Download polimorfismos en el gen vkorc1 relación con la trombosis venosa y

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
TRABAJO DE GRADO
POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1
RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON
ANTICOAGULANTES ORALES
Por
Roybel María Barrios Tovar
Octubre, 2010
i
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1
RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON
ANTICOAGULANTES ORALES
Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por
Roybel María Barrios Tovar
Como requisito parcial para optar al grado académico de
Magíster en Ciencias Biológicas
Con la asesoría de la profesora
Dra. Antonietta Porco
Octubre, 2010
ii
iii
iv
v
DEDICATORIA
A mi familia, pilar fundamental en mi vida y en especial a la pequeña Mariangel.
A todos los que han hecho posible este proyecto.
vi
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por darme vida y mantenerme en pie. A mi familia, mis padres y hermano,
que siempre han estado en cada momento de mi vida apoyándome, dándome ánimo
y respetando mis tiempos. Gracias por mantener mi Fé.
A la Dra. Antonietta Porco, mi tutora, fuente de conocimientos, de apoyo, que me ha
brindado siempre su confianza, su paciencia, su orientación; que me impulsó a
continuar una y otra vez en este largo camino. Gracias por ayudarme a culminar
esta meta en mi vida.
Al Dr. Argimiro Torres, por colaborar abiertamente desde el Banco Municipal de
Sangre, por ser parte de este proyecto y por fusionar los datos vitales para esta
investigación.
A los profesores Álvaro Rodríguez y Rosaria Ruggiero, por su puntual ayuda y
orientación estadística. Al profesor Henry Caballero por facilitar las herramientas para
la digitalización de imágenes.
A todas mis compañeras del laboratorio de Genética Molecular Humana B, y otros
laboratorios de la USB, siempre prestas a ayudarme, no importa la hora y el día:
especiales agradecimientos a Carolina, Silvia, Karlena, Nigmet, May Lyn, Vanesa,
Lisette, Loly, Zuhail, gracias a todas de corazón.
A todas las instituciones financieras que apoyaron económicamente este proyecto:
Fonacit, al Decanato de Estudios de Postgrado de la Universidad Simón Bolívar, a
Quimbiotec, C.A.
A los que han colaborado desde el Hospital Militar, el Banco Municipal de Sangre, el
Hospital Pérez Carreño, el IVIC, Quimbiotec, a los participantes de la Universidad
vii
Central de Venezuela y la Universidad Simón Bolívar. A todos los donantes
voluntarios, pacientes y controles.
A todas las personas que de una u otra manera contribuyeron en la realización y
culminación de este trabajo.
Para todos ustedes mi sincero reconocimiento y mi eterno agradecimiento…
viii
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1
RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON
ANTICOAGULANTES ORALES
Por: Barrios Tovar Roybel María
Carnet N°.: 02-82479
Tutora: Dra. Antonietta Porco
Septiembre, 2010
RESUMEN
El uso de anticoagulantes como la warfarina, es uno de los tratamientos de elección
para la prevención contra eventos tromboembólicos. Éste actúa como antagonista de
la vitamina K, interfiriendo en la carboxilación de los factores de la coagulación
dependientes de esta vitamina e inhibiendo su función en el proceso de la
coagulación. La respuesta al tratamiento con este anticoagulante depende de cada
paciente y de la variabilidad interindividual en los requerimientos de la dosis
adecuada. Existen factores extrínsecos y genéticos que influyen en la respuesta al
fármaco. En cuanto al componente genético, se han descrito polimorfismos en el gen
que codifica para el complejo Vitamina K epóxido reductasa sub unidad 1 (VKORC1)
relacionados con cambios en la farmacodinámica de la warfarina, la resistencia y
sensibilidad en la terapéutica. El objetivo de esta investigación fue determinar las
frecuencias genotípicas y alélicas de cinco polimorfismos en éste gen: -1639G>A,
106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A, en controles sanos y en pacientes que han
sufrido trombosis venosa y establecer la relación con la patología y la influencia de la
variabilidad genética en la respuesta al tratamiento. Para ello, los ADNg aislados de
muestras de sangre fueron utilizados para el análisis molecular de cada polimorfismo
mediante PCR-RFLP. Los resultados obtenidos mostraron que las frecuencias
genotípicas y alélicas tanto en controles como en pacientes fueron similares en
ambos grupos, según el polimorfismo estudiado. No hubo asociación entre los
genotipos de los polimorfismos y la trombosis venosa, excepto para el SNP
-1639G>A, el cual se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el SNP 2255C>T.
Los genotipos homocigotos mutados, AA y TT de ambos polimorfismos, fueron
ix
asociados a cambios en la respuesta a la warfarina. La dosis media de
anticoagulante recibida por los pacientes fue de 5,084 mg/día y ésta disminuye
conforme aumenta la edad de los afectados. La información derivada de esta
investigación es importante para el médico, porque permitirá ajustar y administrar las
dosis adecuadas del fármaco a cada paciente, dependiendo de su genotipo y
respuesta al tratamiento. Este es el primer avance en Venezuela asociando
variabilidad genética y trombosis venosa.
Palabras claves: Warfarina, Trombosis, Polimorfismo, VKORC1
x
ÍNDICE GENERAL
Página
RESUMEN
DEDICATORIA
viii
v
AGRADECIMIENTOS
vi
INDICE DE TABLAS
xiv
INDICE DE FIGURAS
xvii
ABREVIATURAS
xix
INTRODUCCIÓN
1
OBJETIVOS
4
MARCO TEÓRICO
5
JUSTIFICACIÓN
40
MARCO METODOLÓGICO
42
RESULTADOS
53
DISCUSIÓN
80
CONCLUSIONES
100
RECOMENDACIONES
101
REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
102
FINANCIAMIENTO
109
ANEXOS
110
xi
ÍNDICE GENERAL
Página
APROBACIÓN DEL JURADO
iii
DECICATORIA
v
AGRADECIMIENTOS
vi
RESUMEN
viii
ÍNDICE GENERAL
x
ÍNDICE DE TABLAS
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS
xix
I. INTRODUCCIÓN
1
II. OBJETIVOS
4
II.1. Objetivo General
4
II.2. Objetivos Específicos
4
III. MARCO TEÓRICO
5
III.1. Coagulación Sanguínea
5
III.2. Trombosis
13
III.2.1. Trombosis Venosa
14
III.3. Factores de Coagulación dependientes de la Vitamina K
17
III.4. Anticoagulantes Orales
19
III.4.1 Warfarina
19
III.4.2. Efecto del Componente Genético en la respuesta al
tratamiento con warfarina
24
III.4.2.1. VKORC1
24
III.4.2.2. Polimorfismos en el gen VKORC1
25
xii
IV. JUSTIFICACIÓN
40
V. MARCO METODOLÓGICO
42
V.1.Análisis Clínico Descriptivo
42
V.1.1.Población
42
V.1.2. Selección del Grupo Pacientes
42
V.1.3. Selección del Grupo Control
43
V.1.4. Toma de Muestras
43
V.1.5. Recolección de Data Clínica
44
V.2. Diagnóstico Molecular
44
V.2.1. Extracción de ADN genómico
44
V.2.2. Determinación de la concentración de ADN genomico (ADNg)
45
V.2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa
45
V.2.4. Electroforesis en geles de Poliacrilamida
46
V.2.5. Análisis de Polimorfismos de Nucleótidos Simples
47
V.2.6. Secuenciación
51
V.2.7. Análisis de secuencias
51
V.3. Análisis Estadístico
VI. RESULTADOS
52
53
VI.1. Análisis Clínico Descriptivo
53
VI.2. Diagnóstico Molecular
57
VI.2.1. Aislamiento de ADN genómico
57
VI.2.2. Análisis de los Polimorfismos de Nucleótidos Simples en el gen
VKORC1
58
VI.2.2.1 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple
-1639G>A en el gen VKORC1.
58
VI.2.2.2 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple 106G>T
en el gen VKORC1.
61
VI.2.2.3 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple 698C>T
en el gen VKORC1.
VI.2.2.4 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple
63
xiii
2255C>T en el gen VKORC1.
66
VI.2.2.5 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple
3730G>A en el gen VKORC1.
VI.2.3. Análisis de Secuencias de los SNPs en el gen VKORC1
VI.3.Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg en la población
69
71
71
VI.4. Asociación de la edad de los pacientes con trombosis venosa
y los requerimientos de anticoagulante oral (dosis de warfarina).
72
VI.5. Análisis de asociación por coeficiente de determinación de la
dosis de warfarina en relación al polimorfismo genético.
73
VI.6. Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen
VKORC1 y Trombosis Venosa.
VI.7. Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1.
75
76
VI.8. Análisis de riesgo para los polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T
del gen VKORC1 en relación a la Trombosis Venosa.
78
VI.9. Determinación del Desequilibrio de Ligamiento entre los
polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1
VII. DISCUSIÓN
79
80
VIII. CONCLUSIONES
100
VIII. RECOMENDACIONES
101
IX. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
102
XI. FINANCIAMIENTO
109
XI. ANEXOS
110
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I. Tiempo de vida media de los Factores de Coagulación.
22
Tabla II. Clasificación de los SNPs por Haplotipos
29
Tabla III. Principales SNPs en el gen VKORC1 relacionados con la
respuesta a la Warfarina que fueron investigados en este trabajo.
39
Tabla IV. Resumen de los SNP en el gen VKORC1 para ser
analizados por PCR-RFLP.
48
Tabla V. Identificación de las enzimas de restricción empleadas en el
análisis de SNPs por PCR-RFLP.
50
Tabla VI. Características de la población.
56
Tabla VII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo -1639G>A.
61
Tabla VIII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 698C>T .
66
Tabla IX. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 2255C>T.
68
Tabla X. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 3730G>A.
71
xv
Tabla XI. Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg (H-W) para
los polimorfismos estudiados en el gen VKORC1 en el grupo control.
72
Tabla XII. Análisis de Varianza mediante ecuación de regresión lineal
simple estableciendo los requerimientos de warfarina basados en el
polimorfismo y las variantes genotípicas.
74
Tabla XIII. Análisis de riesgo para la trombosis venosa en relación a las
variantes genómicas de los SNPs en el gen VKORC1
77
Tabla XV. Resumen de Análisis de Asociación entre los polimorfismos
-1639G>A y 2255C>T en el gen VKORC1
78
xvi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Modelo clásico de la Cascada de la Coagulación.
7
Figura 2. Fases de la coagulación según el nuevo modelo celular.
10
Figura 3. Ciclo de la Vitamina K.
18
Figura 4. Estructura química de la warfarina.
20
Figura 5. Mecanismo de acción de la warfarina.
21
Figura 6. Esquema gráfico de la organización del gen VKORC1.
24
Figura 7. Modelo que propone la topología de VKORC1.
25
Figura 8. Esquema gráfico del gen VKORC1 y sus principales polimorfismos.
35
Figura 9. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B)
en el grupo de Pacientes.
54
Figura 10. Grafico de patologías presentadas por el grupo de pacientes.
55
Figura 11. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B)
en el grupo Control.
55
Figura 12. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 0,8% de los ADN genómicos (ADNg) aislados.
Figura 13.Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de
57
xvii
nucleótido simple -1639G>A presente en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa.
58
Figura 14. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel
de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP
presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa.
59
Figura 15. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de
nucleótido simple 106G>T presente en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa.
61
Figura 16. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel
de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP
presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa.
62
Figura 17. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
Poliacrilamida al 8% de productos de digestión con la enzima RsaI.
63
Figura 18. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de
nucleótido simple 698C>T presente en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa.
64
Figura 19. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel
de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP
presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa.
Figura 20. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de
nucleótido simple 2255C>T presente en el gen VKORC1 de algunos
65
xviii
pacientes con trombosis venosa.
66
Figura 21. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel
de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP
presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa.
67
Figura 22. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de
nucleótido simple 3730G>A presente en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa
69
Figura 23. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel
de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP
presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa.
70
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxi nucleico
ADNg: Ácido desoxi nucleico genómico
ADP: Adenosin di fosfato
APC: Proteína C activada
AT III: Antitrombina III
AT: Antitrombina
Ca+2: Cálcio
CYP2C9: citocromo P450, sub familia 2C
dNTPs: Desoxi ribonucleotidos tri fosfatos
EDTA: Ácido tetra etilendiamino
EP: Embolismo pulmonar
ETV: Enfermedad trombo embolítica venosa
FT: Factor Tisular
GGCX: Enzima γ glutamil carboxilasa
GLA: Ácido γ carboxiglutámico
GLU: Ácido glutámico
INR: Indice internacional normalizado
KH2: Vitamina K quinol
Min.: Minuto
mL: Mililitro
mM: Mili molar
o
C: Grados Celsius
PAI-1: Inhibidores de los activadores del plasminógeno 1
pb: Pares de bases
PC: Proteína C
PCR: (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa
PIG2: Prostaciclina I 2
PS: Proteína S
xx
RFLP: (Restriction Fragment Length Polymorphism) polimorfismos en la longitud de
los fragmentos de restricción
SNP: Polimorfismo de nucleótido simple
TAFI: Inhibidor fibrinolítico dependiente de la trombina
TFPI: Inhibidor fisiológico de la vía del factor tisular
TM: Trombomodulina
t-PA: Activador tisular del plasminógeno
TVP: Trombosis venosa profunda
UTR: Región no traducida
VKO: Vitamina K epóxido
VKOR: Vitamina K epóxido reductasa
VKORC1: Complejo 1 de la vitamina K epóxido reductasa
VKR: Vitamina K oxido reductasa
ηM: Nano molar
ηm: Nanómetro
μg: Microgramo
μL: Microlitro
1
I. INTRODUCCIÓN
La trombosis es un trastorno vascular que se presenta cuando el proceso de
coagulación o hemostasia secundaria se ve alterado, tanto en su activación como en
su regulación, ocasionando la formación de un trombo o coágulo. Cuando esto
sucede se bloquea de forma total o parcial el flujo sanguíneo. Esta es una
enfermedad potencialmente grave, ya que la oclusión del flujo sanguíneo conlleva a
la falta de oxigenación del tejido u órgano que abastece y en consecuencia, por falta
de irrigación provoca el daño orgánico, incluso la muerte (Benítez y col., 2004).
Una de las terapéuticas más usadas en la práctica clínica a nivel mundial,
indicada en la prevención y tratamiento de pacientes con desordenes trombóticos
venosos y arteriales, es la anticoagulación oral (D’Andrea y col., 2005). Entre las
drogas anticoagulantes de administración oral más utilizada, está la warfarina, la cual
es un derivado cumarínico y fue introducida en el mercado hace más de 60 años.
Ésta es usada en todo el mundo en la profilaxis y tratamiento del tromboembolismo
arterial y venoso, para la prevención primaria y secundaria de ambas patologías
(Osman, 2007). Es un efectivo anticoagulante que actúa por antagonismo de la
vitamina K, inhibiendo la acción de factores de coagulación dependientes de esta
vitamina (Caldwell y col., 2007). Las proteínas o factores vitamina K dependientes
juegan un papel muy importante en la activación del proceso de coagulación
sanguínea, así como en el mecanismo natural de anticoagulación, lo que es
importante para mantener un adecuado flujo sanguíneo (Wang y col., 2006). En
ausencia de la vitamina K o en presencia de anticoagulantes, como la warfarina,
estas proteínas no pueden ejercer su papel en la coagulación, evitándose así la
formación de trombos.
La terapia con anticoagulantes orales para contrarrestar la trombosis, debe
realizarse con un cuidado especial en cuanto a la dosis a aplicar, porque no sólo se
emplea con el objetivo de evitar complicaciones de la patología en sí, sino que debe
2
asegurarse en todo momento, que las dosis sean adecuadas para no ocasionar
sangrado, o al menos reducir el riesgo de hemorragias (Benítez y col., 2004).
La respuesta a la warfarina entre pacientes es muy amplia y diversa, por lo
que el uso de la misma dosis para todos los pacientes puede ocasionar distintas
respuestas. Las diferencias terapéuticas de la warfarina dependen de la variación
inter e intra individual de la población (Yuan y col., 2005). Esto es, que existen
factores ambientales y adquiridos que pueden modificar la acción de la droga, como
lo son la absorción de vitamina K, el consumo de alimentos ricos en esta vitamina, la
edad, el índice de masa corporal, la co-medicación, así como el componente
genético (Scott y col., 2008. Gage y Lesko, 2008).
