200801, Phanerochate chrysosporium ME 496 y Pleurotus sajor- caju de los
cuales el más efectivo es T.versicolor (D.A. Kunz C. W., 1994). Hasta el momento
esta vía de degradación solo ha sido observada en un microorganismo,
Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764. (D.A. Kunz R. F., 2000). Estudios
mecanisticos con esta esta enzima mostraron un intermediario monooxigenado, el
cual es hidrolizado posteriormente para dar como productos amonio y dióxido de
carbono. A continuación se muestra el mecanismo propuesto:
HCN + O2 + NADPH → NADH + H3 [X − OH]
→ H2 O + NAD + +[X − OH] + H2 O
→ 3NH3 + CO2
Estudios realizados con el hongo Trametes versicolor en el año 2006 mostraron
que la cianuro dioxigenasa usa como cofactor la pterina (A. Cabuk, 2006). Esta
dependencia también fue observada en bacterias como Pseudomonas fluorescens
donde la cianuro oxigenasa presenta propiedades de hidrolasa dependiente de
pterina (D.A. Kunz R. F., 2000). La pterina es un heterocíclico que consta de dos
anillos de pteridina con un grupo ceto en la posición 4 y un amino en la posición 2.
La cianasa es una enzima de expresión inducible por medio de cianuro que
cataliza la conversión de cianuro a cianato y después se convierte a amonio y
dióxido de carbono (Neha Gupta, 2010).
HCN − + O2 + 2 H + + NADPH → CNO− + NADP + 2H2 O
CNO− + 3H+ + HCO3 → NH4+ + 2CO2
12
Estudios han revelado que Pseudomona putida, utiliza el cianuro como única
fuente de nitrógeno y carbono. La enzima presente en este organismo usa como
sustrato no solamente cianuro sino también tiocianatos y cianatos (V.M LuqueAlmagro, 2005). A su vez, se ha observado que esta enzima puede utilizar como
sustratos complejos metálicos en los que uno de sus ligandos sea el cianuro Neha
Gupta, 2010), lo que hace que este microorganimos pueda ser utilizado para
bioremediación, puesto que no solo degrada el cianuro libre.
El porcentaje de remoción de cianuro alcanzado por un cultivo microbiano
depende de la vía metabólica que se use para la degradación, pero se reporta en
general un porcentaje de remoción entre 50- 80 % con respecto a la concentración
inicial de cianuro. Por ejemplo para Agrobacterium tumefaciens SUTS se reportó
un porcentaje de remoción de 75 % en 7 días y 87.50 % en 15 días (S.
Potivichayanon, 2010). Estos resultados sugieren la importancia de la
investigación encaminada a encontrar microorganismos capaces de degradar
cianuro y entender el mecanismo del proceso como una alternativa factible de
biorremediación de ambientes contaminados. Además de los posibles usos en
procesos de biorremediación estos microorganismos y sus enzimas también
presentan un potencial de desarrollo económico al ser usadas en procesos
industriales. Por ejemplo las bacterias que contienen la nitrilo hidratasa Bacillus
sp. y Corynebacterium sp C5, han sido usadas en la industria para producir
ácidos carboxílicos a partir del compuesto correspondiente nitrilado.
Diversos estudios reportados hasta el momento describen metodologías para
aislar bacterias degradadoras de cianuro de diversos ambientes. El objetivo inicial
del presente proyecto era aislar e identificar bacterias capaces de degradar
cianuro provenientes de suelos del Valle de Cauca, expuestos a procesos de
minería aurífera. Sin embargo, debido a la dificultad de acceso a estos terrenos se
decidió cambiar el enfoque e intentar aislar estos microorganismos de sitios
habitualmente expuestos a cianuro, como son las plantas procesadoras de
almidón de yuca que son abundantes en los departamentos del Valle del Cauca y
del Cauca.
Existen muchas plantas, por lo menos 2.000 especies agrupadas en 110 familias,
incluyendo la yuca (Manihot esculenta Crantz) que tienen la capacidad de producir
ácido cianhídrico (HCN) por la vía de la cianogénesis (M. Bokanga,1995). El HCN
no se produce normalmente en la planta, por el contrario ésta los sintetiza y los
acumula en forma de dos glucósidos cianogénicos linamarina y la lotaustralina en
una proporción aproximada de 20:1 (S. A. J. A. Essers,1993). Figura 3.
13
A
B
Figura 3. Estructura química de linamarina(a) y lotaustralina (b).
Cuando se rompen los tejidos vegetales la lotaustralina y linamarina, pueden ser
hidrolizados por la linamarasa, una enzima que rompe los glúcidos cianogenicos
produciendo cianhidrína de acetona (2-hidroxi-2-metilpropanonitrilo) y glucosa. La
cianohidrina de acetona en condiciones alcalinas se hidroliza produciendo cianuro
libre, Figura 4 (Kuakoon Piyachomkwana, 2005).
H2O
CH3
H3C
C
C
Linamarasa
(B-Glucosidasa)
CH3
H3C
N
C
C
N
OH
O
C6H12O11
C6H11O5
Cianohidrina de
Acetona
Glucosa
Linamarina
cianuro)
Enlace
(
pH>5
O
H3C
C
CH3
Acetona
+
HC
N
Cianuro de Hidrogeno
(Cianuro libre)
Figura 4. Degradación de linamarina a cianuro libre y acetona.
14
La concentración de compuestos cianogénicos en las raíces de la yuca es variada
dependiendo de la especie, pero en general el contenido de cianuro está en un
rango de 50-100 mg equivalentes por kg de material vegetal (E.R Jansz, 1997).
En los
departamentos del Valle del Cauca y del Cauca existen varias
microempresas que se dedican a la producción de almidón de yuca, conocidas
como rallanderias. En este proceso las raíces son lavadas, ralladas y se pasan a
través de una serie de extractores de diferentes diámetros para producir una
suspensión de almidón. El almidón se separa mediante decantación y es
fermentado en tanques durante varios días, allí los glucósidos cianogénicos se
hidrolizan por acción enzimática produciendo cianuro (HCN) libre, el cual se
evapora. Finalmente el almidón apto para el consumo humano se concentra con
separadores, retirando el agua y secándolo al aire libre (K. Piyachomkwana,
2005).
En estudios anteriores se ha evaluado la cantidad de compuestos cianogénicos
incluyendo el cianuro libre y la cianohidrina, en una fábrica de producción de
almidón de yuca que tiene una capacidad de producción de 100 toneladas de
almidón por día. Se reporta que la cantidad total de compuestos cianogenicos que
entran al proceso está entre 28-43 kg equivales de HCN por día, esto varía
dependiendo de la yuca. El almidón final contiene menos de 2 mg equivalentes de
HCN por kilogramo de almidón seco, por tanto es totalmente apto para consumo
humano (K. Piyachomkwana, 2005).Sin embargo, los desechos líquidos y sólidos
contienen el 92% y el 5 % del contenido inicial de cianuro presente en las raíces.