En relación al componente genético, se ha asociado cambios en la respuesta
a la warfarina con la presencia de variantes de los genes que codifican para la
citocromo P450, sub familia 2C (CYP2C9), enzima encargada del metabolismo de la
warfarina y para el complejo 1 de la vitamina K epóxido reductasa (VKORC1), el cual
es responsable de reducir la forma oxidada de la vitamina K de manera cíclica. Se ha
sugerido que alteraciones en los genes que conlleven a cambios en estas proteínas,
pudieran provocar alteraciones en la farmacogenética y farmacodinámica de la
warfarina (Rettie y Tai, 2006).
Específicamente para VKORC1, se han realizado investigaciones donde se ha
establecido la relación entre algunas alteraciones del gen con la resistencia a la
warfarina (Rieder y col., 2005. Scott y col., 2008). Si bien estos resultados son de
referencia, no expresan necesariamente la realidad de la población latinoamericana
(Marsh y col., 2006).
Las alteraciones en el gen que codifica para la VKORC1 también han sido
asociada tanto a los desordenes hemorrágicos como a los tromboembólicos, como
es el caso de la trombosis venosa.
Es posible que ciertas modificaciones en
VKORC1 tengan una influencia en el ciclo de oxido reducción de la vitamina K,
principalmente en la activación de ciertas proteínas responsables de la constitución
3
del trombo. Así mismo, alteraciones que afectan la capacidad de unión de la
warfarina pueden modificar su efecto, causando distintas respuestas al tratamiento
(Rost y col., 2004).
En Venezuela, no se han realizado hasta ahora, estudios moleculares que
permitan establecer un programa coordinado de terapéutica, para pacientes con
trombosis venosa sometidos a tratamientos con anticoagulantes orales, ni se ha
establecido si existe alguna asociación entre los genotipos de los polimorfismos
presentes en el gen VKORC1 y la trombosis venosa. Es por ello que es conveniente
realizar un estudio que permita identificar y determinar la frecuencia de polimorfismos
en este gen.
Basado en lo que previamente se ha señalado, en este trabajo se investigó la
relación entre los genotipos de algunos polimorfismos en el gen VKORC1, con la
trombosis venosa y con la resistencia al tratamiento con anticoagulantes orales. Este
trabajo está enmarcado en el proyecto de grupo titulado "Diagnóstico de
polimorfismos asociados a la trombosis arterial y venosa” que se lleva a cabo entre el
Laboratorio de Genética Molecular Humana B, de la Universidad Simón Bolívar, el
Banco Municipal de Sangre de Caracas, Hospital Dr. Miguel Pérez Carreño y el
Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas.
4
II. OBJETIVOS
II.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la frecuencia genotípica de los polimorfismos en el gen VKORC1, en
pacientes con trombosis venosa e individuos sanos en la población de Venezuela y
establecer su relación con la patología y la respuesta al tratamiento anticoagulante.
II. 2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Determinar en pacientes con trombosis venosa la frecuencia genotípica de los
polimorfismos -1636G>A, 106G>T, 968C>T, 2255C>T y 3730G>A en el gen
VKORC1, mediante PCR y RFLP.
•
Establecer la frecuencia genotípica de los diferentes polimorfismos del gen
VKORC1, en individuos sanos (población no afectada).
•
Establecer la relación de los genotipos de los polimorfismos encontrados en
VKORC1
con
anticoagulante.
la
trombosis
venosa
y
la
respuesta
al
tratamiento
5
III. MARCO TEÓRICO
III.1. Coagulación Sanguínea
En condiciones normales, la sangre fluye a través de los vasos sanguíneos del
organismo sin provocar activación en sus componentes celulares. Eventualmente,
pueden activarse los sistemas de coagulación para formar un coagulo (condiciones
fisiológicas) o un trombo (patológico), ya que al producirse alguna lesión que genere
una alteración de la fisiología vascular, tanto en el endotelio como sub endotelio
(fibroblastos, proteínas de la matriz), se desencadena un proceso denominado
hemostasia (Colman, 2006).
La hemostasia comprende un conjunto de mecanismos, cuya principal función
es promover el cese fisiológico del sangrado, cuando se presenta un trauma, una
cirugía o una enfermedad que alteren la pared vascular, garantizando la fluidez de la
sangre dentro del sistema vascular. En este proceso, interactúan un conjunto de
elementos, que se localizan en el punto de la lesión, con la finalidad de formar una
barrera estructural que impida la pérdida de sangre, lo que involucra un cambio de
estado físico de líquido a sólido, con la formación de fibrina, y el enlace del coágulo
en una malla insoluble. Las características de la coagulación sanguínea requieren
que las reacciones implicadas en el proceso sean localizadas en el lugar de la lesión,
sigan un proceso de amplificación, respondan a un sistema de regulación, sean
autolimitadas y que ocurran en un tiempo relativamente muy corto (Quintana, 2002).
Durante el proceso de coagulación sanguínea se pueden definir distintas
etapas secuenciales que se inician con la vasoconstricción. Posteriormente se forma
un tapón hemostático primario bastante inestable, conformado principalmente por
plaquetas y glóbulos rojos, que luego es reforzado por una a serie componentes que
finalizan con la formación de un coagulo estable de fibrina, el cual será disuelto
posteriormente. Debido a su importancia, se ha estudiado por muchos años el
proceso de coagulación sanguínea, dividiéndolo en tres fases principales:
vasoconstricción, hemostasia primaria y hemostasia secundaria; dependiendo de los
6
componentes que se activan, los cuales están estrechamente relacionadas entre sí y
son necesarios para subsanar el problema. Finalmente, se suma a estos tres
importantes procesos un mecanismo denominado fibrinólisis, encargado de la
disolución final del coágulo, una vez reparado el daño en el endotelio o solventado el
procesos hemorrágico (Pérez, 2006).
Específicamente, el proceso de vasoconstricción surge como respuesta
inmediata a la lesión, con la finalidad de disminuir el diámetro del vaso sanguíneo y
retrasar de alguna manera la hemorragia. Simultáneamente y unos segundos
después, el sistema plasmático libera al torrente sanguíneo una serie de sustancias
que provocan la agregación de las plaquetas, que en condición normal circulan de
manera desagregadas y no se adhieren al endotelio. Esta fase, conocida como
hemostasia primaria, comprende, la adhesión, la activación y la agregación de las
plaquetas entre sí, por una serie de modificaciones internas, además de la liberación
del contenido de sus gránulos, así como de calcio, ADP, tromboexano A2, entre otras
sustancias que mantienen el proceso activado. La función de las plaquetas es
primordial para el desarrollo del proceso que prosigue, llamado cascada de la
coagulación y que esta integrado por diversos factores proteicos, iones y fosfolípidos.
A esta etapa se le denomina, hemostasia secundaria (Centurión, 2000).
La coagulación sanguínea o hemostasia secundaria, consiste de una serie
de reacciones que van activando proteínas, que finalizan con la formación de
trombina, enzima proteolítica con la capacidad de transformar fibrinógeno en fibrina.
Desde hace más de 100 años se ha estado estudiando una serie de proteínas que
intervienen en la coagulación, inicialmente de forma aislada y hoy en día de manera
conjunta, lo que permite entender la amplificación del proceso (Forastiero y
Martinuzzo, 2006).
De acuerdo a lo que señala Pérez y Bover en el 2007, para la década de los
60, el modelo de la coagulación presentado por MacFarlane (1964) fue de gran
utilidad para dar a conocer la complejidad de la formación del trombo. Desde
7
entonces se comenzó a describir al proceso de la coagulación en forma de cascada,
como una ruta con dos vías: la extrínseca iniciada por el factor tisular y el factor VII; y
la intrínseca, en la que ocurre la activación de los factores XII, XI, IX, VIII y V. Ambas
vías convergen en una vía común para activar el factor X y continuar conjuntamente
el proceso de transformación de la protrombina en trombina y, a través de la
trombina del fibrinógeno en fibrina y formar finalmente el coágulo estable (Figura 1).
Figura 1. Modelo clásico de la Cascada de la Coagulación.
Vía intrínseca, extrínseca y común. (Tomado de: Quintana, 2002)
El modelo clásico de la cascada de la coagulación propone que la activación
de los factores de coagulación se produce de manera secuencial, cada factor sirve
de sustrato para el siguiente. Este proceso se inicia cuando un fragmento
polipeptídico de una proteína convierte un zimógeno inactivo en una enzima activa.
El sitio activo de las enzimas de este proceso, excepto del factor XIII activado (XIIIa),
es un residuo de un aminoácido serina, por lo que se denominan serin proteasas, de
esta forman cumplen su actividad catalítica (Diaz y Almargo, 2001). En este modelo
clásico, la activación de los factores de la coagulación comienza cuando el factor XII
se une a la superficie subendotelial cargada negativamente y expuesta por daño del
endotelio vascular. El factor XII se autoactiva, transformándose a factor XII activado
(XIIa). El factor XIIa produce la escisión proteolítica y la activación del factor XI a
8
factor XIa, éste a su vez, activa al factor IX convirtiéndolo a factor IXa, proceso que
requiere de calcio. Finalmente, el factor IXa produce la activación del factor X, esta
fase también requiere de calcio, de los fosfolípidos de superficie y de un cofactor
glicoproteíco, el factor VIIIa. Con la activación del factor X culmina la vía intrínseca
(Figura 1) (Centurión, 2000).
La activación del factor X puede producirse independientemente de la
activación del factor XII por la vía intrínseca. Las proteínas liberadas al medio por los
tejidos del epitelio vascular lesionado, actúan como un cofactor para la activación del
factor X por el factor VII. El factor Tisular permite la activación del factor VII a factor
VIIa, y se forma el complejo FT-VIIa, el cual promueve, en presencia de calcio y los
fosfolípidos de las plaquetas, la activación del factor X. De esta manera se completa
la activación de la vía extrínseca. Se conoce que el factor VIIa también puede
activar al factor IX uniendo así ambas vías. Por eso se apoya el hecho que ambas
rutas comparten sistemas de activación y amplificación, mediante los factores XIIa,
IXa y VIIa. (Figura 1) (Colman, 2006).
Basados en esta complementariedad, el factor Va, el factor plaquetario 3 que
actúa como catalizador y el calcio, conjuntamente con el factor Xa transforman la
protrombina (factor II) a trombina (factor IIa) en una vía común (Figura 1).
La
trombina formada, previamente escinde a la molécula de fibrinógeno en monómeros
solubles de fibrina que luego se unen para formar una matriz soluble de fibrina. El
factor estabilizante de fibrina (factor XIII) activado por la trombina transforma las
fibras solubles de fibrina en un coágulo insoluble (Diaz y Almargo, 2001).
En los últimos años, se ha propuesto que a nivel fisiológico el mecanismo de
la coagulación ocurre a través de un proceso cuyo modelo propone la participación
de un componente celular (el plaquetario, las células endoteliales y fibroblastos)
como complemento a los factores de coagulación previamente descritos (Monroe y
Hoffman, 2006). Este modelo resalta la importancia que desempeña las diferentes
células en la iniciación, amplificación, progreso y terminación de todo el proceso de
9
coagulación; las reacciones ocurren sobre la superficie de las plaquetas y el
endotelio vascular, que de alguna manera median o controlan en tiempo la
generación del tapón hemostático.
Los aportes de los nuevos estudios se basan, por una parte, en que los
factores de coagulación, tanto de la vía extrínseca como de la intrínseca, llegan a
actuar casi simultáneamente y no de manera independiente y secuencial como se
creía. Este modelo propone que previo a la fase de iniciación, se encuentran en la
sangre niveles basales de los componentes enzimáticos o factores de la coagulación
activados, sin que esto ocasione riesgo de coagulación, debido a que en la superficie
se encuentran inhibidores efectivamente localizados (Monroe y Hoffman, 2006). Los
investigadores proponen que para que el proceso se logre completamente, es
necesario de tres fases continuas, una inicial, una de amplificación y una de
propagación, donde el componente celular plaquetario y endotelial es indispensable
para la consolidación de las etapas finales del proceso (Figura 2) (Pérez y Bover,
2007).
En la fase de iniciación, la superficie celular del endotelio vascular y de las
plaquetas son realmente importantes, porque sobre ella se expresa el factor tisular
que forma complejo con el factor VIIa, el cual activa a los factores IX y X. Cuando
esta activación tiene lugar, el factor Xa se une al factor V para transformar pequeñas
cantidades de protrombina a trombina, siendo ésta aún insuficiente para formar la
fibrina (Monroe y Hoffman, 2006).
En una segunda etapa, la fase de amplificación, la consecuente activación
de las plaquetas permite la liberación de sustancias necesarias para formar un ciclo
de continua retroalimentación.
Tanto el calcio como los fosfolípidos, junto a la
trombina previamente formada en la fase de iniciación, provocan la activación de
cofactores como el V y el VIII en la superficie de las plaquetas, así como también del
factor XI. Para el final de esta fase, la cantidad de trombina, es apreciable (Monroe y
Hoffman, 2006).
10
Figura 2. Fases de la coagulación según el nuevo modelo celular. Están presentes los
factores de coagulación, calcio, fosfolípidos y factor tisular (Tomado de: Pérez y Bover, 2007).
Finalmente, Monroe y Hoffman (2006) proponen que en la fase de
propagación ocurren una serie de eventos sobre la superficie de la plaqueta. Los
factores IX, VIII,
XI y V activados en las fases anteriores forman complejos
enzimáticos sobre la superficie celular y en conjunto activan grandes cantidades de
factor X y éste a su vez transforma protrombina a trombina, suficiente para formar un
tapón definitivo, el cual es estabilizado por el factor XIII activado y por la trombina.
En la actualidad y basados en el modelo celular de la coagulación sanguínea,
se conoce la importancia que tienen las superficies celulares (plaquetas, células
endoteliales, fibroblastos y monocitos) en el proceso. Las células tienen dos papeles
básicos en la hemostasia normal; una de ellas es proporcionar una superficie para el
ensamblaje de los complejos enzima/cofactor y su interacción con los sustratos para
formar el coágulo de fibrina y la otra, proporcionar los factores de la coagulación que
no estén presentes en el plasma normal; además de brindar un mecanismo de
control inhibitorio, que garantice la fluidez de la sangre sin riesgo a trombosis (Mann,
2003).
11
Regulación de la Coagulación. Sistema fibrinolítico.
El control de la coagulación sanguínea se logra mediante varios mecanismos
de anticoagulación y en todos los niveles del sistema. El primero de ellos es el que
se desarrolla por la vía del inhibidor fisiológico del factor tisular (TFPI), el cual regula
el inicio de la coagulación. Este se une e inhibe al FXa recién activado, que se
asocia a su vez con el complejo: factor tisular-FVIIa. Así mismo, todas las enzimas
de coagulación activadas pueden ser inhibidas por una serin proteasa circulante, la
Antitrombina (AT), particularmente cuando las enzimas no actúan con su cofactor.
Como su nombre lo indica, su principal función es inhibir a la trombina (Dahlbäck,
2008., Mann, 2003).
Otro mecanismo de control se logra mediante la regulación de dos factores de
coagulación (FVIIIa y FVa). Esto ocurre por el sistema anticoagulante de la proteína
C (PC), específicamente rompiendo un número limitado de enlaces peptídicos entre
el FVIIIa y FVa, cuando no está unido al factor von Willebrand. Para que sea posible
debe activarse la proteína C (APC) por acción de la trombina.
Por su parte, la
trombomodulina (TM), es un cofactor esencial para comprender el mecanismo. La
TM esta presente en la superficie de las células endoteliales y la trombina que se
genera en las inmediaciones del endotelio intacto se une con gran afinidad a la TM.
La alta concentración de TM en la microcirculación local es crucial para la activación
de la proteína C y la anticoagulación de la sangre (Dahlbäck, 2008., Mann, 2003).
Existe otra proteína dependiente de vitamina K, denominada proteína S (PS)
que funciona como cofactor de la APC, esta proteína puede encontrarse en dos
formas en el plasma; como proteína S libre y formando complejo con una de las
proteínas de unión del complemento c4b (C4BP), proporcionando así un control local
del sistema de activación del complemento. La proteína S por sí sola puede inactivar
el FVa, pero requiere de éste último para la inactivación de FVIIIa. (Dahlbäck B.,
2005).