La concentración a la cual están expuestas la bacterias en éste proceso varían de
acuerdo a la cantidad de yuca procesada. En la tabla 1, se muestra el porcentaje
de distribución de cianuro en cada uno de los estadíos del proceso. Como se
observa la mayor cantidad de compuestos cianogénicos la presentan las raíces
raspadas y el primer proceso de extracción. El almidón seco, hidratado y el vapor
de agua presentan el menor porcentaje de distribución de cianuro. Por esta razón
se presume que al analizar muestras de una rallanderia de yuca para el
aislamiento de bacterias capaces de degradar cianuro podría no solo encontrarse
dichos microorganismos sino que algunos de ellos no habrán sido aislados ni
caracterizados anteriormente (K. Piyachomkwana, 2005).
15
Tabla 1 Distribución de los compuestos cianogénicos totales durante almidón de
procesamiento
Muestra/Proceso
Raíces frescas
Raíces lavadas
Raíces raspadas
Suspensión extracción almidón grueso
Suspensión extracción almidón fino 1
Suspensión extracción almidón fino 2
Suspensión de separación 1
Suspensión de separación 2
Almidón hidratado
Almidón Seco
Agua de Raspado
Agua de Secado
Aguas Residuales
Pulpa de yuca
Vapor de agua
% de
distribución de
cianuro
100
96,93
140,01
116,15
99,21
91,75
31,04
11,82
1,96
0,41
43,08
9,86
91,93
5,19
1,5
El porcentaje de distribución de cianuro es calculado de la siguiente forma (K.
Piyachomkwana, 2005):
% 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒔𝒕𝒓𝒊𝒃𝒖𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆 𝒄𝒊𝒂𝒏𝒖𝒓𝒐 =
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐𝒔 𝒄𝒊𝒂𝒏𝒐𝒈é𝒏𝒊𝒄𝒐𝒔 𝒆𝒗𝒂𝒍𝒖𝒂𝒅𝒐 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐𝒔 𝒄𝒊𝒂𝒏𝒐𝒈é𝒏𝒊𝒄𝒐𝒔 𝒑𝒓𝒆𝒔𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒓𝒂í𝒄𝒆𝒔 𝒇𝒓𝒆𝒔𝒄𝒂𝒔
16
2.3
OBJETIVOS
Objetivo general
Aislar e identificar bacterias capaces de degradar cianuro presentes en muestras
expuestas a dicho contaminante.
Objetivos específicos
•
Aislar bacterias capaces de degradar cianuro presentes en el proceso de
extracción de almidón de yuca.
•
Identificar las bacterias capaces de degradar cianuro presentes en el
proceso de extracción de almidón de yuca.
•
Cuantificar la cantidad de cianuro degradado por las bacterias encontradas.
17
2.4
METODOLOGÍA UTILIZADA
Selección de la muestra
Las muestras analizadas provienen de una rallanderia de almidón de yuca
localizada en el corregimiento La Agustina en el departamento del Cauca. Se
tomaron nueve muestras liquidas de diferentes tanques correspondientes a
diferentes estadíos del proceso de producción de almidón de yuca y tres muestras
sólidas, dos de subproductos conocidos como mancha y una muestra de lodo (a
20 cm de profundidad) expuesto a aguas residuales. Las muestras se recolectaron
y transportaron en tubos cónicos Falcon de 50 mL nuevos y estériles.
Preparación de la muestra
Muestras sólidas: Se tomaron 10 g de muestra y se agregaron en 90 mL de agua
bidestiladaestéril, después, se tomaron 10 mL de la mezcla inicial y se disolvieron
en 90 mL de medio enriquecido (medio E). El medio E. está compuesto por,
KH 2 PO 4 , 1,36 g/L; (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,5 g/L; MgSO 4 x 7H 2 O, 0,2 g/L; CaCl x 2H 2 O,
0,01g/L; así como elementos traza: FeSO 4 x 7H 2 O mg /L, 5,0; MnSO 4 x 7H 2 O, 2,5
mg /L; Na 2 MoO 4 x 2H 2 O, 2,5 mg /L; Na 2 HPO 4 , 2,13mg /L. Como fuente de
carbono se utilizó Glucosa 10 g/L. A un pH de 7,2.
Muestras liquidas: Se tomaron 10 mL de la muestra y se diluyeron en 90 mL de
medio E. Las muestras se incubaron por un periodo de 7 días a 30ºC en un
shaker con agitación a 180 rpm. Como control de crecimiento de los cultivos se
midió la absorbancia a 600 nm a los 3,5 y 7 días de incubación.
Selección e identificación
Se agruparon las submuestras de cada estadío, conformando 3 grupos
representativos de cada proceso. El grupo 1, corresponde a las muestras de los
tanques. El grupo 2, contiene el afrecho, la mancha sólida y la mancha liquida. El
tercer grupo, contiene solamente la muestra de lodo. Todos los grupos se trataron
de la siguiente forma: Se tomaron 10 mL del cultivo y se inoculó en 90 mL de un
medio selectivo (medio S).El medio S contiene KH 2 PO 4 2,7 g, K 2 HPO 4 3,5 g y 10
mL de una solución de sales(FeSO 4 •7H 2 O 300 mg, MgCl 2 •6H 2 O 180 mg,
Co(NO 3 ) 2 •6H 2 O 130 mg, CaCl 2 40 mg, ZnSO 4 40 mg y MoO 3 20 mg, en un litro
de agua desionizada) y NaCN 25 mg/L, en 1 litro de agua desionizada. El NaCN
se usa como única fuente de carbono y nitrógeno para los microrganismo. Los
cultivos fueron incubados por un periodo de 7 días a 30ºC en un shaker a 180 rpm
Con el fin de obtener colonias aisladas para su posterior caracterización, se utilizó
el método de dilución en serie hasta obtener diluciones de 10-9. Esto se logró
18
tomando 10 mL de cada grupo y diluyendo en 90 mL de agua destilada.
Posteriormente, se tomó 1 mL de la solución anterior y se disolvió en 9 mL de
agua destilada. Este último paso se repite hasta alcanzar una dilución de 10-9.
(Figura 5)
Figura 5. Esquema del procedimiento de diluciones en serie para las muestras
microbiológicas liquidas y solidas obtenidas de la rallanderia.
De cada dilución se tomó 1 mL y se sembró en cajas de Petri que contienen el
medio selectivo y 18 g/L de agar-agar. Las cajas se incubaron a 30ºC por 7 días.
Todas las placas se realizaron por duplicado.
El conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) se realizó en las placas que
corresponden a las diluciones 10-4 y 10-5, puesto que las placas con menor dilución
presentaron un número incontable de UFC. En las últimas diluciones la cantidad
era menor a 10 UFC y se observaba perdida de la diversidad morfológica.
Adicionalmente las colonias fueron observadas al estereoscopio y se
seleccionaron colonias con diferencias morfológicas apreciables. Siguiendo esta
metodología seleccionamos 9 colonias para realizar cultivos aislados con el
objetivo de realizar pruebas bioquímicas para identificar las cepas
correspondientes.
Para realizar los cultivos aislados se tomó una colonia y se realizó la siembra
haciendo estrías en cada cuadrante de la caja Petri. A los cultivos aislados se
realizó tinción de Gram (A. Smith, 2005). La Prueba bioquímica deperoxidasa
utilizando el kit de microbiología Bactident® oxidasa, para la detección de la
enzima citocromo oxidasa en el microorganismo y la prueba de la catalasa
utilizando peróxido de hidrogeno (Reiner, 2013).
Las colonias aisladas se incubaron en 50 mL de medio S, por un periodo de 11
días, a 30ºC y 180 rpm. Para verificar que realmente presentan la capacidad de
degradar cianuro.
19
Verificación de la capacidad degradadora de cianuro
Purificación de las muestras
Se realizó un lavado bacteriano de las placas que contenían la dilución 104,
procediendo de la siguiente manera: inicialmente se adicionaron 5 mL de medio
S en cada placa y se frotaron con un aza de vidrio en forma de L, luego el lavado
fue transferido a un erlenmeyer con 45 mL de medio S. Después de 12 días se
tomaron 5 mL y se transfirieron a otro erlenmeyer con 45 mL de medio S, este
procedimiento se repitió una vez más. Del último cultivo, se realizó una dilución en
serie hasta 10-5, en placas Petri con medio S. a una temperatura de 30ºC y con
agitación de 180 rpm. (Figura 6).
Figura 6. Esquema del procedimiento de purificación de UFC.
Preservación de las muestras.
Todos los cultivos, tanto las cepas aisladas como todas las colonias de las placas
con las diluciones 10-4 y 10-5 fueron crio preservadas. Para esto se adicionaron
500 µL de medio enriquecido a las placas y se frotaron con una aza de vidrio en
forma de L. Los 500 µL con los microorganismos fueron mezclados con 500 µL de
glicerol al 50% en un tubo eppendorf de 1,5 mL. Después de homogenizar
completamente se guardaron a -80 °C.
Identificación bacteriana
Para identificar los microorganismos aislados, existen muchos mecanismos como
por ejemplo pruebas moleculares, como la secuenciación del gen 16S rRNA,
métodos proteomicos como la espectrometría de masas y pruebas bioquímicas,
que en su mayoría son enzimáticas. Para la identificación de las bacterias
utilizadas en este proyecto se utilizaron dos métodos, el primero es la
20
identificación mediante pruebas bioquímicas utilizando un equipo VITEK® y la
segunda fue por espectrometría de masas.
Pruebas Bioquímicas
El VITEK 2 ® es un sistema que utiliza tarjetas que contienen reactivos, que
presentan cambios, al ser inoculados con una suspensión salina de cultivos
microbianos puros. Los cambios producidos en las tarjetas son interpretados de
forma automática por el equipo. Los sustratos se encuentran en pozos individuales
y con estos se miden diferentes actividades metabólicas, como por ejemplo
acidificación, alcalinización, hidrólisis enzimáticas y desarrollo en presencia de
sustancias inhibidoras.
Las tarjetas utilizadas tienen como característica que están selladas, para evitar el
contacto entre los pozos, y evitar mediciones alteradas, por la interacción sustratomicroorganismo. La película con la que está sellado la tarjeta tiene condiciones
que permite un intercambio de oxigeno apropiado con las características. El
equipo puede trabajar con 4 tarjetas diferentes, estas difieren en el tipo de
microorganismo a estudiar:
1. GN – Bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores.
2. GP - Cocos y bacilos no formadores de esporas Gram positivos
3. YST – Levaduras y organismos levaduriformes
4. BCL – Bacilos formadores de esporas Gram positivos.
Las tarjetas utilizadas en este proyecto fueron GN que corresponden bacterias
Gram negativas. Sin embargo, el software utilizado contiene una base de datos
que es muy amplia para muestras clínicas y la información que cuenta para
microorganismos ambientales es reducida.
A los cultivos aislados de 2 días de crecimiento en medio S. sólido se le
adicionaron 3 mL de solución salina estéril (Sol. Acuosa de NaCl 0.5%), se raspó
y se midió la turbiedad al alcanzar un valor entre 0.5 y 0.63 unidades de la
escala de McFarland con el densitómetro DensiChek™ ). Las suspensiones
anteriores, se colocaron en tubos de ensayo, en un cassette (gradilla especial)
que contenía las 7 muestras, el cassette entró al sistema Vitek® 2 y el equipo
automáticamente le realizó 47 pruebas bioquímicas, después de 8 horas el
software dio la identificación de cada microorganismo hasta el nivel de especie
con un porcentaje de probabilidad del 95 al 99%.
21
MALDI-TOF MS.
El segundo mecanismo utilizado para identificación es MALDI- TOF /MS. La
espectroscopia de masas para la caracterización de bacterias fue estudiado desde
1975, en los primeros estudios se utilizaron fosfolípidos o moléculas pequeñas
como biomarcadores. Pero en el año de 1994 se reportó el uso de MALDI
TOF/MS, la espectrometría de masas MALDI-TOF se denomina MALDI por sus
siglas en ingles matrix-assisted laser desorption/ionization (desorción/ionización
por laser asistida por matriz) y TOF por el analizador time of flight (tiempo de
vuelo) que se integra típicamente con fuentes de ionización maldi. Este consiste
básicamente en el análisis de las proteínas de cultivos aislados. La gran diferencia
con la MS de masa convencional es que se utilizan moléculas más grandes que
pueden ser más específicas para cada microorganismo (R.Holland, 1999). Es
una técnica muy eficiente en la identificación de los microorganismo, además es
rápida, sus resultados son confiable y las muestras no necesitan mucha
preparación (A.F. Olmos, 2010).