12
Por otra parte y simultáneamente al proceso de formación del trombo se
produce la lisis del mismo. El coagulo de fibrina sirve de base para que se inicie la
cicatrización del tejido lesionado; éste coágulo es eliminado por acción del sistema
fibrinolítico, el cual consta de una serie de reacciones enzimáticas que ocurren de
manera simultánea y de forma fisiológica en el organismo, conllevando a la
disolución del coagulo formado. El proceso mediante el cual la fibrina es degradada
enzimáticamente, se denomina fibrinólisis. El principal componente de este
mecanismo es la plasmina, cuyo precursor es el plasminógeno. La plasmina es la
enzima que se encarga de disolver el coágulo formado para reestablecer el flujo
sanguíneo y evitar problemas como la trombosis; si se perpetúa la fibrinólisis en el
tiempo puede ocasionar desordenes hemorrágicos. El sistema debe estar en
equilibrio,
para
ello,
deben
estarlo
también
sus
componentes:
Plasminógeno/plasmina, activadores, inhibidores y reguladores (Pérez, 1995).
Las reacciones enzimáticas de este sistema deben ser garantizadas cuando
se activan los mecanismos de control en la activación y degradación de las proteínas
que intervienen en el proceso, entre ellas se encuentran el activador tisular del
plasminógeno (t-PA), los inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI-1) y la
antiplasmina (α2-Antiplasmina) (Quintana, 2002).
Existen otras proteínas que intervienen en el proceso de control de la
hemostasia, las cuales tienen funciones complejas y específicas; el cofactor II de la
heparina es uno de ellos (Quintana, 2002), así como también se han descrito otros
factores en diversos estudios igualmente influyentes como la proteína Z, el inhibidor
fibrinolítico dependiente de la trombina (TAFI) y las anexinas. (Forastiero y
Martinuzzo, 2006).
Debido a que el proceso de coagulación tiene un perfecto balance, entre las
reacciones procoagulantes y anticoagulantes, alteraciones en estos procesos pueden
desencadenar, como se ha mencionado previamente, estados de hiper o
13
hipocoagulabilidad, originando en consecuencia desordenes hemorrágicos o
trombóticas, siendo éste último de especial interés en este trabajo.
III.2. Trombosis
La trombosis es un proceso patológico, caracterizado por la formación de un
coágulo que obstruye el flujo sanguíneo, pudiendo ocasionar isquemia en los tejidos
que abastece o infarto en órganos. La formación de trombos puede ocurrir como
consecuencia de la activación anormal del proceso de la coagulación y del sistema
fibrinolítico, lo que induce a una disminución del flujo sanguíneo. Su origen es
producto de la interacción de fenómenos vasculares, celulares y humorales.
Dependiendo de la instalación de la obstrucción, la trombosis puede localizarse en la
circulación venosa o en la arterial (Bañas, 2001).
Es necesario diferenciar entre trombosis venosa y arterial, porque no sólo el
origen es diferente, sino que también lo son su fisiopatología y
tratamiento. La
Trombosis Arterial es aquella que ocurre en las arterias y son los daños en la pared
vascular los que contribuyen a la liberación de ADP, a la activación y agregación de
las plaquetas al sitio de la lesión, al rompimiento de eritrocitos, pero en menor
proporción en la formación de fibrina (Heras y cols., 1999). Una de las causas
principales de los daños en la pared vascular es la placa de ateroma, formada por un
cúmulo de lípidos, de células, macrófagos y tejido conjuntivo que disminuye
considerablemente la luz del vaso arterial (Jiménez, 2002).
Por otro lado, en la Trombosis Venosa, predomina la activación del sistema
de coagulación y el depósito de fibrina. La participación del daño vascular no es tan
importante como en la trombosis arterial; en este caso cobra mayor relevancia los
estadios de hipercoagulabilidad y el estancamiento sanguíneo, debido a que los
vasos venosos, se caracterizan por un flujo sanguíneo lento, baja presión y baja
velocidad. Esta disminución del flujo sanguíneo aumenta la viscosidad de la sangre,
14
lo que hace que la concentración de trombina sea tal, que los mecanismos de
inhibición de la coagulación no sean suficientes, generándose un coágulo o trombo
venoso en la zona (Heras y col., 1999). Son muchos y muy diversos los factores de
riesgo que conllevan a los individuos a manifestar patologías trombóticas, sin
embargo aquellos que han sido expuestos a cirugías o traumas que causan una
inmovilización prolongada y no reciben un tratamiento preventivo adecuado son
candidatos potenciales. Así mismo, hay condiciones como el embarazo, las
enfermedades cardíacas y neurológicas, varicosidades, neoplasias, que aumentan el
riesgo a padecer de trombosis venosa. Hay otros factores independientes como la
edad, la obesidad, la raza, el grupo sanguíneo, el uso de anticonceptivos orales,
entre otros que favorecen a la aparición de la patología (Pérez, 1995). Igualmente
hay factores genéticos que crean deficiencia de proteína C, proteína S y antitrombina
III y otros que presenten alteraciones adquiridas que produzcan hipercoagulabilidad
(Rodrigo y Villa, 2002).
Tanto la trombosis venosa como arterial, son patologías igualmente graves, ya
que mueren muchas personas a consecuencia de ello (Jiménez, 2002). Aunado a
esto, existe un componente adquirido predisponente en la formación de trombos y
por tanto de la trombosis, sin embargo, cada día cobra mayor atención las
alteraciones genéticas que influyen en el origen de esta patología.
III.2.1 Trombosis Venosa
Específicamente el tromboembolismo venoso, incluye dos formas de
expresión clínica, la trombosis venosa profunda (TVP) y el embolismo pulmonar (EP),
que se consideran manifestaciones de una misma enfermedad y comparten el mismo
tratamiento (Bañas, 2001). Éstas, en conjunto con la expresión clínica de la
trombosis arterial tanto en el sistema vascular como neurovascular, constituyen una
importante causa de morbimortalidad en todo el mundo (González y col., 2006). En
Estados Unidos anualmente a causa de la trombosis venosa, se reportan
aproximadamente 300.000 hospitalizaciones y alrededor de 50.000 muertes.
15
Expresado de otra forma, 100 de cada 100.000 individuos están en riesgo de
desarrollar trombosis venosa en ese país, siendo mas frecuente en adultos mayores
que en niños, donde se alcanza menos de 5 casos por cada 100.000 personas
(Ofuso, 2006). Esta realidad no es distinta en ciertos países latinoamericanos, donde
más de la mitad de las defunciones en adultos son debidas a problemas
tromboembólicos.
En Venezuela, no hay estudios que sustenten las cifras reales de la trombosis
venosa, aunque se cuenta con algunas descripciones importantes que llevan a
pensar en la enorme probabilidad de presentar de trombosis venosa profunda o
embolismo pulmonar. En nuestro país, aproximadamente el 50% de los casos no son
reportados porque permanecen asintomáticos, no existe un registro estadístico
confiable en cuanto a la morbimortalidad de esta patología. Aplicando criterios de
prevalencia mundial se estima la existencia de 24.000 casos nuevos por año y en
estudios prospectivos se ha determinado una incidencia aproximada de 0,1% para la
población general que llega a incrementarse hasta 1% para individuos mayores de
40 años, siendo más frecuente en mujeres (Molero y col., 2005). Pérez reporta que la
incidencia anual a nivel mundial de trombosis venosa aumenta con la edad: de una
frecuencia de 1 por 100.000 en la infancia, pasa a 1 por 100 en las edades
avanzadas.
Es
decir,
que
por
cada
100.000
habitantes,
se
presentarán
aproximadamente 160 casos de trombosis venosa profunda (TVP) y 50 casos de
tromboembolismo pulmonar fatal al año (Pérez, 2006).
Existen factores predisponentes, que pueden ocasionar riesgo a presentar
trombosis venosa.
Se ha definido una triada clásica denominada, la triada de
Virchow relacionado con estos factores: (Kahn, 1998).
•
Estasis venoso, asociado a un estado de sedentarismo, obesidad,
inmovilidad, patologías que cursen con disminución del gasto cardíaco,
venodilatación, efectos hemodinámicos disminuidos, desaparición de
los mecanismos de la bomba muscular, entre otros.
•
Coagulopatías o estados de hipercoagulabilidad, donde el sistema de
coagulación está alterado. Se produce un aumento del fibrinógeno y de
16
algunos factores de coagulación (VII, VIII, IX y X). Déficit en los
inhibidores de la coagulación, disminución de ciertas proteínas como la
C, S y antitrombina III, favoreciendo la formación de trombina y por
ende del proceso de trombosis.
•
Lesiones endoteliales, que activan las vías de la coagulación, tanto
intrínseca como extrínseca, desencadenando las reacciones de
coagulación y desapareciendo los sistemas fibrinolíticos.
Así mismo, algunas condiciones adquiridas como por ejemplo, el consumo de
los anticonceptivos orales, el tabaquismo, la diabetes y la inactividad física, entre
otras. Éstas están más directamente implicadas en la importancia y frecuencia para
el desarrollo y la consolidación del trombo o proceso vaso oclusivo (Jiménez, 2002)
(Benítez y col., 2004). También se ha establecido que la presencia de factores
genéticos conllevan a una tendencia trombótica familiar, aunque aún no está del todo
claro la asociación entre los alelos de ciertos polimorfismos en diferentes genes y la
trombosis venosa (Smadja y col., 2008).
La mayoría de las investigaciones sobre el proceso de la coagulación y sus
complicaciones, van dirigidas a contrarrestar la tendencia a la trombosis, en aquellas
personas con predisposición a sufrirla, controlando los factores claves de
amplificación y propagación de la cascada de la coagulación. Estos son, el factor
tisular, el factor X y el VIII, así como también la protrombina y trombina. Sin embargo,
se ha señalado que muchas de las drogas utilizadas muestran ciertos grados de
toxicidad hepática (Pérez y Bover, 2007). Adicionalmente, el control específico sobre
el VIII por ejemplo, logra ser efectivo con ciertos tratamientos, pero se hacen
insuficientes en muchos casos y en otros es limitado su aplicación. Debido a esto, se
ha considerado que lo más difícil de mantener es el equilibrio homeostático entre
factores trombóticos y hemorrágicos durante el tratamiento anticoagulante.
Evidentemente estos pueden alterarse por una inhibición insuficiente de la
coagulación, en el caso de la trombosis, o por la aparición de hemorragia debido a
excesivo tratamiento antitrombótico (Pérez y Bover, 2007).
17
A nivel mundial la terapia antitrombótica va dirigida a la prevención de los
procesos crónicos, y debe conjugar los alcances efectivos, con la repercusión
económica. Heras y colaboradores en el 2007 explican que para indicar un
tratamiento antitrombótico, debe determinarse previamente el tipo de sustrato
trombogénico y evaluar el riesgo relativo de sufrir un episodio tromboembólico. Uno
de los tratamientos más ampliamente utilizado contra la trombosis a nivel mundial,
incluyendo nuestro país, es el uso de los anticoagulantes orales, conocidos como
cumarínicos, donde la warfarina es un ejemplo de ellos. Estos son fármacos que
permiten inhibir la coagulación a través de su acción sobre los factores de la
coagulación cuya función es dependiente de la vitamina K.
III.3. Factores de Coagulación dependientes de la Vitamina K
La vitamina K es un compuesto químico con propiedades procoagulantes, ya
que interviene como co-factor en la gamma glutamil carboxilación del factor II
(protrombina), factor VII (proconvertina), factor IX (componente de la tromboplastina)
y factor X (Spronk, 2006). Existen otros factores que también dependen de la
vitamina K, pero estos de manera natural inhiben la coagulación, estos son: la
proteína C, proteína S y proteína Z (González y col., 2006). Por su parte la proteína
Z, está involucrada en la fijación de la trombina a la superficie de los fosfolípidos
(Spronk, 2006).
En los factores de coagulación dependientes de vitamina K, como por ejemplo
en el FII (protrombina), existe un tetrapétido en el extremo N-terminal que contiene
residuos de ácido glutámico (Glu), los cuales sufren modificaciones para
transformarse en ácido γ-carboxiglutámico (Gla). Estos le dan la habilidad a dichos
factores para unirse al Ca+2, lo cual es indispensable para que estos a su vez puedan
unirse a los fosfolípidos de la membrana, unión necesaria para ejercer su función
(Stenflo y col., 1974); (Osman, 2007). El mecanismo de gamma glutamil
carboxilación ocurre gracias al ciclo de la vitamina K (Figura 3), a través de
reacciones que ocurren en la membrana del retículo endoplasmático.
18
Proteína Activa
Proteína Inactiva
Figura 3. Ciclo de la Vitamina K. Reacciones del ciclo de la vitamina K. Explicación en el
texto. (Tomado de Osman, 2007)
Los componentes del ciclo de la vitamina K incluyen las siguientes reacciones:
1. En un primer paso, la Vitamina K hidroxiquinona, obtenida de la dieta
en diversas fuentes de alimentación, es reducida a la vitamina K quinol
(KH2) por una enzima llamada vitamina K reductasa (VKR), o
diaphorase.
Es posible,
DT-
que también pueda ser reducida por la
Vitamina K epoxido reductasa (VKOR) (Osman, 2007).
2. En un segundo paso, una vez generada la KH2 como un cofactor, la
enzima γ-glutamil carboxilasa (GGCX), usa la KH2 en conjunto con CO2
y O2 para convertir los residuos del ácido
glutámico (GLU), en el
extremo N-terminal de las proteínas de la coagulación vitamina Kdependientes, a residuos ácido γ-Carboxiglutámico (GLA).
De esta
forma la GGCX, es también una epoxidasa.
3. En un tercer paso, en la misma reacción y con la misma enzima
(GGCX), la KH2 es oxidada a vitamina K epóxido (VKO). Posteriormente
la VKO es reducida a la forma hidroxiquinona de la vitamina K por
acción de la enzima VKOR.
19
De esta manera se perpetúa el ciclo y se permite la carboxilación de las
proteínas o factores dependientes de vitamina K que intervienen en la cascada de
coagulación.
La deficiencia de vitamina K pueden conducir a deficiencias en las funciones
de los factores de coagulación y en consecuencia, a un sangrado excesivo. Esto
puede ocurrir mediante el bloqueo de la carboxilación de los radicales del ácido
glutámico, del extremo amino terminal de estas proteínas de la coagulación,
impidiendo que se unan mediante el calcio a las cargas negativas fosfolipídicas de la
pared vascular y de las plaquetas.
Estos dos eventos son necesarios en los
procesos que conducen a la formación de coágulos (Heras y col., 2007). Debido a
esto, el ciclo de la vitamina K puede ser blanco farmacológico en el tratamiento de
eventos trombóticas.
Durante los últimos años, la terapia profiláctica antitrombótica con fármacos
antivitamina K se ha incrementado de manera notable en la población, beneficiando
de alguna manera a los pacientes que la consumen. Estas drogas son efectivas y
eficaces, sin embargo tienen un estrecho margen farmacológico. Además, es
importante considerar que hay un gran número de factores que influyen en la
actividad de estos compuestos, entre estos factores están la dieta, una alimentación
rica o baja en vitamina K, la co-medicación, la edad, la condición física en general,
entre otros (Ansell y col., 2004). Si por alguna razón no se cumple efectivamente la
acción del cumarínico y no ejerce su función, no se evita la trombosis o bien si
excede la eficacia del mismo se produce una crisis hemorrágica.
III.4. Anticoagulantes Orales
III.4.1 Warfarina
Para la prevención y tratamiento de anticoagulación de los pacientes con
trombosis venosa, se ha desarrollado desde hace muchos años el cumplimiento de la
terapia con anticoagulantes orales. Como se mencionó anteriormente, una de las
20
drogas por elección son los derivados cumarínicos, como la warfarina, descubierta
en la década de los 40’, hace ya casi 70 años, siendo el anticoagulante más
ampliamente utilizado en la prevención de eventos trombo-embolíticos, ya que
provee eficacia y puede ser adquirido a un bajo costo (Figura 4).
Figura 4. Estructura química de la warfarina. (Tomado de Osman, 2007)
La warfarina, es un compuesto químico estructuralmente similar a la vitamina
K. Basados en esa similitud química, se puede establecer el mecanismo de acción
de esta droga; específicamente interfiere con la interconversión cíclica de la vitamina
K y la vitamina K epóxido, inhibiendo a la vitamina K reductasa (VKR) y la VKOR;
ambas enzimas son las responsables de llevar a la vitamina K a su forma reducida
(KH2) (Hirsh y col., 2001. Montes y col., 2008).