Los cultivos aislados en medio enriquecido crecieron durante 2 días a una
temperatura de 30ºC, posteriormente fueron trasladados a la Clínica Imbanaco
donde se le realizó la identificación bacteriana por la técnica MALDI-TOF MS (S.C.
Wunschel, 2005).
Optimización de la concentración de KCN para crecimiento bacteriano
Las 7 UFC que mostraron la capacidad de degradar cianuro, crecieron en 50 mL
de medio S, al cuarto día de crecimiento se tomaron 200 µL del cultivo y se
sembraron en placas con medio S sólido a diferentes concentraciones de KCN.
Las concentraciones de KCN fueron 10, 25, 50 y 100 ppm.
Cuantificación de degradación de cianuro
Curva de calibración: Se preparó una solución patrón de 1000 mg/ L de KCN no
hidratado en agua bidestilada. Se realizó una curva de calibración (R2 de 0, 998,
Anexo a), utilizando soluciones patrones de KCN con concentraciones de 5, 10, 25
y 40 ppm(50 mL fue el volumen de cada solución).
Para la cuantificación de KCN en los medios de cultivos, se realizaron soluciones
estándares de 1,5,10,25 y 40 ppm, en una matriz que contiene KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4
y solución de sales, con igual concentraciones a las encontradas en el medio S.
22
Cuantificación de CN- usando el electrodo ion selectivo medidas para la
cuantificación (construcción de la curva de calibración): La determinación de
KCN se realizó utilizando un electrodo marca Thomas selectivo al ion CN-. El
electrodo fue sumergido en las soluciones, siempre yendo de la solución más
diluida a la más concentrada. El pH de todas las soluciones fue ajustado en un
intervalo entre 11-13 adicionando 2% v/v, de una solución 10M de NaOH. Antes
de sumergir el electrodo en la solución siguiente se lavó con agua desionizada y
se secó con papel kimwipe. Se encontró muy importante para la reproducibilidad
de las medidas asegurar que en el momento de la medición el electrodo no tocara
ninguna superficie y que el líquido estuviera quieto. Por tanto la agitación se
detenia en el momento de introducir el electrodo en la solución. Las lecturas
fueron realizadas después de 3 minutos cuando los valores se tornaron estables.
Preparación muestras para cuantificación de CN- : El medio de cultivo fue
preparado con un inoculo de 10 mL de bacterias con 3 días de crecimiento en
100 mL de medio S. Se tomaron 25 mL del medio de cultivo, los microorganismos
se separaron del medio por centrifugación a 10700g, en una centrifuga eppendorf
2448, el sobrenadante se adiciono a un beaker de 15 mL y el pH se ajustó en un
intervalo de 11-13 utilizando una solución de NaOH 10 M al 2% v/v. La
concentración de KCN se midió a los días de cultivo 1, 3, 6, y 9. Todas las
medidas se realizaron como se describió en el párrafo anterior.
Determinación de la eficiencia de remoción: El porcentaje de la eficiencia de
remoción (RE) se halló utilizando la siguiente formula:
𝑅𝐸 (%) =
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙
∗ 100
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
Concentración inicial de cianuro en ppm (mg/L)
Concentración residual de cianuro en ppm (mg/L)
23
2.5 RESULTADOS
Crecimiento bacteriano
Dilución inicial de las muestras ambientales en medio enriquecido.
La Figura 7 muestra los valores de absorbancia obtenidos durante el crecimiento
evaluado durante 7 días para todas las muestras líquidas obtenidas en la
rallanderia. Se observan diferentes tendencias de crecimiento. Las medidas de
absorbancia de las muestras de agua, tanto de entrada como de salida fueron
nulas. Por el contrario, las muestras de los tanques de fermentación presentaron
mayor crecimiento microbiano, pero difieren entre sí. El tanque azul tuvo un
comportamiento constante. Los tanques 20 y de separación mostraron un
incremento importante a partir del quinto día. Sin embargo, en los tanque 28 y 24
se observó una disminución. No es claro el porqué del comportamiento distinto
pero posiblemente refleja las distintas comunidades microbianas existentes en las
diferentes muestras. En comparación con las muestras de todos los tanques, la
mancha
mostró
un
crecimiento
microbiano
menor.
1.2
tanque azul
1.0
agua salida
Absrobancia
0.8
tanque 24
mancha
0.6
tanque 27
0.4
tanque 20
separacion
0.2
agua entrada
tanque 28
0.0
3
7
5
Días de incubación
Figura 7. Curva de crecimiento bacteriano en medio enriquecido de muestras
liquidas de diferentes estadíos del proceso de extracción de almidón de yuca. El
valor de absorbancia a 600 nm es proporcional al crecimiento.
24
Medio selectivo con NaCN.
Método de selección 1: Los resultados indican un mayor número de UFC en el
grupo de tanques y un menor número de UFC en mancha y afrecho. Las muestras
de lodo reflejan una cantidad intermedia de UFC, que no difieren estadísticamente
de los otros grupos. Sin embargo, las muestras de tanques y mancha y afrecho
difieren estadísticamente. (Figura 8).
1.2e+6
1.0e+6
a
UFC/mL
8.0e+5
ab
6.0e+5
4.0e+5
b
2.0e+5
0.0
Tanques
Mancha y afrecho
Lodo
Figura 8. Comparación de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio
selectivo con cianuro, para las muestras provenientes de tanques, mancha y
afrecho y lodo. Letras iguales indican que no hay diferencia estadística entre las
muestras ( Test de Tuckey; p 0.05).
Selección e identificación de las UFC degradadoras de cianuro
Con el objetivo de examinar la morfología de las distintas colonias que crecieron
en el medio selectivo con NaCN se usó un estereoscopio. La Figura 6 resume las
morfologías observadas en las 6 placas examinadas correspondientes a los
duplicados de las diluciones 10-4 y 10-5. Las demás colonias observadas
presentaron fenotipos muy similares a estas 9 y se presumió que se trata de las
mismas cepas bacterianas (Tabla 2). Por tanto se seleccionaron estas 9 cepas
para realizar cultivos aislados y proceder a hacer pruebas bioquímicas para la
identificación de los microorganismos. Los resultados
indicaron presencia
dominante de bacterias Gram (-) y catalasa positivas (Tabla1).
25
Figura 9. Fotografías al estereoscopio de las diferentes morfologías de las
colonias bacterianas encontradas en las muestras de tanques, mancha y afrecho y
lodo.
26
Tabla 3. Prueba de oxidasa, catalasa y tinción Gram para las nueve UFC
seleccionadas. Se describe la forma observada en el objetivo de 100 x.