Dicha inhibición ocasiona una
disminución en hígado y en plasma de la KH2, la cual es necesaria para que se
cumpla el ciclo de la vitamina K y por ende la modificación de los factores de la
coagulación mencionados anteriormente (Rettie y Tai., 2006). Es por esto que el
efecto final de la warfarina recae sobre las proteínas de la coagulación, susceptibles
a ser inhibidas en su carboxilación (Figura 5).
La carboxilación es ejercida sobre los 10 a 12 residuos de ácido glutámico
(glutamato) que poseen las proteínas (factores dependientes de vitamina K) en su
extremo aminoterminal, transformándose así a γ-Carboxiglutamato (GLA) por la
acción de la carboxilasa que emplea vitamina K como cofactor, tal como se señaló
previamente. Esa modificación es necesaria para que las proteínas puedan unirse a
las superficies de los fosfolípidos negativos donde se producen las reacciones para
la formación de trombina. Durante el proceso de carboxilación la vitamina K se oxida,
y para que recupere su estado reducido requiere de la acción de la enzima vitamina
21
K epóxido reductasa. Es en este punto donde los cumarínicos actúan inhibiendo
esta enzima (Montes y col., 2008).
a
a
a
a
Trombina
Protrombinaa
Ácido Glutámico
Ácido γ-Carboxiglutámico
Factores de Coagulación (Proteínas Gla)
(FII, FVII, FIX, FX, Proteína C/S)
o
a
Figura 5. Mecanismo de acción de la warfarina. Inhibición de VKORC1 y efecto sobre los factores
de coagulación dependientes de vitamina K. (Tomado y modificado de: Rettie y Tai, 2006; Osman,
2007)
Las dosis aplicadas de warfarina son muy variables y deben ser ajustadas a
cada paciente, esto hace que la terapia sea difícil por el estrecho intervalo
terapéutico, debido a la inter e intra variabilidad individual. Se deben considerar
varios aspectos influyentes antes de iniciar el tratamiento, ya que existen factores
tanto ambientales como genéticos que afectan la respuesta a los fármacos
suministrados. Uno de ellos es la vida media de los factores de coagulación ya
carboxilados en circulación, es decir, el tiempo que transcurre para que sean
completamente metabolizados (D’Andrea y col. 2005).
En promedio, los factores de coagulación mencionados tienen una vida
relativamente corta, dependiendo de su función y del papel que juegue en la
coagulación, sin embargo, el tiempo que transcurre desde su formación hasta su
activación y degradación no excede en algunos casos, de horas y en otros de cinco
a diez días. En la Tabla I se resume la vida media de los factores de coagulación.
22
La seguridad y efectividad de la warfarina debe ser monitoreada realizando
varias determinaciones del tiempo de protrombina, expresado como un Índice
Internacional Normalizado (INR) (Kimura y col., 2007). Al realizar estudios de grupo
se ha observado que se incrementa el riesgo de sangrado cuando el INR está sobre
los límites establecidos y que por el contrario, puede incrementarse el riesgo a
presentar eventos tromboembolíticos si se ubica por debajo del intervalo (Sconce y
col., 2005).
Tabla I. Tiempo de vida media de los factores de coagulación
Factor
Nombre del Factor
Duración de la
vida media
4 a 5 días
2,5 - 3 días
Fibrinógeno
Protrombina
Tromboplastina Tisular
Calcio
Proacelerina. Factor lábil
15 horas -1 día
Pro Convertina. Factor Estable
4 a 6 horas
Factor Anti Hemofílico A
12 a 18 horas
Factor von Willebrand
12 a 18 horas
Factor Anti Hemofílico B
18 a 24 horas
Factor Stuart
1 a 2 horas
Precursor de la tromboplastina plasmática
2 a 3 horas
Factor Hagemann. Factor de contacto
2 horas
Factor
estabilizante
de
la
fibrina
5 días
XIII
Modificado de: http://uam.es/departaentos/medicina/anesnet/agenda/hematología.htm#fisiología
I
II
III
IV
V
VII
VIII
vW
IX
X
XI
XII
El disminuir estos riesgos exige controles periódicos, para ajustar las dosis del
fármaco a unos intervalos de anticoagulación seguros. Existe una fuerte relación
entre el tiempo en que los pacientes están dentro del intervalo y la aparición de un
efecto adverso, por lo que los controles del tratamiento con fármacos antivitamina K
deben cumplir unos requisitos de calidad reconocidos internacionalmente (Navarro y
col., 2001. Navarro y col., y 2007).
El metabolismo y la acción anticoagulante de la warfarina son moderadas por
la acción del producto de muchos genes (Scott y col., 2008). Recientemente, se ha
23
determinado que las variaciones genéticas comunes, o los alelos de algunos
polimorfismos, influyen sobre la respuesta al tratamiento con warfarina en pacientes
con trombosis venosa. Se ha encontrado que ciertos alelos de algunos polimorfismos
presentes en los genes VKORC1 y CYP2C9 estarían asociados a diferencias en la
respuesta al tratamiento. El gen VKORC1 de interés en este trabajo, codifica para la
sub unidad 1 del complejo enzimático Vitamina K epóxido reductasa (VKORC1),
enzima que interviene en la carboxilación de los factores de coagulación
dependientes de vitamina K y es blanco de acción de la warfarina (Li y col., 2004;
Rost y col., 2004). Por su parte, el gen CYP2C9 codifica para la enzima CYP2C9 o
CYP450 2C9, es la principal enzima responsable del metabolismo hepático de los
anticoagulantes orales, es miembro del sistema oxidasa de función mixta citocromo
P450. Participa en el metabolismo de varios grupos importantes de fármacos,
incluyendo varios antiinflamatorios no esteroideos (AINES). Se ha demostrado una
gran variedad polimórfica de este gen asociada con variaciones en los niveles de
actividad enzimática (D’Andrea y col. 2005; Rettie y col., 1992).
Alrededor de un 30% de los pacientes que son tratados con derivados
cumarínicos, portan al menos unas de las variantes en los genes VKORC1 y
CYP2C9, los principales en determinar que tan rápido se metaboliza o que tanto
debe incrementar la dosis de warfarina. Estas modificaciones genéticas influyen en
la terapéutica. Es posible que pequeñas variaciones en las dosis podrían resultar en
complicaciones hemorrágicas o trombóticas (Caldwell y col., 2007).
Aunque aún no este completamente claro, es posible que en ciertos pacientes
con síndromes trombóticos la dosis de warfarina varíe tanto inter como intra
individualmente
y
guarde
una
relación
con
los
posibles
procesos
de
hipercoagulabilidad. Ha sido reportado que los haplotipos en el gen VKORC1
representan el 21% de esta variación, en comparación al 6 % reportado por CYP2C9
(Rieder y col., 2005).
24
III.4.2. Efecto del Componente Genético en la respuesta al tratamiento
con warfarina
III.4.2.1. VKORC1
La identificación del gen VKORC1 (Li y col., 2004; Rost y col., 2004), sirvió
para asociar a este gen con los dos principales desordenes genéticos estudiados,
inherentes a la resistencia de la warfarina. Como se mencionó anteriormente, éste es
el gen que codifica para la sub unidad 1 del complejo enzimático Vitamina K epóxido
reductasa (VKORC1, sitio blanco terapéutico de la warfarina), se ubica en el
cromosoma
16
(16p11.2),
está
conformado
por
11.190
pb,
se
extiende
aproximadamente sobre los 5,1 kpb y posee dos intrones y tres exones. Este gen
codifica para la subunidad de la enzima que es inhibida por el fármaco (warfarina);
una proteína de membrana de 163 aminoácidos, con un peso molecular aproximado
a los 18 kDa (Figura 6) (Rost y col., 2004. Isaza y col., 2009)
Región Codificante
Región No Traducida
Figura 6. Esquema gráfico de la organización del gen VKORC1 (Tomado de: Osman, 2007)
La VKORC1 es una proteína transmembrana que se encuentra en el retículo
endoplásmico, en la cual se han identificado y definido motivos críticos para la
actividad reductasa, tres α hélices transmembrana, los cuales probablemente
involucren el sitio de unión a la warfarina o a la vitamina K (Oldenburg, 2005). En el
modelo propuesto, el primero de estos motivos se extiende desde el aminoácido 10
al 29, el segundo del aminoácido 101 al 123 y el tercero del aminoácido 127 al 149.
Los dos primeros dominios están separados por cuatro lazos en el citoplasma y
contienen tres de los cinco aminoácidos conservados en la proteína: dos cisteínas
25
(en la posición 43 y 51) y una serina (amionoácido en la posición 57). Las otras dos
cisteínas conservadas se encuentras en la región transmembrana en la posición 132
y 135, muy cerca al motivo CIVC (aminoácidos 132 al 135: cisteína, isoleucina,
valina, cisteína) crítico para la actividad reductasa y al motivo TYA (aminoácidos 138
al 140: treonina, tirosina, alanina) donde se considera el sitio de unión a la warfarina
y a la vitamina K. El extremo aminoterminal de la proteína está ubicado en el lumen
del retículo endoplasmático, mientras que el extremo carboxiterminal está localizado
en el citoplasma (Figura 7) (Tie y col., 2005).
Citoplasma
Membrana
Lumen del Retículo Endoplásmico.
Sitio de unión de la Warfarina
Motivo Redox CIVC
Residuos Conservados
Señal de Retención del Retículo Endoplásmico.
Figura 7. Modelo que propone la topología de VKORC1. Interacción de la proteína VKORC1 en el
Retículo Endoplásmico (ER), motivos críticos, conservados y diferentes sitios de unión.
(Tomado de: Tie y col., 2005. Modificado por: Oldenburg, 2005)
III.4.2.2. Polimorfismos en el gen VKORC1
A partir de la identificación del gen VKORC1 por Li y colaboradores en el 2004
y de los hallazgos encontrados por Rost y su equipo en el mismo año, muchas
investigaciones se han centrado en estudiar la relación entre los genotipos de
algunos polimorfismos del gen y la variabilidad de la respuesta a las drogas
antagonistas de la vitamina K. Específicamente para determinar la resistencia que
presentan ciertos individuos al tratamiento con la warfarina.
26
Rost y colaboradores (2004) investigaron la asociación entre las variantes
genéticas de VKORC1 y las diferencias en la respuesta al tratamiento con warfarina,
en donde identificaron siete mutaciones independientes, en dos especies diferentes:
en humanos y en ratas. Las siete variantes reportadas fueron Val29Leu, Val45Ala,
Arg58Gly, Arg98Trp, Leu120Leu, Leu128Arg y Tyr139Cys. A éstas siete mutaciones
pertenecen los alelos menos frecuentes de los polimorfismos Arg98Trp (292C>T) y la
mutación sinónima Leu120Leu (358C>T). Cinco de estas siete variantes fueron
asociadas con un fenotipo resistente al fármaco y estas causaron una actividad
reducida de la enzima VKOR que va desde el 5% para la mutación Leu128Arg
(383T>G), hasta el 96% para la mutación Val29Leu (85G>T). Las tres mutaciones
restantes causantes de reducción de la actividad enzimática fueron: Val45Ala
(134T>C) que origina un 23% de reducción, Arg58Gly (172A>G) el 21% y Tyr139Cys
(416A>G) con un 48%. A su vez, esta actividad disminuida fue asociada con una alta
demanda de vitamina K en estos individuos (Rost y col. 2004).
Un año mas tarde, D’ Andrea y colaboradores (2005), estudiaron la asociación
entre los alelos de varios polimorfismos en VKORC1 y la variabilidad en la dosis
efectiva de warfarina como anticoagulante. Ellos investigaron las mutaciones en el
gen que modifican la respuesta a determinadas dosis de la droga. De los cuatro
polimorfismos identificados (129C>T, 3462C>T, 112G>T y 3556G>A) ninguno de los
alelos tiene efecto sobre la variabilidad inter individual del fármaco. Sin embargo,
fueron identificados dos nuevos polimorfismos, el 1173C>T y el 3730G>A, en el
primer intrón y en la región 3’ no traducida, respectivamente. A los individuos con el
alelo mutado de estos polimorfismos se les han prescrito dosis elevadas de
warfarina. Los sujetos con el genotipo 3730AA necesitaron de 6,9 mg de warfarina,
más que aquellos con el genotipo GG, ubicado alrededor de 5,2 mg o los del
genotipo GA con un 5,3 mg. Por su parte, para el polimorfismo 1173C>T la media
ajustada resultó ser de 6,2 mg para el genotipo CC y de 3,5 mg para el genotipo TT.
La frecuencia acumulada para el alelo C del polimorfismo 1173C>T resultó ser de
55,6%, mientras que para el alelo T fue de 44,4%. Los autores afirmaron que los
27
polimorfismos en el VKORC1 pueden jugar un rol significativo en la modulación del
efecto de la dosis de warfarina como anticoagulante oral, llegando a concluir que la
dosis está estrictamente relacionada a los requerimientos individuales, en unos
sujetos se necesita de dosis bajas y en otros, dosis más elevadas (D’Andrea y col.,
2005).
Bodin y colaboradores (2005) estudiaron la respuesta de resistencia a la
droga, asociada con mutaciones en el gen VKORC1 en un paciente que cursa con un
cuadro de trombosis venosa y embolismo pulmonar, el cual fue sometido a
tratamiento con diferentes anticoagulantes orales. A este paciente le fue suspendido
el tratamiento en dos oportunidades, presentó episodios recurrentes de trombosis,
debido a que mantenía niveles anormales de vitamina K y niveles bajos de epóxido
reductasa. Estos investigadores secuenciaron los tres exones del gen VKORC1 de
este paciente y detectaron una mutación que se encontraba en condición
heterocigota. La mutación fue ubicada en el tercer exón y causaba una sustitución en
el nucleótido 383T>G, lo que se traduce en una sustitución de una leucina a una
arginina en la posición 128 (L128R) de la proteína. Esta mutación se ha ligado
estrechamente como la responsable de la resistencia a la warfarina, al menos en
este caso puntual, estos autores suponen una alteración estructural sobre una de las
enzimas del ciclo de la vitamina K: VKOR (Bodin y col., 2005).
Una de las evidencias que sugieren que algunos alelos de polimorfismos en el
gen VKORC1 están involucrados en la variación al tratamiento, proviene de estudios
clínicos y poblacionales donde se señalan que las personas de origen asiático
requieren en promedio de dosis bajas del anticoagulante, mientras que los
requerimientos en los europeos son intermedios (Yuan y col., 2005). En el trabajo de
Yuan y colaboradores (2005), donde estudiaron la asociación entre el genotipo del
polimorfismo -1639G>A, ubicado en la región promotora el gen VKORC1 y las
diferencias interindividual e inter-étnicas de sensibilidad a la warfarina, encontraron
que el total de pacientes sensibles al fármaco resultaron ser portadores del
polimorfismo en la forma homocigota mutada (genotipo AA) y con dosis media de
28
anticoagulante alrededor de 1,19 mg por día y por el contrario los pacientes con
cierta resistencia resultaron del genotipo GA o GG, los cuales requieren de una dosis
media de 8,04 mg/día y 9,11 mg/día, respectivamente. La frecuencia del genotipo AA
en la población caucásica fue relativamente baja (14,2%), mientras que en la
población China es todo lo contrario, siendo la frecuencia de este genotipo muy alta
ubicándose en el 82,1%. Esta diferencia entre los dos grupos étnicos y la correlación
del genotipo AA del polimorfismo -1639G>A con la sensibilidad a la warfarina entra
en concordancia con lo observado clínicamente por los investigadores, donde la
población asiática requiere menos dosis que los individuos caucásicos. El efecto, por
lo tanto, podría ser causado por una mayor expresión de la proteína VKORC1. La
presencia del alelo mutado A causa un efecto cuya respuesta es de sensibilidad al
individuo que lo posea cuando es enfrentado al tratamiento con anticoagulante (Yuan
y col., 2005).
Por su parte, Rieder y colaboradores en el 2005 realizaron un estudio donde
determinaron la frecuencia de los haplotipos en la población Afro-Americana,
Europea-Americana y Asiática-Americana y verificaron los efectos sobre la
regulación transcripcional del VKORC1 y la dosis de warfarina. Estos autores
establecieron una clasificación particular de los polimorfismos basados en la dosis
efectiva de warfarina recibida por cada paciente. Una vez que secuenciaron las
distintas regiones del gen VKORC1, lograron identificar en las distintas poblaciones
diez polimorfismos comunes, cuya posición nucleotídica de cada uno, con respecto a
la secuencia reportada del gen VKORC1 en la base de datos (número de acceso:
AY587020), es la siguiente: 381 (-4931C>T), 861 (-4451C>A), 2653, 3673
(-1639G>A), 5808 (324T>G), 6009 (698C>T), 6484 (1173C>T), 6853 (1542G>C),
7566 (2255C>T) y 9041 (3730G>A), y determinaron cinco grandes haplotipos (H1,
H2, H7, H8 y H9). De esta manera, agruparon los alelos de los polimorfismos
identificados previamente en dos grupos de haplotipos; los alelos de los
polimorfismos que conforman el haplotipo o grupo A son individuos que reciben bajas
dosis de warfarina (H1 y H2) y los alelos de los polimorfismos que integran el
haplotipo o grupo B son individuos que requieren de dosis altas del anticoagulante
29
(H7, H8 y H9) (Tabla II). Estos polimorfismos alcanzaron más del 5% de frecuencia
en la población estudiada. Los de origen Asiáticos Americanos presentan la más alta
proporción del grupo A (H1 y H2), con una frecuencia elevada del 89%. Los
individuos pertenecientes a este grupo requieren de dosis bajas de warfarina. Por su
parte, los de origen Afro Americano muestran una alta incidencia a pertenecer al
grupo B (H7, H8 y H9) y a necesitar de dosis más elevadas de la droga. Para estos
últimos, en promedio la dosis de mantenimiento varía de 2,7 mg por día para el grupo
A/A, 4,9 mg por día para el grupo A/B y hasta 6,2 mg por día para el grupo B/B.
Estos autores concluyeron que la dosis de mantenimiento con warfarina depende del
nivel de expresión de la enzima VKOR en el hígado de cada individuo. Sin embargo,
de manera general puede dividirse en pacientes que requieren dosis bajas,
intermedias o altas, atendiendo al hecho que el mecanismo molecular que regula la
droga parece ser modulado a nivel transcripcional, como se señaló previamente
(Rieder y col., 2005).
Tabla II. Clasificación de los SNPs por haplotipos
CLASIFICACIÓN DE LOS SNPs POR HAPLOTIPOS
HAPLOTIPO
GRUPO
H1
A
H2
H7
H8
H9
B
POLIMORFISMO
(NUCLEÓTIDO /
SNP)
381 (- 4931C>T)
3673 (-1639G>A)
5808 (324T>G)
6484 (1173C>T)
6853 (1542G>C)
7566 (2255C>T)
861 (- 4451C>T)
6009 (698C>T)
9041 (3730G>A)
REQUERIMIENTOS
DE
ANTICOAGULANTE
(DOSIS)
COMBINACIÓN
DE
HAPLOTIPOS
BAJAS
A/A, A/B, B/B
AA/AB
AA/BB
AB/BB
ALTAS
(Datos tomados de: Rieder y col., 2005).
En el mismo año 2005 Sconce y su grupo analizaron el polimorfismo de
nucleótido simple -1639G>A, mediante PCR-RFLP, ya que éste cambio nucleotídico
elimina un sitio de reconocimiento por la enzima MspI presente en la secuencia.
Investigaron el impacto de esta variante junto con las características de los pacientes
30
bajo tratamiento con warfarina, para tratar de proponer un nuevo régimen de
dosificación. Se estableció la correlación entre edad, sexo, peso y la dosis de
warfarina por asociación a través de programas estadísticos. Encontraron que la
dosis media más alta requerida por pacientes recae sobre el genotipo GG, la cual es
significativamente más elevada que el genotipo GA y AA. Aunque la asociación no
estuvo muy clara, encontraron una correlación entre la dosis de warfarina y el índice
de masa corporal, el peso y la talla.
Por su parte, la asociación antes mencionada también fue resumida en el
trabajo de Gage (2006) quien resalta la correlación que existe entre los niveles de
expresión de la VKORC1 en presencia de los diferentes genotipos del polimorfismo
-1639G>A con la actividad efectiva de la enzima y los requerimientos del fármaco.
Los individuos que presentan el genotipo AA del polimorfismo requieren de dosis
menores de droga, en comparación con los necesitados por otros grupos (Gage,
2006., Gage y Eby, 2006).
Se ha encontrado que en hispanos, específicamente en mexicanos y
peruanos, los requerimientos de warfarina son más elevados a los requeridos por los
caucásicos y asiáticos (reportados hasta ahora como los grupos poblacionales que
requieren niveles más bajos), pero esto no puede ser explicado sólo por el análisis
de ciertas variables alélicas en el gen VKORC1. De esta manera, Marsh y
colaboradores (2006) basaron sus estudios en los hallazgos y en la clasificación de
los polimorfismos previamente establecida y reportada por Rieder y su equipo en el
2005. Determinaron la frecuencia alélicas de ciertos polimorfismos (861 (-4451C>A),
5808 (324T>G), 6853 (1542G>C) y 9041 (3730G>A)) usando pirosecuenciación
(Marsh y col., 2006). Específicamente, para los polimorfismos de VKORC1 del grupo
B, que cursan con la necesidad de altas dosis de warfarina, se ha encontrado que en
pacientes de origen mexicano y peruano, la incidencia es de 57% y 71%,
respectivamente (Marsh y col., 2006).
31
A diferencia de los estudios anteriores, donde se analizó la influencia de las
variaciones genéticas en la respuesta a las dosis inter individuales de la warfarina, un
grupo de investigadores (Wang y col., 2006) estudiaron la asociación de los
haplotipos presentes en el gen VKORC1 y la enfermedad vascular, basándose en
técnicas sencillas como el PCR-RFLP. Estos investigadores hicieron el análisis de
cinco polimorfismos de nucleótido simple: -1639A>G, 1173C>T, 1542C>G, 2255C>T
y 3730G>A. Los resultados obtenidos señalan que hubo una mayor frecuencia del
genotipo TT del polimorfismo 2255C>T (TT), en pacientes con las patologías
vasculares. Estos investigadores asociaron de igual forma, la edad y sexo con la
condición de riesgo de trombosis, mediante un modelo de regresión para comprobar
su efecto sobre la susceptibilidad de los individuos a padecer enfermedad vascular
(accidentes
cerebrovasculares,
cardiopatía
isquémica,
disección
aórtica).
Adicionalmente, investigaron la asociación de estos cinco polimorfismos de VKORC1
con estas patologías. Ellos encontraron que la frecuencia del genotipo heterocigoto
CT del polimorfismo 2255C>T, fue comparable con la del genotipo CC y
significativamente más elevado que el del genotipo TT, lo cual indica un efecto
dominante de riesgo a padecer enfermedad vascular en la población que presente
esa variante genotípica, ya que las frecuencias de los portadores del genotipo (CT +
CC) fueron significativamente más elevadas en pacientes que en controles.
Específicamente en pacientes con trombosis la frecuencia de ambos genotipos CC y
CT fue de 18,4%. Los autores concluyeron que la prevalencia de este polimorfismo
en conjunto con los otros cuatro, conformaría un haplotipo que podría servir como un
marcador genético para el estudio de enfermedad vascular (Wang y col., 2006).
Para explicar la variabilidad genética que puede encontrarse en una
determinada
población,
ciertos
investigadores
han
desarrollado
análisis
retrospectivos para establecer el efecto de los principales haplotipos del gen
VKORC1. Como se mencionó anteriormente, se han agrupado los alelos de algunos
polimorfismos en haplotipos y se han relacionado con la respuesta que tienen los
pacientes frente al tratamiento con anticoagulantes orales. Osman y colaboradores
en el año 2006, clasificaron los tres principales haplotipos de la siguiente manera:
32
VKORC1*2 (6484C>T), VKORC1*3 (9041G>A) y VKORC1*4 (6009C>T) y fueron
estudiados en una población Sueca, a través de un análisis retrospectivo entre casos
y controles, donde encontraron una influencia de los alelos mutados de los
polimorfismos VKORC1, sobre la respuesta a la warfarina entre las primeras cuatro
semanas y los últimos doce meses de tratamiento con la droga (Osman y col., 2006).
El más importante de los tres fue el haplotipo VKORC1*2, porque se ha asociado al
uso de dosis bajas para el mantenimiento del tratamiento con warfarina. La
frecuencia de esta variante en la población de pacientes fue de 35,9 % comparados
con los haplotipos VKORC1*3 y VKORC1*4 que alcanzaron una frecuencia de 39,1%
y 25%, respectivamente. Se considera que la variante VKORC1*2 podría incrementar
el riesgo a sangrado y las variantes VKORC1*3 y *4 estar asociados a los procesos
de hipercoagulabilidad o trombosis. Debido a que los polimorfismos más comunes
relacionados con la variabilidad de la dosis de warfarina han sido encontradas en
regiones no codificantes del gen VKORC1 no es posible establecer una relación
directa del efecto de los polimorfismos sobre la proteína (Osman y col., 2006).
Trabajos realizados por Li y su grupo en el mismo año (2006) asociaron
fuertemente las dosis requeridas de warfarina con el genotipo de los polimorfismos
en VKORC1. De los seis polimorfismos estudiados (497T>G, 698C>T, 1173C>T,
1542G>C, 2255T>C y 3730G>A), encontraron que tres de ellos están fuertemente
relacionados a los requerimientos del anticoagulante y a los valores de INR de cada
individuo. Estos trabajos confirman el interés clínico de correlacionar el metabolismo
y la dosis de la warfarina con los cambios alélicos en algunos polimorfismos
presentes en el gen VKORC1 (Li y col., 2006).
Otro estudio relacionado con la resistencia a la warfarina, es el desarrollado
por D’Ambrosio y colaboradores en el 2007, basados en los trabajos de Rost y Bodin
(Rost y col., 2004. Bodin y col., 2005), donde encontraron una mutación heteróciga
en una paciente de descendencia africana que presentó resistencia a la respuesta de
warfarina y que requería de altas dosis de la droga para cumplir su terapia de
anticoagulación. Mediante amplificación y secuenciación del gen VKORC1 de la
33
paciente, encontraron una transición (G por T) en condición heterocigota en el primer
exón en la posición 5.417 del gen que corresponde a un cambio del aminoácido en
la posición 36 de la proteína de una Asp por una Tyr (D36Y o Asp36Tyr). Esta
mutación ocurre cerca de una cisteína en la posición 43 de la proteína, la cual en un
modelo predictivo separa las dos alfa hélices de transmembrana. En esa posición
puede pronosticarse la formación de un puente disulfuro entre la cisteína 43 y la
cisteína 51 (Fig. 7). El cambio que se está generando es de un aminoácido pequeño
que carga de manera polar a la cadena, por un aminoácido grande y aromático. Los
investigadores señalan que es posible que la sustitución ocasione un cambio
importante en la conformación tridimensional de la proteína.
Por su parte, Loebstein y colaboradores en el 2007 estudiaron la asociación y
la predisposición a la resistencia a la warfarina al encontrarse presente el
polimorfismo Asp36Tyr. En el análisis se incorporaron cuatro diferentes grupos
étnicos de una población judía israelí (de origen europeo, surarábica, norafricana y
del este de África). Dentro de los resultados destaca el hecho que 7 de 15 sujetos
resistentes fueron identificados con la mutación y cursan con requerimientos
significativamente elevados del fármaco (alrededor de 80,9 mg por semana). Los
autores consideran que el alelo mutado de este polimorfismo podría ser un nuevo
marcador cuando debe administrarse altas dosis de warfarina (Loebstein y col.,
2007).
Trabajos mas recientes han tratado de relacionar los polimorfismos genéticos
en VKORC1 con patologías que afectan a gran número de individuos como lo es la
trombosis venosa. Este es el caso del grupo de Lacut (Lacut y col., 2007), donde
evaluaron la asociación entre un polimorfismo de VKORC1 (1173C>T) y el
tromboembolismo venoso. Estos autores encontraron que la frecuencia del alelo
mutado de dicho polimorfismo es significativamente baja en pacientes con trombosis
venosa para la población asiática estudiada (11,2%), aunado al hecho de que el
genotipo mutado en condición homocigota (TT) de este polimorfismo fue asociado
con una disminución del riesgo a padecer de trombosis venosa. Este polimorfismo
34
ubicado en el prime rintrón ha sido asociado con diferentes niveles de expresión
hepática del ARN mensajero de la proteína VKORC1 y una sensibilidad apreciable a
los anticoagulantes orales. Posiblemente el efecto protector que confiere en la
población la condición homocigota TT de éste polimorfismo, puede entenderse al
relacionarlo con la clasificación establecida por Rieder y colaboradores en el 2005
donde el alelo mutado T de la variante 1173C>T del VKORC1, esta incluido en el
grupo A de los haplotipos según la clasificación previamente descrita (Rieder y col.,
2005). Por su parte, las variante CT y CC de este mismo polimorfismo, presentaron
en la población estudiada una frecuencia del 51,9% y 36,9%, respectivamente, lo que
contribuye a aumentar el riesgo y la posibilidad de presentar trombosis venosa en los
individuos que la expresen. Estas otras variantes están asociadas a una baja
sensibilidad a estas drogas anticoagulantes y relacionadas con un elevado riesgo de
enfermedad cardiovascular.
Recientemente, Scott y colaboradores (2008) apoyaron una vez más la
combinación de factores genéticos y ambientales en la amplia variabilidad
terapéutica de la warfarina. Sus resultados son comparados con los trabajos previos
de otros investigadores donde reportan la frecuencia en asiáticos, europeos y
afroamericanos, a través del estudio de mutaciones que predicen la sensibilidad y
resistencia al fármaco. Los principales SNPs presentes en el gen VKORC1
relacionados con la resistencia o sensibilidad a la respuesta de la warfarina
estudiados por estos investigadores se muestran en la Figura 8.
Figura 8. Esquema gráfico del gen VKORC1 y sus principales polimorfismos.
(Tomado de: Scott y col., 2008)
35
La técnica empleada para el análisis de los polimorfismos por Scott y
colaboradores en el 2008 fue un análisis mediante RFLP. En uno de los SNP
estudiados, el 106G>T, ocurre un cambio de una G por una T, que en consecuencia
provoca el cambio de una asparagina por una tirosina en la posición 36 de la
proteína (Asp36Tyr). Entre los resultados se señala que en una de las poblaciones
Judías (Ashkenazi), la frecuencia del alelo mutado de este polimorfismo (106G>T)
fue considerada significativamente elevada con respecto a otra (Sephardi), lo que
indica que esa población podría estar predispuesta a la resistencia al tratamiento con
warfarina. Igualmente encontraron que los alelos mutados de otras variantes, de
interés en este trabajo, 3730G>A y 698C>T, pertenecientes a los haplotipos
VKORC1*3 y VKORC1*4 respectivamente, estaban asociadas a unos requerimientos
normales de la dosis de warfarina. Estos autores relacionaron la presencia de estos
SNPs en ambas poblaciones Judías (mencionadas anteriormente), con una
dosificación normal del warfarina. Estos autores encontraron una alta frecuencia del
genotipo mutado AA de la variante –1639G>A, ubicado en la región promotora del
gen en los individuos de ambas poblaciones, la cual está relacionada con el empleo
de dosis relativamente bajas de la droga y una sensibilidad en la respuesta al
tratamiento.
En el mismo año 2008, en el trabajo realizado por Harrington y colaboradores
también fueron asociadas las sustituciones nucleotídicas en el gen VKORC1 con la
resistencia a la
warfarina. El estudio se realizó en pacientes cuyas dosis de
warfarina fueron elevadas y mayores a 20 mg por día. El 53% del grupo de análisis
resultó poseer sustituciones nucleotídicas en el gen: p.D36Y (106G>T), p.V54L
(134T>C), p.V66M (196G>A), p.L128R (383T>G (Fig. 8) y en el 47% restante los
sujetos resultaron poseer los alelos normales a pesar de necesitar elevadas dosis de
anticoagulante en su tratamiento. En estos sujetos las sustituciones fueron asociadas
al uso de elevados requerimientos del fármaco, pero no con eventos clínicos
adversos. Estos investigadores concluyeron que las asociaciones con la resistencia a
warfarina no causan un defecto discernible en la función reductasa de la proteína
VKORC1. Estas sustituciones no fueron consideradas como polimorfismos, y todas
36
causan importantes sustituciones de aminoácidos conservados dentro de la proteína
VKORC1. Estas sustituciones provocan cambios en la estructura de la proteína y
crean resistencia e impedimentos por las proximidades en los motivos críticos de
interacción (TYA) del fármaco con la proteína (Fig. 7). Probablemente la expresión de
al menos un alelo normal en estos sujetos con sustituciones heterocigotos en
VKORC1 pueden ser suficientes para preservar la actividad reductasa de la proteína
(Harrington y col, 2008).