Identificación
muestra
Oxidasa
Catalasa
Tinción
Gram
Forma
1
Morfología
externa
forma, borde
Irregular, rizado
-
+
-
Bacilos
2
Circular, entero
+
+
-
Bacilos
3
Filamentoso,filamen +
toso
+
-
Bacilos
4
Circular, entero
+
+
-
Bacilos
5
Filamentosa,filamen toso
+
-
Bacilos
6
Irregular, ondulado
-
+
-
Bacilos
7
Fusiforme,entero
+
+
+
Cocos
8
Irregular, ondulado
+
+
-
Bacilos
9
Filamentoso,filamen toso
+
+
Cocos
Con el objetivo de corroborar la capacidad de degradar cianuro de estas 9 cepas
se realizaron cultivos en medio líquido selectivo con una concentración inical de
cianuro de 25 ppm y se siguió el crecimiento durante varios días. Bajo estas
condiciones de las nueve UFC seleccionadas solo se observó crecimiento en
cinco de ellas, las otras cuatro UFC no mostraron crecimiento. Se observó
distintos comportamiento de los valores de absorbancia para las UFC en medio
líquido, las UFC 1,3,7 y 9 no incrementaron su valor A600. Por el contrario las
UFC 2,4,5,6 y 8, todas Gram (-) mostraron incremento en estos valores. El
comportamiento de las curvas de crecimiento fue diferente entre las cinco UFC.
Siendo la UFC 6 la que presentó mayor absorbancia (Figura 9.). Cabe notar que
cuando la UFC 6 fue sembrada en medio selectivo sólido también se observó un
crecimiento mayor que las otras bacterias. Estudios de tinción de Gram revelaron
que las UFC estudiadas son bacterias gram negativas y la mayoría bacilos
(Figura 9)
27
Absorbancia / 600 nm
0.14
0.12
UFC1
UFC2
UFC3
UFC4
UFC5
UFC6
UFC7
UFC8
UFC9
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
3
6
7
8
9
10
11
Dias de incubación
Figura 9. Curva de crecimiento de nueve UFC seleccionadas por morfología en
medio líquido selectivo. El valor de absorbancia a 600 nm es indicativo de
crecimiento bacteriano. UFC 5 (Grupo 1), UFC 2( Grupo 2) y UFC 2,8, 4( Grupo 3).
Figura 9.Tinción de Gram para las 5 colonias aisladas en medio selectivo con
NaCN.
28
Método de selección 2: Con el fin de verificar la capacidad degradadora y
eliminar las bacterias que hayan sobrevivido por los residuos del medio E, o se
estén utilizando materia orgánica de las bacterias muertas como fuente de
carbono y/o nitrógeno, se decidió realizar un segundo método de selección.
Después de la estrategia de depuración por varios pases en medio selectivo
líquido se procedió a plaquear la dilución 10-4. Se observó el mayor número de
UFC en las muestras provenientes de los tanques y el lodo, por el contrario, la
muestra proveniente de la mancha y afrecho presentó el menor número de UFC
(Figura 10). Después de este procedimiento se observaron 2 UFC que mostraron
diferencias morfológicas al ser observadas al estereoscopio, y que no habían sido
observadas en la selección inicial. A estas nuevas UFC encontradas se les
rotulara como UFC 1* y 2*. La UFC 1* presentó una morfología externa redonda y
de color rosado. La UFC 2* de color blanca y con un borde transparente e
irregular.
4e+5
a
a
UFC / mL
3e+5
2e+5
1e+5
b
0
Tanques
Mancha y afrecho
Lodo
Figura 10. UFC de los tanques, macha y afrecho, y lodo en medio sólido selectivo.
Letras iguales indican que no hay diferencia CFU (test Tuckey).
Identificación bacteriana
Las pruebas bioquímicas realizadas con el equipo VITEK® arrojaron como
resultado 5 cepas diferentes, 3 de éstas identificados hasta el nivel de especie
29
(Anexos D). Una cepa identificada hasta el nivel de género pero no especie y un
microorganismo no pudo ser identificado (Tabla 3).
Con el objetivo de corroborar las identidades arrojadas por el equipo VITEK® se
recurrió a la técnica MALDI-TOF /MS en el centro médico Imbanaco de Cali,
mediante esta técnica se obtuvo que las 7 UFC estudiadas correspondían a la
misma cepa Rhizobium radiobacter. Este resultado es sorprendente ya que las
características morfológicas de estos microorganismos son muy distintas. La
comprobación de la identidad de estas cepas espera la secuenciación del gen 16S
rRNA.
Tabla 2 Identificación bacteriana bioquimica de 7 UFC aisaldas de medio con
cianuro seleccionadas de acuerdo a su morfologia externa.
Identificación
de la muestra
Morfología
VITEK®
MALDI-TOF
externa
1*
Circular,
entero
Low discrimination
Rhizobium radiobacter
2*
Irregular
rizoide
Cupriavidus pauculus
Rhizobium radiobacter
2
Circular,
entero
Rhizobium radiobacter
Rhizobium radiobacter
4
Circular,
entero
5
Filamentoso Acinetobacter Iwoffii
,filamentoso
6
Irregular,
ondulado
Methylobacterium spp.
Rhizobium radiobacter
8
Irregular
rizado
Cupriavidus pauculus
Rhizobium radiobacter
Rhizobium radiobacter
Rhizobium radiobacter
Rhizobium radiobacter
Para la cuantificación de la degradación de cianuro las colonias fueron
renombradas en orden de 1 a 7, siendo la numero 1, la cepa 1* y la 7 la cepa
correspondiente a la numero 8.
30
Cuantificación de degradación de cianuro
El KCN es una sal higroscópica, el medio selectivo inicialmente usado en este
proyecto se realizó con un reactivo de NaCN hidratado, esto se evidenciaba en el
aspecto de sus cristales. Al disponer de un reactivo KCN no hidratado, adquirido
recientemente por la Facultad de Ciencias Naturales de ICESI, se procedió a
establecer la concentración real de cianuro usada al inicio de este estudio. Se
observó que la concentración real de KCN usada en el medio selectivo era de
16,11 ppm en lugar del esperado de 25 ppm.
La determinación de la concentración de cianuro se realizó utilizando KCN
deshidratado. Se obtuvo la ecuación 1, que corresponde a la curva de calibración
con un R2 de 0,990 en la cual utilizó como matriz, la solución de sales y el buffer
fosfato.