Las investigaciones del año 2009 fueron orientadas para establecer un mejor
criterio en la administración correcta del fármaco anticoagulante, basada ésta en el
análisis de la data clínica, la intervención de los factores ambientales y genéticos,
con la finalidad de poder predecir una terapéutica más adecuada tanto al momento
inicial del tratamiento como durante la fase de mantenimiento. Al menos tres criterios
claros deben ser considerados y establecerse antes de iniciar una terapia
personalizada: el primero de ellos es establecer cuales genes influyen en la dosis de
warfarina, el segundo, el algoritmo óptimo de dosificación de warfarina durante la
etapa de mantenimiento y por último como calcular la dosis de carga prevista para el
mantenimiento terapéutico del individuo (Wadelius y col., 2009). De manera similar,
el Consorcio Internacional Farmacogenético de Warfarina para febrero del 2009
publicó un trabajo basado en un estudio con una amplia data clínica, genética y
poblacional de 5.700 pacientes en total, dosificados con warfarina, un sub grupo de
5.052 con valores INR y otro sub grupo de 4.043 pacientes que fueron usados para
crear el algoritmo de dosis y estimaron el uso apropiado de estos algoritmos
farmacogenéticos para una terapéutica anticoagulante estable en sujetos que
requieran de 21 mg o menos de warfarina por semana o de 49 mg o más de la droga
por semana.
Así mismo, trabajos cuya propuesta es mejorar esta terapéutica, como el
realizado por Langley y colaboradores en el 2009, se basan en la validación de
pruebas clínicas para evaluar la sensibilidad al uso de warfarina, realizando ensayos
de genotipaje en VKORC1 y en la aplicación de algoritmos de dosificación de
37
warfarina. El uso de métodos automatizados basados en una PCR múltiple, usando
cebadores de extensión alelo específicos, hibridación y detección por fluorescencia y
microscopia confocal, permite combinar la detección de hasta ocho polimorfismos
simultáneamente (-1639G>A, 497T>G, 698C>T, 1173C>T, 1542G>C, 2255C>T,
3462C>T y 3730G>A). Actualmente, es una herramienta tecnológica valiosa que le
da fuerza al componente genético y a la terapéutica debido a que permite orientar las
dosis óptimas aplicables a cada sujeto (Langley y col., 2009).
Ferder y colaboradores en el 2009 realizaron un trabajo, donde se muestra la
relación existente entre el componente genético, los factores clínicos y de laboratorio
sobre la terapéutica anticoagulante en pacientes con problemas de coagulación
(trombo embolismo venoso recurrente). Específicamente los factores genéticos
contribuyen para explicar la dosis terapéutica de un 43% en el día 0 del tratamiento
al 1,4% para el día 21 del mismo. Concluyen sugiriendo que la información genética
podría ser de gran ayuda al iniciar tratamiento con warfarina, evitando posibles
efectos adversos en los pacientes (Ferder y col., 2009).
Recientemente, Limdi y colaboradores en el 2010 incorporaron en su
investigación, además de los factores clínicos y demográficos, el algoritmo de
dosificación de warfarina para el estudio farmacogenético en ciertos polimorfismos
del VKORC1 (-1639G>A, 1173C>T, entre otros) en tres grupos raciales: 1.103
asiáticos, 670 negros y 3.113 blancos provenientes de 11 países como parte del
Consorcio Internacional Farmacogenético de Warfarina. El genotipo de estos dos
polimorfismos explican ampliamente la gran variabilidad en la dosis en los tres
grupos raciales, más para los de raza negra que para los blancos o asiáticos.
Específicamente la diferencia en los porcentajes de la variación en la dosis puede ser
explicada por la frecuencia del Alelo A del SNP -1630G>A o por el alelo T del SNP
1173C>T del gen VKORC1 y al correlacionarlo con las características clínicas de los
pacientes, los requerimientos en la dosis de anticoagulante es mayor en población
negra que en la asiática o caucásica. Aunque se estudiaron seis polimorfismos en el
gen VKORC1 (-1639G>A, 497T>G, 1173C>T, 1542G>C, 2255C>T y 3730G>A) para
38
explicar la variabilidad genética, un solo SNP fue incluido en el algoritmo para la
dosificación, el -1639G>A debido a que aporta igualdad de información predictiva
independientemente del grupo racial estudiado. Igualmente, estos investigadores
señalan que los haplotipos de VKORC1 propuesta 5 años antes, como una
alternativa en la clasificación para agrupar a los polimorfismos y asociarlos a la
respuesta de los pacientes al tratamiento, no explica por sí solos la variabilidad
adicional en la dosis de warfarina en los tres grupos raciales (Limdi y col., 2010).
Es complejo establecer una terapia de mantenimiento con warfarina debido a
las múltiples variantes encontradas en el gen VKORC1 de ciertos pacientes. Esto se
puede observar en detalle cuando se estudian grandes poblaciones. Durante los
últimos años se ha estado considerando realizar e incorporar el análisis genético
como guía para la dosificación de la warfarina. La identificación de los genotipos y las
variantes alélicas en los polimorfismos de los pacientes con patologías específicas
podría reducir los riegos a efectos secundarios y mejorar los tratamientos en
enfermedades complejas como la trombosis venosa.
Tal como se ha señalado previamente, la identificación de factores
ambientales, genéticos y clínicos son fundamentales en el tratamiento de patologías
tan complejas como la trombosis venosa. De estos estudios se destaca que existe
una fuerte asociación entre los alelos variantes de VKORC1 y variaciones en el
requerimiento de la dosis de warfarina, es decir, existen alelos que aumentan la
sensibilidad o la resistencia a la warfarina, determinando el riesgo de complicaciones
hemorrágicas o trombosis. En base a esto, en este trabajo se investigó cinco de los
principales polimorfismos de este gen (Tabla III): -1639G>A ubicado en la región
promotora, 106G>T ubicado en el primer exón, 698C>T en el primer intrón, 2255C>T
ubicado en el segundo intrón y 3730G>A ubicado en la región no traducida 3’ (UTR3’), debido a que se han reportado que estas variantes alélicas (polimorfismos) son
funcionalmente relevantes y están asociados a la enfermedad trombótica venosa y al
tratamiento con anticoagulantes orales.
.
39
Tabla III. Principales SNPs en el gen VKORC1 relacionados con la respuesta a
la Warfarina que fueron investigados en este trabajo.
SNP
Región en el gen
-1639G>A
Región Promotora
106 G>T
Primer Exón
698C>T
Primer Intrón
2255C>T
Segundo Intrón
3730G>A
Región 3’ No
Traducida (UTR 3')
40
IV. JUSTIFICACIÓN
La warfarina es el anticoagulante oral más usado a nivel mundial, incluyendo
nuestro país. Su efectividad esta ampliamente demostrada en pacientes con
problemas de trombosis. Debido a su estrecho rango terapéutico, se uso se ha
asociado con un riesgo significativo tanto de hemorragias como en la generación de
trombosis y requiere un monitoreo frecuente del tratamiento. Por otra parte, las dosis
de mantenimiento y la respuesta a este fármaco, en relación al efecto anticoagulante
y la necesidad de ajustes, es muy variable entre los pacientes. Parte de esta
variabilidad interindividual es debida a características genéticas de los pacientes y
como se mencionó anteriormente, se conoce que algunos polimorfismos determinan
esta variabilidad y que pueden influir en las conductas terapéuticas.
La warfarina actúa sobre el complejo 1 de la enzima epóxido reductasa de la
vitamina K, una proteína transmembrana codificada por el gen VKORC1. Las
alteraciones sobre este gen que afecten la expresión o funcionalidad de la proteína,
pueden ocasionar un aumento en la sensibilidad o una mayor resistencia a la
warfarina. Esto clínicamente concuerda con los requerimientos de dosis menores o
mayores del fármaco. En consecuencia, si se altera esta relación o no se administra
la dosis correcta del tratamiento se producen riesgo de complicaciones hemorrágicas
o trombóticas.
Son numerosos los polimorfismos reportados hasta ahora; algunos de los que
funcionalmente son relevantes: -1639G>A, 106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A,
se han asociado a la enfermedad trombótica venosa y a la respuesta al
anticoagulante. Así, el estudiar la variación alélicas de estos polimorfismos aportaría
datos importantes para el tratamiento de pacientes con terapia anticoagulante.
Dadas las diferencias en las frecuencias de diversos alelos en diferentes
poblaciones, el efecto de genotipos específicos sobre la respuesta a fármacos
puede ser también variable de población a población; por este motivo, las
41
asociaciones farmacogenéticas deben ser validadas para cada grupo o población
humana particular.
Si bien hay abundante bibliografía sobre el efecto de las
variantes de VKORC1 en poblaciones europeas, asiáticas y norteamericanas, no hay
datos sobre las mismas en la población latinoamericana; recién se están empezando
a publicar trabajos en relación con su influencia sobre el tratamiento con warfarina y
de obtenerse resultados consistentes, sería otro de los factores genéticos a tener en
cuenta a la hora de individualizar el tratamiento. En Venezuela no se han realizado
estudios en pacientes con trombosis sometidos a tratamiento con anticoagulantes
orales, por lo tanto, este trabajo representa el primero de este tipo, donde se planteó
determinar la frecuencia de los principales polimorfismos del gen VKORC1 y evaluar
la influencia de éstos, en la variabilidad interindividual de la respuesta a la warfarina
y el riesgo a sufrir trombosis.
42
V. MARCO METODOLÓGICO
V.1.Análisis Clínico Descriptivo
V.1.1.Población
La población de este estudio estuvo compuesta por dos grupos. Uno
correspondiente al grupo control, conformado por individuos aparentemente sanos,
no relacionados entre sí, que no habían sido expuestos a tratamiento con
anticoagulantes y que cumplían con criterios claros de inclusión; no recibir ningún
otro tratamiento medico, alimentación balanceada, activos físicamente, sin
antecedentes familiares de trombosis venosas, entre otros. El segundo grupo de
estudio, estuvo conformado por pacientes que acudieron al Banco Municipal de
Sangre de Caracas y que presentaron antecedentes de trombosis venosa, que
recibieron tratamiento con anticoagulantes y cumplieron con estos criterios claros de
inclusión. Los pacientes que presentaron pruebas sanguíneas fuera de rango de
referencia, en su hematología y pruebas bioquímicas, así como también problemas
renales o hepáticos fueron excluidos del estudio. Así mismo, en ambos grupos no se
hicieron distinciones de sexo y fueron registrados en un programa de estudio y
manifestaron su aceptación a participar, a través de una notificación escrita de
consentimiento (Anexo 1).
V.1.2. Selección del Grupo Pacientes
En este estudio se analizaron 150 individuos no relacionados, provenientes del
Banco Municipal de Sangre de Caracas. La selección de los pacientes se realizó en
base a una evaluación completa, análisis de una historia clínica detallada, examen
físico general, cuyo objetivo fue descartar los casos no relacionados a enfermedad
trombótica. Se excluyeron del análisis los sujetos que mostraron signos u otros
hallazgos asociados con algún otro síndrome. El criterio de inclusión fue el presentar
un
diagnóstico
primario
principalmente
de
trombosis
venosa
profunda.
Adicionalmente, para este grupo de pacientes se le incorporó en su registro un
segundo diagnóstico, como lo pudo ser presentar, trombo embolismo pulmonar,
43
trombosis venosa superficial, entre otras, además de considerar el tipo de respuesta
(normal, sensible o resistente) al ser sometidos al tratamiento con anticoagulantes
orales, específicamente warfarina. Un dato importante que fue solicitado al personal
medico asociado a la investigación fue la dosis específica de consumo por individuo
expresada en miligramos por semana de la droga antes mencionada.
A los pacientes seleccionados se les completó la historia con datos
demográficos, como lo fueron: edad, sexo y procedencia, así como también datos
importantes para determinar el momento de inicio de tratamiento y la progresión. Se
indagó sobre la existencia o no, de otros miembros afectados en la familia con
trombosis venosa.
V.1.3. Selección del Grupo Control
Se seleccionaron al azar 150 donantes voluntarios, aparentemente sanos, sin
antecedentes de enfermedad cardiaca o trombótica, carente de tratamiento alguno.
La única condición requerida fue la ausencia de trastornos de la coagulación y de
cualquier otra patología de origen sistémico en el momento de la toma de la muestra.
Todos fueron sometidos a una anamnesis detallada para evitar sesgos en la
investigación. La obtención de muestras de este grupo control se realizó en donantes
voluntarios que asistieron a distintas lugares de recolección de la muestra,
principalmente en el laboratorio de Genética Molecular Humana B de la Universidad
Simón Bolívar, en el Hospital Miguel Pérez Carreño, Hospital Militar, personal de la
Universidad Central de Venezuela, del Banco Municipal de Sangre de Caracas,
personal del instituto de Investigaciones Científicas y asistentes al Banco de Sangre
de la Planta Productora de Derivados Sanguíneo de Quimbiotec, C.A., en todos los
casos siguiendo la metodología ya señalada.
V.1.4. Toma de Muestras
La toma de muestra para ambos grupos de estudio fue realizada por un
personal calificado y consistió en la extracción de 8 mL de sangre completa
periférica, depositados en tubos para la extracción sanguínea tipo Vacutainer®
44
sellados al vacío de capacidad de 4 mL, los cuales contenían como anticoagulante
EDTA (7,2 mg de K2 EDTA).
V.1.5. Recolección de Data Clínica
La data clínica fue obtenida en el Banco Municipal de Sangre de Caracas
utilizando una planilla de recolección de datos (Anexo 2). Hay datos generales
relevantes en los pacientes como la patología o diagnóstico primario y secundario, la
dosis del tratamiento recibido y la respuesta al fármaco, los cuales también fueron
solicitados y registrados en su base de datos para análisis posterior. Los datos
clínicos en el grupo control fueron obtenidos al momento de la toma de la muestra en
los respectivos bancos de sangre. Toda la información recolectada de cada sujeto,
tanto control como paciente, fue transferida al personal responsable de la
investigación de la Universidad Simón Bolívar bajo estricta confidencialidad.
V.2. Diagnóstico Molecular
V.2.1. Extracción de ADN genómico
Una vez recolectadas las muestras de sangre total con anticoagulante EDTA
(sangre fresca y/o congelada) se procedió a la extracción de ADN genómico de alto
peso molecular, tanto de los pacientes como del grupo control. Las muestras que no
pudieron ser procesadas de inmediato se conservaron almacenadas a –20 oC, hasta
el momento del análisis. Se empleó el protocolo modificado de Lahiri y Nurnberger
(1991).
Las
muestras
congeladas
llevaron
un
procedimiento
previo
de
descongelación, aplicado este paso se procesaron igual a una muestra fresca de
sangre. El procedimiento detallado se ejecutó de la siguiente manera: se
descongelaron las muestras de sangre en hielo, luego se mezcló en un tubo cónico
de 15 mL: 2,5 mL de solución TKM1 (10 mM de Tris/HCl pH 7,6, 10 mM de KCl, 10
mM de MgCl2, 2 mM de EDTA) y 75 μL de Nonidet P40, hasta que el Nonidet se
diluyó completamente. A la mezcla anterior, se le agregó 2,5 mL de sangre con
EDTA (7,5 nM) y se mezcló por inversión. Se centrifugó a 1500 x g durante 15 min,
para eliminar luego el sobrenadante y se lavó nuevamente con 2,5 mL de TKM1,
45
resuspendiendo nuevamente el precipitado. Se centrifugó 10 min, a 1500 x g,
algunas veces fue necesario repetir este procedimiento hasta que el precipitado dejó
de presentar un color rojizo. Posteriormente se resuspendió el precipitado en 448 μL
de solución tampón TKM2 (10 mM de Tris/HCl pH 7,6, 10 mM de KCl, 10 mM de
MgCl2, 2 mM de EDTA, 0,4 M de NaCl), 50 μL de SDS al 10 % (a una concentración
final del 1 %) y 2,5 μL de Proteinasa K (para una concentración final de 100 µg/mL).
El tubo con la resuspensión se incubó a 37 °C durante toda la noche. Posteriormente
se le añadió para precipitar las proteínas 250 μL de NaCl 5,3 M. Se centrifugó a
12000 x g durante 15 min. Se recolectó y dividió el sobrenadante (donde se
encuentra el ADN) en dos tubos Eppendorff (~350 uL) y se agregó 2 volúmenes de
Etanol 100 % (~700 μL) La resuspensión del precipitado se realizó en 500 μL de
Etanol al 70 % a 4 °C y se centrifugó a 12000 x g por 10 min. Eliminándose luego el
sobrenadante. Finalmente, la resuspensión del ADN se hizo en 250 μL de agua
destilada, la cual fue calentada previamente durante 5 minutos a 37 ºC antes de
adicionarla a la muestra de ADN.
V.2.2. Determinación de la concentración de ADN genómico (ADNg)
La cuantificación espectrofotométricamente del ADNg se realizó a partir de la
medición de la absorbancia (densidad óptica) 260 ηm y calculando la relación de
absorbancia 260/280, permitiendo evaluar el grado de pureza de las muestras. De
acuerdo a lo que señala Sambrook y Russell en el 2001, para la molécula de ADN de
doble cadena, una unidad de absorbancia a 260 ηm, equivale a una concentración
de 50 μg/mL. El equipo de cuantificación de ADN utilizado fue un espectrofotómetro
denominado BioPhotometer Eppendorf.
V.2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Una vez extraído el ADN se evaluó la calidad e integridad del mismo en geles
de agarosa al 0,8%. Para preparación previa de las muestras se necesitó de un
tampón de carga 1X (5% glicerol, 0,04% de azul de bromofenol, 0,04% xilen cyanol).
Los geles de agarosa fueron preparados al 0,8% en tampón 1X TAE (Tris Acetato
EDTA) (40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA); se adicionó el agente intercalante Syber
46
Safe a una concentración final de 1X, haciendo una dilución de 1/20.000. Las
corridas electroforéticas se realizaron empleando una cámara de electroforesis
horizontal modelo Gel XL Ultra V-2, a voltaje constante de 80-100 V. La visualización
de las bandas de ADN se hizo por fluorescencia indirecta con la ayuda de un equipo
de digitalización de imágenes denominado FOTODYNE, software: Foto Analyst PC
donde se realizó el registro de la imagen. Este procedimiento se realizó con el
objetivo de visualizar y comprobar la integridad del ADN extraído y para verificar los
tamaños de los productos de amplificación obtenidos por la reacción en cadena de la
polimerasa. En este caso, para todos los productos amplificados, se ajustó la
concentración de agarosa al 1,5%.
V.2.4. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
Los productos amplificados y digeridos con enzimas de restricción, fueron
observados en geles de poliacrilamida al 8%. Los geles de acrilamida-bisacrilamida
conservaron una relación (37,5:1), en condiciones no desnaturalizantes, al 6%, 2%
de entrecruzadores, sin glicerol, 1X de TAE (Tris Acetato EDTA) (40 mM de Tris
acetato, 1 mM de EDTA); 0,1% de TEMED, 0,13% de persulfato de amonio. Las
muestras se cargaron con un tampón de carga al 1X (5% de glicerol, 0,04% de azul
de bromofenol, 0,04% de xilen cyanol). Los geles se corrieron en cámaras de
electroforesis verticales modelo TECAN de BioRad. El tampón de corrida fue una
solución TAE 1X. La corrida electroforética se llevo a cabo en dos fases; una precorrida durante 15 minutos a 150V - 50 mA y una corrida de resolución luego de
cargar las muestras durante 40 minutos bajo las mismas condiciones descritas
previamente.
Después de la corrida electroforética, los geles fueron revelados por tinción
con nitrato de plata, utilizando los reactivos provistos un estuche en comercial de la
marca BioRad. Finalizada la corrida electroforética, se sometió el gel a un proceso de
fijación con una solución fijadora que contiene ácido acético al 10% v/v y metanol
40% v/v, por media hora, en agitación constante, luego al retirar esta solución, se le
adicionó un volumen adecuado de una solución de oxidación (Oxidizer 1X), por 5
47
minutos sometiéndolo a agitación suave y constante, posteriormente se descartó esa
solución y se lavó con abundante agua desionizada por un lapso de 15 minutos, los
cinco primeros minutos en constante recambio de agua para retirar el exceso de
solución oxidante. Se procedió al proceso de tinción agregándole el volumen
necesario de solución de plata (1X) y se dejó en agitación suave por 20 minutos.
Transcurrido el tiempo, se retiró esa solución y se lavó por 30 segundos con agua
desionizada para eliminar el exceso de solución de plata y se procedió a realizar el
revelado con un volumen adecuado de solución reveladora (Developer, manteniendo
una relación 32 gramos para 1 litro de agua ultra pura), con constante recambio,
hasta la visualización de las bandas. Una vez observado el patrón de bandas
esperado, en intensidad y número, tanto en el marcador de peso molecular como en
las muestras analizadas se detuvo la reacción con una solución que contiene ácido
acético al 5% v/v (solución de parada). Para detener la reacción se mantuvo una
relación (1:2), es decir, por cada volumen de solución de revelado se adicionó dos
volúmenes de solución de parada. Posterior a esto, se dejó el gel en agitación
constante por 15 minutos y transcurrido el tiempo se descartó la solución y se colocó
al gel en abundante agua desionizada, para posteriormente digitalizar la imagen
empleando un equipo de digitalización llamado Image Scanner y un programa Magic
Scan de Amersham Biosciences.
V.2.5.Análisis de Polimorfismos de Nucleótidos Simples
Los polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en el gen VKORC1, fueron
estudiados por PCR-RFLP, de las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism o reacción en cadena de la polimerasa polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción. Para ello se utilizaron
cebadores específicos para la amplificación del material genético y enzimas de
restricción para la digestión de los productos amplificados. Las especificaciones para
el análisis de los SNP estudiados y la ubicación en el gen, están resumidos en la
Tabla IV, así como también la secuencia de los cebadores, las concentraciones de
los reactivos y las condiciones que fueron empleadas para la amplificación por PCR,
48
Tabla IV. Resumen de los SNPs en el gen VKORC1 analizados por PCR-RFLP.
SNP
-1639G>A
D36Y
Asp36Tyr
106G>T
698C>T
2255C>T
3730G>A
Nucleótido
3673
5417
6009
7566
9041
Región en
el gen
Región
Promotora
Primer Exón
Primer
Intrón
Segundo
Intrón
UTR 3'
Secuencia de Cebador
F- 5'- GCC AGC AGG AGA GGG AAA TA - 3'
R – 5'- AGT TTG GAC TAC AGG TGC CT -3'
F- 5’- AAC CTG GAG ATA ATG GGC AGC A - 3’
R- 5’- ACA CCG ATC CCA GAC TCC AGA ATA - 3’
F- 5’- GCA TAA TGA CGG AAT ACA GAG GAG GC- 3’
R- 5’- GGT AGA GAC AGG CTT TCA CCA TGT- 3’
F5'- GAA CAG AGA GAG GAA CCA AGG GAG TGG A- 3'
R 5'- TCT GAA CCA TGT GTC AGC CAG GAC C- 3'
F- 5’- TTT GCT TTG GCA TGT GAG CCT TGC - 3’
R- 5’- ACA GTC CAT GGC AGA CAC ATG GTT- 3’
Condición
para la PCR
200-500 ng de
ADN, Buffer PCR
10mM. 1,5mM de
MgCl2. 50mM
KCl. 0,1 mM
dNTP. 0,25uM
de cada cebador.
0,05 U Taq DNA
Polimerasa
100 ng de ADN,
Buffer PCR 1X.
2,5 mM de
MgCl2, 0,2 mM
dNTP. 0,4mM de
cada cebador.
0,05 U Taq DNA
Polimerasa
100 ng de ADN,
Buffer PCR 1X.
2,5 mM de
MgCl2, 0,2 mM
dNTP. 0,4mM de
cada cebador.
0,05 U Taq DNA
Polimerasa
200-500 ng de
ADN, Buffer PCR
10mM. 1,5mM de
MgCl2. 50mM
KCl. 0,1 mM
dNTP. 0,25uM
de cada cebador.
0,05 U Taq DNA
Polimerasa
100 ng de ADN,
Buffer PCR 1X.
3 mM de MgCl2,
0,2 mM dNTP.
0,4mM de cada
cebador. 0,05 U
Taq DNA
Polimerasa
Programación, Temperatura,
Ciclos de Amplificación
Producto de
Amplificación
Enzima de
Restricción
Fragmentos
Digeridos
Desnaturalización: 94 °C por 1
min. Amplificación: 25 ciclos.
Desnaturalización: 94 °C por 1
min. Alineación: 59 °C por 1 min.
Extensión: 72 °C por 1 min.
Extensión Final: 72 °C por 1 min.
290 pb
MspI
124 pb
166 pb
Desnaturalización: 94 °C por 5
min. Amplificación: 35 ciclos.
Desnaturalización: 94 °C por 30
s. Alineación: 62 °C por 30 s.
Extensión: 72 °C por 30 s.
Extensión Final: 72 °C por 5 min.
269 pb
RsaI
118 pb
151 pb
Desnaturalización: 94 °C por 5
min. Amplificación: 35 ciclos.
Desnaturalización: 94 °C por 30
s. Alineación: 62 °C por 30 s.
Extensión: 72 °C por 30
segundos. Extensión Final: 72 °C
por 5 min.
271 pb
BfaI
124 pb
145 pb
Desnaturalización: 95 °C por 10
min. Amplificación: 40 ciclos.
Desnaturalización: 92 °C por 15
s. Alineación: 60 °C por 1 minuto.
Extensión: 72 °C por 30 s.
Extensión Final: 72 °C por 5 min.
198 pb
NcoI
26 pb
172 pb
Desnaturalización: 94 °C por 5
min. Amplificación: 35 ciclos.
Desnaturalización: 94 °C por 30
s. Alineación: 62 °C por 30 s.
Extensión: 72 °C por 30 s.
Extensión Final: 72 °C por 5 min.
282 pb
AciI
102 pb
180 pb
Identificación del SNP, nucleótido (según reporte en la base de datos, número de acceso: AY587020), ubicación en el gen VKORC1, secuencia
de cebadores, condiciones para la PCR, tamaño de fragmento amplificado, enzima de restricción y tamaño de los fragmentos digeridos
49
las enzimas de restricción y el tamaño de los fragmentos obtenidos posterior a la
digestión.
En primer lugar, las reacciones de amplificación para el análisis de todos los
polimorfismos fueron realizadas para un volumen final de 25 μL. Los equipos usados
para la amplificación fueron dos termocicladores, uno modelo 2720 Thermal Cycler
de Applied Biosystems y otro denominado MasterCycler Gradient de Eppendorf. Sin
ninguna distinción entre ellos para su uso.
En segundo lugar, las condiciones para el análisis por restricción se basaron
en la digestión enzimática del producto de amplificación, a fin de determinar el
genotipo de los polimorfismos estudiados en la población analizada. Por ejemplo, si
dos productos de amplificación presentan una variación en la secuencia nucleotídica
en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción, se generarán distintos
patrones de fragmentos. Basados en este principio se procedió al análisis de
muestras de los grupos pacientes y controles.
Para la reacción en sí, se siguieron las recomendaciones de las casas
comerciales Promega y BioLabs, suplidores de las enzimas de restricción,
manteniendo las relaciones de producto de amplificación y concentración de enzimas
sugeridos en la literatura, las cuales varían dependiendo de las condiciones óptimas
de la enzima. El protocolo de digestión varió dependiendo del polimorfismo, pero en
todos los casos el volumen final de reacción fue de 10 μL, con un tiempo mínimo de
incubación de 4 horas y un máximo de 16 horas, a 37 °C. Las incubaciones fueron
realizadas empleando cámaras y bloques de calentamiento de los modelos
Thermomixer Confort de Eppendorf y Analogical Heatblock.
Tal como se señaló previamente, el producto de esta digestión fue verificada
mediante la visualización de un patrón de bandas posterior a una electroforesis en
geles de poliacrilamida. Un resumen con las condiciones específicas del análisis de
restricción puede observarse a continuación en la Tabla V.
50
Tabla V. Identificación de las enzimas de restricción empleadas en el análisis
de SNPs por PCR-RFLP.
SNP
-1639G>A
106G>T
698C>T
2255C>T
3730G>A
Nucleótido
3673
5418
6009
7566
9041
Enzima de
Restricción
Msp I
RsaI
BfaI
NcoI
AciI
Sitio de
Restricción
Condiciones
para la Reacción
Producto de
Amplificación
Fragmentos
Digeridos
Observación
5'-C^C G G-3'
3'-G G C^C-5'
Buffer 1X, BSA
1ug/uL, Enz.
Restricción: 1U,
Producto de PCR:
5 uL, Agua c.s.p.
Volumen Final: 10
uL, 37 °C. 16 Hrs.
290 pb
124 pb
166 pb
El cambio nucleotídico
elimina el sitio de
reconocimiento para el
corte enzimático
5'-G T^A C-3'
3'-C A^T G-5'
Buffer 1X, BSA
1ug/uL, Enz.
Restricción: 1U,
Producto de PCR:
5 uL, Agua c.s.p.
Volumen Final: 10
uL, 37 °C. 16 Hrs.
269 pb
118 pb
151 pb
El cambio nucleotídico
crea el sitio de
reconocimiento para el
corte enzimático
5'-C^T A G-3'
3'-G A T^C-5'
Buffer 1X, Enz.
Restricción: 1U.
Producto de PCR
5 uL, Agua c.s.p.
10 uL volumen
Final. 37 °C.
16 Hrs.
271 pb
126 pb
145 pb
El cambio nucleotídico
crea el sitio de
reconocimiento para el
corte enzimático
5'-C^C A T G G-3'
3'-G G T A C^C-5'
Buffer 1X, BSA
1ug/uL, Enz.
Restricción: 1U,
Producto de PCR:
5 uL, Agua c.s.p.
Volumen Final: 10
uL, 37 °C. 16 Hrs.
198 pb
26 pb
172 pb
El cambio nucleotídico
crea el sitio de
reconocimiento para el
corte enzimático
5'-C^C G C-3'
3'-G G C^G-5'
Buffer 1X, Enz.
Restricción:1U,
Producto de PCR:
5 uL, Agua c.s.p.
10 uL volumen
Final. 37 °C.
16 Hrs.
282 pb
102 pb
180 pb
El cambio nucleotídico
elimina el sitio de
reconocimiento para el
corte enzimático
Se presentan el sitio de reconocimiento enzimático, el protocolo de digestión y las condiciones del
análisis. Se indica el tamaño de los fragmentos esperados de producirse o no el corte enzimático,
según el cambio nucleotídico
El protocolo utilizado para el análisis del SNP -1639G>A es una modificación
del presentado por Sconce y colaboradores en el año 2005. Para el análisis de los
polimorfismos 106G>T, 698C>T y 3730G>A, la metodología empleada se basó en
una modificación del protocolo propuesto por Scott y colaboradores en el 2008. El
diseño de análisis del polimorfismo 2255C>T fue basado en los reportes de Wang y
colaboradores en el año 2005.
51
V.2.6. Secuenciación
Para verificar los polimorfismos encontrados en la población estudiada en esta
investigación, se realizó una selección al azar de algunas muestras representativas
de esta población, a las cuales se les realizó secuenciación automatizada. El material
a secuenciar fue enviado al Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos
(CeSAAN) del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), conocido
actualmente como la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses (U.E.G.F. – IVIC),
donde fueron analizados en un secuenciador modelo ABI 3130XL Genetic Analyser
de Applied Biosystems, previo proceso de purificación, el cual fue realizado utilizando
un estuche comercial de la casa Axygen siguiendo los procedimientos descritos en el
protocolo para la purificación de productos de PCR.
El procesamiento para la secuenciación de las muestras consistió en una
reacción de amplificación (PCR) empleando un estuche comercial denominado
BigDye® Terminator v3.1 de Applied Biosystems, bajo las siguientes condiciones: un
ciclo de 2 minutos a 98 °C, seguido por 25 ciclos de tres temperaturas; 96 °C por 30
segundos, 58 °C por 20 segundos y 60 °C por 4 minutos, para finalizar un ciclo a 4°C
hasta el momento de retirar el material amplificado.