𝑚𝑣 = −80,298 − (61,008 ∗ 𝐿𝑜𝑔(𝑝𝑝𝑚))
Ecuación 1
Las 7 UFC mostraron disminución en la concentración de cianuro (figura 11), la
concentración final osciló entre 0,271- 0,163 ppm., además se observó diferencia
en la disminución de la concentración de cianuro entre las bacterias aisladas. En
las UFC 1,2, 3, 4 y 5 se observó decaimiento exponencial. Por el contrario, las
UFC 6 y 7 presentaron su mayor decrecimiento el día 3. En los días posteriores la
concentración de cianuro se mantuvo casi constante en la UFC 6, en la UFC 7
disminuyó un poco más, siendo esta misma la que disminuye la concentración en
menor cantidad (0,163 ppm). Es importante saber que el limite detección del
electrodo es de 0,3 ppm por lo que no se pudo medir con exactitud la
concentración final de cianuro, solamente se puede decir que es menor a 0,3 ppm.
Eficiencia de remoción: Para encontrar el índice de remoción se utilizó el límite
de detección del electrodo (0,3 ppm) puesto que la concentración de cianuro
estuvo por debajo de este.
𝑅𝐸 (%) =
25 𝑝𝑝𝑚 − 0,3𝑝𝑝𝑚
∗ 100 = 98,8%
25 𝑝𝑝𝑚
31
UFC 1
UFC 6
30
30
25
25
20
15
ppm
ppm
20
10
15
10
5
5
0
0
0
2
4
6
8
10
12
Días
0
2
4
6
8
10
12
Días
Figura 11 Disminución de la concentración de cianuro en medio selectivo de las
UFC1 y UFC6.
Los resultados obtenidos al medir las unidades formadoras de colonia en
diferentes concentraciones de cianuro, no son concluyentes ya que no se observa
alguna tendencia clara. Sin embargo se presentó variación en la cantidad de
algunas UFC. En la concentración de 50 ppm se presentó mayor crecimiento de
la UFC 1, en la concentración de 10 ppm, la UFC 2 y UFC 4 presentaron el
menor y mayor crecimiento respectivamente (Ver figura 12). En las UFC 3, 5,6 y 7
no se observa diferencias notorias entre la cantidad de UFC y las concentraciones
de cianuro (Anexo c).
32
UFC 6
UFC1
5,0e+5
4e+5
4,0e+5
3e+5
3,0e+5
UFC
UFC
5e+5
2e+5
2,0e+5
1e+5
1,0e+5
0,0
0
10
25
50
10
100
ppm
25
50
100
ppm
Figura 12 Unidades formadoras de las colonias 1 y 6 a cuatro diferentes
concentraciones de cianuro
33
2.6 DISCUSIÓN
El proceso de extracción de almidón de yuca, presenta más cantidad de
compuestos cianogenicos en los desechos líquidos, alrededor de un 91 %
(Kuakoon Piyachomkwana, 2005), mientras que el producto final y el agua de
salida tienen solo trazas de cianuro. Esto coincide con los resultados obtenidos en
la figura 1 que mostraron una mayor cantidad de UFC que sobreviven en medio
selectivo con cianuro de las muestras provenientes de los tanques de
fermentación.
Se observó que la mayor cantidad de UFC en medio selectivo se encuentra en las
muestras de tanque y la menor en las muestras de lodo y mancha, figura 8, esta
tendencia se observa aun después de realizar varios inóculos espaciados por
varios días en medio selectivo líquido, lo que indica que definitivamente la mayor
cantidad de bacterias con la capacidad de degradar cianuro se encuentran en los
tanques de fermentación del proceso y en menor proporción en las muestras de
mancha y afrecho. También se debe tener en cuenta que si se observa mayor
cantidad no indica que exista mayor diversidad. Estudios más completos con
técnicas independientes de cultivo podrían responder esta interrogante.
En este estudio se pudo observar una dependencia del número de UFC obtenidas
en medio selectivos con la metodología usada para tratar la muestra ambiental
antes del plaqueo. Al comparar la figura 2 y la figura 10 se puede observar que las
cantidades de UFC cambian al modificar la forma de manipular las muestras. El
hecho de que la cantidad de UFC obtenidas al plaquear después de realizar varios
pases en medio selectivo disminuya, puede sugerir, que muchas de las UFC
aisladas inicialmente, plaqueando en agar selectivo al cabo de tres días de
crecimiento en medio rico líquido, estaban sobreviviendo con residuos de carbono
y/o nitrógeno provenientes del medio enriquecido el cual es inoculado con las
muestras ambientale. No es claro si la disminución en UFC es el resultado de una
mejor selección o por el contrario un empobrecimiento de las poblaciones
bacterianas, debido a los continuos pases en un medio muy astringente. Se
requiere diseñar experimentos que permitan responder este interrogante.
Otro factor a considerar es que inicialmente en este estudio se usó un cianuro
hidratado cuya concentración efectiva pudimos estimar como menor de la
esperada, por tanto la concentración del medio selectivo usado fue de 16,11 ppm
en lugar de 25 ppm. Es probable que esta concentración de cianuro, no era lo
suficientemente tóxica para las bacterias que no tenían la capacidad degradadora,
por eso se observó una mayor cantidad de UFC con el método de selección 1.
Como se mencionó las muestras vienen de aguas y residuos del proceso de la
extracción de almidón de yuca ya que por presión selectiva hay bacterias que
aunque no tengan capacidad degradadora, pueden ser tolerantes a bajas
concentraciones de NaCN.
34
Las bacterias para caracterizar se escogieron observando las diferencias
morfológicas externas. En la figura 6 se muestran algunas de estas diferencias, se
encontraron 9 bacterias con diferencias morfológicas, todas estas son Gram
negativas (figura 9), en su mayoría bacilos y solo las UFC 7 y 9 fueron cocos.
Cuando se verificó la capacidad degradadora de las colonias, se observó que solo
las UFC 2,4,5,6 y 8 muestran un crecimiento, no es claro por qué las demás
pasaron el primer filtro de selección. La absorbancia a 600 nm es un buen método
para observar crecimiento bacteriano. En el caso de las bacterias aisladas en este
estudio, la UFC que presentó mayor absorbancia fue la UFC 6, la cual muestra
un pico de absorbancia en el día 9, lo que indica una mayor densidad poblacional,
después del día 10 su absorbancia decrece (Figura 7). Se debe tener en cuenta
que el crecimiento de las UFC no es comparable entre sí, puesto que las
diferentes morfologías podrían resultar en distintas formas de dispersar la luz. No
obstante se observó que la UFC 6, también presentaba un crecimiento muy rápido
en placas de agar selectivo. Esto podría indicar una alta capacidad para degradar
cianuro.
Para la identificación de las 5 UFC aisladas inicialmente y las 2 UFC aisladas
después del segundo método se realizaron 54 pruebas bioquímicas con el equipo
VITEK®. Este equipo arrojó 5 bacterias diferentes, todas identificadas con un
porcentaje de probabilidad mayor al 95 %. Es importante anotar que la base de
datos con la que trabaja el equipo es una base de datos clínica, y es pobre en
microorganismos ambientales, por lo que la existe la probabilidad que al comparar
los resultados de las pruebas bioquímicas con los datos encontrados en la base
de datos,se asimilen con bacterias de interés clínico.
La UFC 2 y 4 corresponden a la especie Rhizobium radiobacter, esta bacteria es
conocida también como Agrobacterium tumefaciens (J M Young, 2001). Este
resultado concuerda con lo reportado en la literatura puesto que un estudio
realizado en el 2010 en aguas del proceso de extracción de almidón de yuca
reportó una variación nueva de Agrobacterium tumefaciens SUTS 1, que tiene la
capacidad de degradar cianuro, con un porcentaje de remoción aproximadamente
de 87,50%. Las bacterias 2* y 8, corresponden a Cupriavidus pauculus, esta
bacteria no ha sido reportada como degradadora de cianuro, pero ha sido
reportada como acumulador de níquel (Arundhati Pal, 2007). Esto es interesante
puesto que el cianuro puede formar complejos con el níquel, estudios posteriores
podrían ahondar en este aspecto. Como se mencionó anteriormente, el cianuro en
el suelo se puede acomplejar con metales que son necesarios para mantener la
estabilidad de los ecosistemas.
Uno de los aspectos más interesantes en biodegradación de cianuro son los
complejos que puede formar con los metales (Fe, Au, Cd, Co, Cu y Ni). Los
complejos formados con el hierro son las especies que más se observan en el
suelo y en las aguas subterráneas (Meeussen JL, 1992). Adicionalmente, se sabe
que el hierro es un elemento presente en suelo y el equilibrio favorece la
formación del complejo hexacianoferrato(III) [Fe(CN) 6 ]3−, los complejos hierro35
cianuro no muestran mayor toxicidad, por eso hay poco énfasis en su
bioremediación (S.Ebbs, 2004). Sin embargo, con los demás metales puede llegar
a ser toxico, por lo que sería de interés, si las bacterias aisladas pueden degradar
también complejos metálicos. Ya que la especie C. pauculus ha sido reportada
como una acumuladora de níquel, se podrían analizar estas dos capacidades.
La tercera especie encontrada fue Acinetobacter Iwoffii que corresponde a la UFC
5, esta especie no ha sido reportada como degradadora, pero el género
Acinetobacter, si ha sido reportado como degradador de nitrilos aromáticos y
alifáticos, en la cepa Acinetobacter sp. AK226 La enzima que presenta el
microorganismo es la nitralasa, esta enzima tiene como producto final el ácido
carboxílico correspondiente al nitrilo hidrolizado y amonio, esta enzima tiene como
característica que no se ve la formación de una amida intermediaria.
(K.Yamamoto, 1991).Esta enzima es interesante porque se puede utilizar como
catalizadores en química orgánica, además se puede utilizar para la resolución de
muestras racémicas(Neha Gupta, 2010).
Las pruebas bioquímicas identificaron la UFC 6 solamente hasta género,
Methylobacterium. El género Methylobacterium ha sido reportado en la literatura
como degradador de formamidas. Se utiliza en un bioreactor para la degradación
de formamida y cianuro. La bacteria utilizada en este bioreactor fue
Methylobacterium sp, este microorganismo presentan la cianuro hidratasa (M.
Campos, 2006). Esto es de interés porque a futuro se podría evaluar cuál es la
combinación más eficiente de bacterias degradadoras. Para la UFC 1*, no se
logró realizar la
identificación taxonómica por pruebas bioquímicas,
probablemente la base de datos al ser una base clínica no tenía esta especie
reportada y las pruebas bioquímicas no fueron concluyentes.
Con el fin de verificar las identificación bacteriana se usó el equipo MALDITOF/MS de la clínica Imbanaco, este es un sistema mucho más robusto y con
mayor sensibilidad que el VITEK®, las pruebas dieron que todos los
microorganismos correspondían a Rhizobium radiobacter, este microorganismo es
conocido también como Agrobacterium tumefaciens (J M Young, 2001). Como ya
se mencionó anteriormente, este microorganismo se reportó como degradador de
cianuro, la especie reportada en la literatura fue Agrobacterium tumefaciens SUTS
1. La morfología externa de la cepa reportada en el artículo corresponde a una
forma circular, convexa y lisa. Esta morfología coincide con la morfología que
presentan las UFC 2 y 4 reportadas en este trabajo, adicionalmente, para estas 2
colonias las pruebas bioquímicas realizadas en el VITEK ® arrojaron como
identidad Rhizobium radiobacter, por lo que se podría concluir que estas 2 cepas
corresponden efectivamente a esta especie. Adicionalmente, cuando se cuantificó
la degradación de cianuro tienen un comportamiento similar (Ver anexos), se
observó un decrecimiento exponencial.
36
La técnica MALDI-TOF se basa en tres aspectos: Las huellas dactilares
espectrales varían entre los microorganismos, los picos (masas moleculares)
detectados en el espectros son específicos de género, la especie,y en algún
momento a las subespecies, los espectros obtenidos son reproducibles, siempre
que las bacterias se cultivan en las mismas condiciones (E. Carbonnelle, 2011).
Los picos obtenidos son comparados con los que se encuentran en la base de
datos, al ser una base de datos clínica, puede que no se hayan detectados las
diferencias mínimas entre los microorganismos, por lo que pueden ser la misma
especie, pero subespecies diferentes, puesto que se observaron tanto diferencias
morfologicas notables y en la forma de degradar el cianuro (figura 11).
Adicionalmente se observan variaciones en las huellas espectrales de los
microorganismos cuando se cambia el medio de cultivo y los tiempos de
incubación (E. Carbonnelle, 2011). Posiblemente las huellas dactilares pudieron
ser afectadas como se ha mencionado las bacterias encontradas permanecieron
en medio S. un largo período de tiempo.
Todas las UFC mostraron un decrecimiento exponencial en la concentración de
cianuro, aunque no se puede asegurar cuál es la concentración exacta final de
cianuro, puesto que es menor al límite de detección del electrodo selectivo, pero si
se puede asegurar que está por debajo de 0,3 ppm. El comportamiento observado
en la disminución de cianuro, nos indica primero que existen diferencias entre los
microorganismos en consumir el carbono y el nitrógeno. Aunque sean la misma
especie, esta puede sufrir pequeñas mutaciones que probablemente hacen que la
degradación sea más rápida en los primeros días. Aunque no es un resultado
concluyente por que no se sabe si a cualquier concentración de cianuro, la mayor
degradación es en los primeros días. Lo que sí se puede afirmar hasta el momento
es que las bacterias están utilizando el carbono y el nitrógeno presente en el
cianuro y lo están incorporando a su metabolismo, ya sea porque alguna de las
rutas metabólicas mencionadas o porque realizan una reacción de sustitución/
transferencia. Una de las reacciones de transferencia es la que realiza la
cianoalanina sintasa, que cataliza la siguiente reacción (S.Ebbs, 2004):
Cisteina + CN–
β-cyanoalanina + H 2 S
No se sabe por ahora, que ruta enzimática de las conocidas hasta el momento
están utilizando las bacterias aisladas en este estudio, pero la disminución en la
concentración de cianuro afirma su degradación.
Adicionalmente, para la bacteria Rhizobium radiobacter, se reporta en la literatura
un porcentaje de remoción del 88% en 15 días. Todas la bacterias encontradas en
este estudio tuvieron una concentración final del cianuro menor a 0,3 ppm en el
medio de cultivo, lo que corresponde a un índice de remoción mayor al 99% en 10
días.
37
Por último, se intentó determinar la concentración óptima de cianuro en la cual se
observa la mayor cantidad de UFC y también cuál es la concentración a la que el
cianuro es tóxico. En la figura 12, no se observa claramente una tendencia pero en
todas la UFC se observó crecimiento a los 100 ppm, por lo que se puede asegurar
que la concentración en la que el cianuro es tóxico para las bacterias está por
encima de 100 ppm. Adicionalmente, los microorganismos pueden vivir con una
concentración de cianuro de 10 ppm. Probablemente la concentración de cianuro
óptima para el crecimiento varía en cada UFC.
Algo para tener en cuenta es el posible beneficio económico que puede estar
asociado a la degradación del cianuro. Se ha comprobado la viabilidad de generar
biogás en procesos anaerobios, puesto que la biodegradación del cianuro puede
apoyar el crecimiento de microorganismos metanogénicos (Annachhatre AP,
2000). Otros estudios demuestran que se pueden crear reactores anaerobiosaerobios que también pueden degradar cianuro eficientemente (Chakraborty S,
2002). Las bacterias encontradas en este trabajo, por ser aeróbicas podrían ser
usadas en uno de estos últimos reactores. Para futuros estudios sería interesante
encontrar bacterias anaerobias que presenten la misma facultad.
38
2.7 CONCLUSIONES
Se encontraron 7 cepas con la capacidad de degradar cianuro las cuales por las
condiciones de crecimiento utilizadas se sabe que tienen la habilidad de introducir
dentro de su metabolismo el carbono y el nitrógeno proveniente de esta molécula.
Aunque las 7 cepas encontradas, según la identificación realizada por el MALDITOF/ MS, se han de la especie Rhizobium radiobacter, existen características
como las diferencias cinéticas, la morfología externa de la bacteria y los resultados
de las pruebas bioquímicas, que sugieren que posiblemente no sean la misma
bacteria. Por lo que se podría pensar en utilizar un método más robusto de
identificación bacteriana, como la secuenciación del gen 16S rRNA. Las cepas
encontradas tienen un porcentaje de remoción del 99 %, y es mayor al porcentaje
de remoción reportado en la literatura para otras bacterias con capacidad
degradadora. Las cepas encontradas crecen en medios que tienen una
concentración ente 10-100 ppm, pero no se logró determinar la concentración a la
cual el cianuro es toxico para las bacterias, siendo este último punto propuesto
para estudios futuros. Por todo lo anterior, se puede decir que la metodología
utilizada es una buena opción para la selección de bacterias capaces de degradar
cianuro proveniente de muestras ambientales.
39
2.8 RECOMENDACIONES
Para estudios posteriores se recomienda mejorar el sistema de detección, puesto
que la concentración hasta el día 10 fue menor al límite de detección del electrodo.
Sin embargo, se podría utilizar el método de adición de estándar, que consiste en
adicionar cantidades conocidas de analito en este caso el CN - a la muestra,
entonces a partir del aumento de la señal de la muestra se deduce cuanto analito
estaba presente. Además, se deben repetir los experimentos que intentan
determinar el grado de toxicidad del cianuro para las bacterias para encontrar la
mayor concentración de cianuro a la cual son tolerantes. Adicionalmente, se
podría pensar en mejorar la capacidad de degradación de cianuro usando
radiación UV y el método de selección desarrollado en este proyecto de grado.
40
3.11 REFERENCIAS
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43
ANEXOS
Anexo a: Curvas de calibración
a.
-110
mV = -82.891 - (52.891 * Log (ppm))
-120
Rsqr = 0.998
-130
mV
-140
-150
-160
-170
-180
0
1
2
3
4
5
Log(ppm)
b.
-40
mV = -80,298 - (61,008 * Log(ppm))
-60
R2 = 0,990
-80
mV
-100
-120
-140
-160
-180
-200
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Log(ppm)
Figura 13 Curva de calibración empleada para la determinación de cianuro (a) en
agua destilada estéril (b)en medio selectivo.
44
Anexos B: Disminución de la concentración de cianuro en medio selectivo
UFC 3
UFC 2
30
30
25
25
20
15
ppm
ppm
20
15
10
10
5
5
0
0
0
2
4
6
8
10
0
12
2
4
6
8
10
12
Días
Días
UFC 4
UFC 5
30
30
25
25
20
15
ppm
ppm
20
10
15
10
5
5
0
0
0
2
4
6
8
10
12
0
Días
2
4
6
Días
45
8
10
12
UFC 7
30
25
ppm
20
15
10
5
0
0
2
4
6
Días
46
8
10
12
Anexos C : UFC en diferentes concentraciones de CNUFC 3
UFC 2
5,0e+5
5e+5
4,0e+5
4e+5
3,0e+5
UFC
UFC
3e+5
2,0e+5
2e+5
1,0e+5
1e+5
0,0
0
10
25
50
100
10
ppm
25
50
100
UFC 5
UFC 4.
5,0e+5
5,0e+5
4,0e+5
4,0e+5
3,0e+5
UFC
UFC
3,0e+5
2,0e+5
2,0e+5
1,0e+5
1,0e+5
0,0
10
25
50
100
ppm
0,0
10
25
50
100
ppm
47
ppm
UFC 7
5,0e+5
4,0e+5
UFC
3,0e+5
2,0e+5
1,0e+5
0,0
10
25
50
48
100
ppm
Anexos D: Resultados de las pruebas bioquímicas
49
50
51
52
53
54
55
56