El producto de esta reacción fue purificado con perlas magnéticas
(MagneSil®GREEN de Promega) y luego fueron analizadas en el secuenciador
automático.
El
resultado
de
la
secuenciación
fue
expresado
como
un
electroferograma.
V.2.7. Análisis de secuencias
Las secuencias obtenidas fueron revisadas por medio del programa Chromas
(Chromas Lite) y comparadas con las secuencias conocidas disponibles en la base
de datos del GenBank® por medio del servicio BLAST (Basic Local Aligment Search
Tool), la cual se hizo vía Internet por la dirección http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST/nph-blast. Posteriormente el análisis de alineamiento e identificación de
cambios en la secuencias se realizó por medio varios programas informáticos como
BioEdit (BioEdit Sequence Aligment Editor), Texpad, Dnasp5 (DNA Sequence
52
polymorphism) y a través del servidor de análisis de secuencias disponible en
http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/ seleccionando como herramienta de análisis de
múltiples secuencias el uso de ClustalW2.
V.3. Análisis Estadístico
El análisis estadístico se realizó una vez definidas todas las variables a través
de un Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS, versión 17), aplicable a
investigación clínica en salud. Se determinó las frecuencias genotípicas y alélicas
para los polimorfismos tanto en el grupo de pacientes como en el grupo control. Para
cada polimorfismo se diseñó un análisis de regresión múltiple que involucró las
variables cuantitativas como edad, sexo, dosis de tratamiento recibido, entre otros,
las cuales fueron comparadas empleando como estadístico ANOVA.
Las herramientas estadísticas han derivado en el uso de un χ2 (chi cuadrado),
con un nivel de significancia con un p< 0.05 para el análisis de frecuencias alélicas y
genotípicas al considerarlas como variables cualitativas en el grupo de pacientes. Se
aplicó la prueba de Hardy-Weinberg (H-W), para el equilibrio entre los polimorfismos
como análisis descriptivo. El principio de equilibrio de Hardy-Weinberg determina qué
frecuencias deben observarse en la población para cada genotipo en función de las
frecuencias de los alelos (Iniesta y col., 2005). Las frecuencias esperadas fueron
comparadas con las observadas utilizando la prueba de χ2 (HW)= Σ (O-E)2/E. con un
grado de libertad, siendo O el valor de las frecuencias alélicas observadas y E, el
valor de las frecuencias alélicas esperadas.
Para evaluar la asociación de un polimorfismo con la enfermedad se construyó
tablas de contingencias correspondientes para cada SNP y se contrastó la hipótesis
de asociación usando igualmente un χ2. Para cuantificar la magnitud de la asociación
se calculó las Odds Ratios (OR) de cada genotipo respecto al grupo de referencia.
53
VI. RESULTADOS
VI.1. Análisis Clínico Descriptivo de la Población
Se estudió una población de 300 individuos, en su mayoría venezolanos,
residenciados en el país, sin distinción de procedencia u origen. En un alto
porcentaje (96,9%) mayores de edad, sólo el 3,1% tenían edades menores o iguales
a los 17 años. Esta población estuvo conformada por dos grupos, uno de control y
uno de pacientes. Ambas muestras de la población fueron incluidas en un sistema de
registro, donde quedaron bajo confidencialidad sus datos personales. Se asignaron
códigos de ingreso, según cada grupo y se registraron datos comunes y estándar
para la población, como sexo, edad, presentación o no de ciertas enfermedades
como hipertensión arterial y diabetes mellitus, tendencia a presentar hábitos
tabáquicos, el uso de anticonceptivos orales y el consumo de ácido acetil salicílico,
entre otros.
El promedio de edad de la población fue de 40,11 años, con un intervalo de
de 4 a 81 años. La distribución por sexo en la población fue de 202 de sexo femenino
y 98 individuos de sexo masculino.
El promedio de edad del grupo de pacientes fue de 40,34 años, con una
desviación estándar típica de ± 14,88 años y un rango de 75, siendo el mínimo de 4
años y el máximo de 79 años. La distribución por sexo en el grupo de pacientes fue
de 121 individuos de sexo femenino y 29 de sexo masculino, representando un
80,7% y 19,3%, respectivamente.
Los resultados del grupo pacientes pueden apreciarse de manera grafica en el
resumen de los datos mostrado en las figuras 9 y 10, mostrado a través de
histogramas que reflejan el grupo de edades y las principales patologías presentadas
en este grupo.
54
A
B
Figura 9. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B) en el grupo de
Pacientes. La frecuencia expresada como número de individuos en el eje Y, las edades expresadas
en años en el eje X. Fuente: Datos propios de la investigación.
Las tres principales patologías presentadas por el grupo de pacientes fueron:
trombosis venosa profunda (82,7%), trombo embolismo pulmonar (10%) y trombosis
de senos venosos (2%). El resto del porcentaje está representado por patologías
igualmente trombóticas, pero con menos frecuencia, tal como se observa en la figura
10. Se encontró sólo un caso sin diagnóstico primario. Como diagnóstico secundario
este grupo presentó la trombosis venosa profunda en un 21,3%, trombo embolismo
pulmonar con 10,7% y el síndrome anti fosfolipídico en un 4%. Alrededor del 59,3%
sólo fueron diagnosticados con la patología secundaria.
En el caso del grupo control, estuvo conformado por individuos de ambos
sexos: 81 individuos de sexo femenino y 69 de sexo masculino, representando un
54% y 46%, respectivamente. El promedio de edad del grupo control fue de 39,86
años, con una desviación estándar típica de ± 14,48 años y un rango de 69, siendo
el mínimo de 12 años y el máximo de 81 años (Figura 11).
El resto de las características de la población de índole demográfico fueron
estudiadas y el resultado de los datos obtenidos se presenta en la Tabla VI.
55
SD
Patologías
Figura 10. Grafico de patologías presentadas por el grupo de pacientes. En el eje X las
patologías: SD: Sin Diagnóstico primario, TEP: Trombo Embolismo Pulmonar, TSV: Trombosis de
Senos Venosos, TSVC: Trombosis Senos Venosos Cerebrales, TVCR: Trombosis de la Vena Central
de la Retina, TVP: Trombosis Venosa Profunda, TVR: Trombosis Venosa de Retina, TVS: Trombosis
Venosa Superficial, TVVR: Trombosis Venosa de Vasos de la Retina. En el eje Y las frecuencias de
los individuos del grupo pacientes. Fuente: Datos propios de la investigación.
A
B
Figura 11. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B) en el grupo
Control. La frecuencia expresada como número de individuos en el eje Y, las edades expresadas en
años en el eje X. Fuente: Datos propios de la investigación.
56
Tabla VI. Característica de la población.
CARACTERÍSTICA DE LA POBLACIÓN
Variable
Grupo Control
Grupo Pacientes
Total N=150
Total N=150
Edad, Años (Rango)
39,86
Femenino
40,31
Masculino
39,37
Sexo, n (%)
Femenino
81
Masculino
69
Hábitos Tabáquicos, n (%)
Si
24
No
78
Sin Dato
48
Uso de Ácido Acetil
Salicílico, n (%)
Si
11
No
118
Sin Dato
21
Uso de anticonceptivos
Orales, n (%)
Si
12
No
36
No Aplica
69
Sin Dato
33
Diabetes Mellitus, n (%)
Si
3
No
119
Sin Dato
28
Hipertensión Arterial, n (%)
Si
29
No
107
Sin Dato
14
Razón Primaria para la Anticoagulación,
n (%)
(12-81)
(12-81)
(18-76)
40,34
41,11
37,17
(12-79)
(9-79)
(4-66)
(54,0)
(46,0)
121
29
(80,7)
(19,3)
(16,0)
(52,0)
(32,0)
29
119
2
(19,3)
(79,4)
(1,3)
(7,3)
(78,7)
(14,0)
2
146
2
(1,3)
(97,3)
(1,3)
(8,0)
(24,0)
(46,0)
(22,0)
31
87
29
3
(20,7)
(58,0)
(19,3)
(2,0)
(2,0)
(79,3)
(18,7)
4
144
2
(2,7)
(96,0)
(1,3)
(19,3)
(71,3)
(9,3)
19
129
2
(12,7)
(86,0)
(1,3)
124
15
3
8
(82,7)
(10,0)
(2,0)
(5,3)
5,084
(0,5-15)
6
133
11
(4,0)
(88,7)
(7,3)
TVP
TEP
TSV
Otro
Dosis de Warfarina, mg/día. Dosis Diaria.
Promedio por semana (Rango)
Respuesta al tratamiento, n (%)
Sensible
Normal
Sin Dato
La frecuencia es expresada como número de individuos (n) y su porcentaje (%) para cada grupo de
estudio. TVP: Trombosis Venosa Profunda, TEP: Trombo Embolismo Pulmonar, TSV: Trombosis de
Senos Venosos.
57
VI.2. Diagnóstico Molecular
VI.2.1. Aislamiento de ADN genómico (ADNg)
Una vez realizada la selección de los pacientes y controles y obtenida la
muestra de sangre venosa periférica, se procedió al aislamiento del ADNg. El
material genético extraído (ADNg), tanto de los pacientes como de los controles, se
evaluó en geles de agarosa al 0,8%. En la figura 12 se muestra el registro fotográfico
de una corrida electroforética de algunas de las muestras analizadas y se observa
una buena calidad (sin señal de degradación), con algunas variaciones en la
concentración de las muestras. Un patrón similar se observó en todas las muestras
analizadas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Figura 12. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 0,8% de los
ADN genómicos (ADNg) aislados. En el carril 1 marcador de peso molecular de 1 Kb. Carriles 2 al 7
ADN de algunos pacientes y carriles del 8 al 13 ADN de algunos controles. Se cargaron 5 μL de cada
muestra.
Una vez verificada la integridad de todos los ADNg de las muestras del grupo
de pacientes y del grupo control, se procedió al análisis de los polimorfismos de
nucleótidos simples en el gen VKORC1.
58
VI.2.2. Análisis de los Polimorfismos de Nucleótidos Simples en el gen
VKORC1
Para el análisis de los polimorfismos se utilizó principalmente la técnica de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa - Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de
Restricción (PCR-RFLP). Esta técnica se llevó a cabo en dos etapas, en primer lugar
la obtención del fragmento de interés en cada caso mediante PCR y en segundo
lugar la reacción de digestión del fragmento obtenido mediante el empleo de enzimas
de restricción específicas para el análisis de cada SNP. En este trabajo se analizaron
5 polimorfismos, -1639G>A, 106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A.
VI.2.2.1 Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple -1639G>A en el
gen VKORC1
El resultado de la amplificación del fragmento contentivo del polimorfismo
-1639G>A, presente en la región promotora del gen VKORC1, de algunas de las
muestras analizadas se muestra en la figura 13. Se puede observar en dicha figura
que se obtuvo una banda única de 290 pb. Este resultado se repitió en todas las
muestras analizadas para el polimorfismo -1639G>A, tanto en controles como en
pacientes.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 pb
300 pb
Figura 13. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los
productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple -1639G>A presente en el gen
VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. En el carril 1, marcador de peso molecular
de 100 pb, carriles 2 al 11 producto de PCR del SNP -1639G>A. Carril 12, control negativo de la
reacción en cadena de la polimerasa.
59
Posterior a la reacción de PCR se procedió a la digestión de cada uno de los
productos con la enzima de restricción MspI, la cual reconoce la secuencia de 4
nucleótidos señalada en la tabla V de la metodología. En individuos con el genotipo
homocigoto normal GG se generan dos fragmentos, uno de 124 pb y otro de 166 pb.
El cambio nucleotídico del alelo normal G por el alelo mutado A, elimina el sitio de
reconocimiento de la enzima, no produciendo la reacción de digestión en el
fragmento, por lo que se obtiene una sola banda de 290 pb característico del
genotipo homocigoto mutado AA y en aquellos individuos que presentaron el
genotipo heterocigoto mutado GA se generaron tres fragmentos; uno de menor
tamaño de 124 pb, otro de 166 pb y el fragmento mayor de 290 pb.
En la figura 14 A y B, se muestra un registro fotográfico de una corrida
electroforética de los productos de PCR digeridos con MspI en un gel de
poliacrilamida al 8 %, donde se observan patrones de bandas polimórficos de
algunas de las muestras de los pacientes analizados.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
290 pb
166 pb
124 pb
A
B
Figura 14. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8%
de productos de digestión analizados por RFLP, SNP -1639G>A presentes en el gen VKORC1
de algunos pacientes con trombosis venosa. (A) En el carril 1, marcador de peso molecular de 50
pb, del carril 2 al 9 productos de amplificación (PCR) del SNP -1639G>A digeridos con la enzima
MspI. Carril 10, producto de PCR sin digerir (control) (B) En el carril 1, marcador de peso molecular de
50 pb, del carril 2 al 6 productos de amplificación (PCR) del SNP -1639G>A digeridos con la enzima
MspI. Carril 7, producto de PCR sin digerir (control)
En los carriles 2, 4, 5 y 7 de la figura 14A y en los carriles 2 y 6 de la figura
14B se identificaron patrones de corrida característicos del genotipo heterocigoto
mutado para el SNP -1639G>A. En los carriles 3, 6, 8 y 9 de la figura 14A y en los
carriles 3 y 5 de la figura 14B se observan los patrones característicos del genotipo
60
homocigoto normal (GG). En aquellas muestras de individuos con el genotipo
homocigoto mutado (AA) se observó una única banda de 290 pb, como el mostrado
en el carril 4 de la figura 14B.
Del total de la población estudiada (300 individuos), 102 de ellos fueron
identificados con el genotipo homocigoto normal GG, 153 poseían el genotipo
heterocigoto mutado GA y 45 sujetos portadores del genotipo homocigoto mutado
AA. Específicamente para el grupo control los sujetos homocigotos normales GG
resultaron ser 51 de un total de 150 individuos, para el genotipo heterocigoto GA 84 y
15 del genotipo homocigoto mutado AA. Por su parte, la distribución de los genotipos
en el grupo de pacientes fue el siguiente de un total de 150 individuos: 51
homocigotos normales GG, 69 poseían el genotipo heterocigoto mutado GA y 30
sujetos portadores del genotipo homocigoto mutado AA.
Con los datos obtenidos del análisis mediante PCR-RFLP se calcularon las
frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo -1639G>A en el gen VKORC1 en
ambos grupos (grupo control y pacientes) (Tabla VII). Las frecuencia del Alelo G
para el SNP -1639G>A fue mayor en el grupo control (0,620) que la obtenida en el
grupo de pacientes (0,570). Por su parte, el alelo A de este polimorfismo tiene menor
frecuencia encontrándose en 0,380 y 0,430 para el grupo control y pacientes,
respectivamente.
Tabla VII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo -1639G>A.
SNP -1639G>A
Grupo Control
Grupo Pacientes
Número de
Individuos, (%)
Frecuencia
IC (95%)
GG
51 (34)
0,340
0,333 - 0,346
GA
84 (56)
0,560
0,553 - 0,566
AA
15 (10)
0,100
0,096 - 0,104
Alelo G
186 (62)
0,620
0,614 - 0,626
Alelo A
114 (38)
0,380
0,374 - 0,386
Total
150
300
Número de
Frecuencia
Individuos, (%)
IC (95%)
51 (34)
0,340
0,333 - 0,346
69 (46)
0,460
0,453 - 0,467
30 (20)
0,200
0,194 - 0,205
171 (57)
0,570
0,564 - 0,576
129 (43)
0,430
0,424 - 0,436
Resultados del análisis estadístico: OR=1 (IC 95%= 0,62–1,610) P= 0,548
Total
150
300
61
Al establecer comparaciones entre las frecuencias genotípicas de ambos
grupos no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los genotipos
GG y GA en relación con los AA (OR= 1, IC (95%)= 0,62-1,610 y p= 0,548). Es
igualmente probable encontrar el alelo de riesgo A, tanto en la población control
como en la población de pacientes.
VI.2.2.2 Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 106G>T en el gen
VKORC1
Para el análisis del polimorfismo 106G>T presente en el primer exón del gen
VKORC1 se procedió inicialmente a la amplificación del fragmento contentivo de
dicho polimorfismo mediante la PCR. En la figura 15 se muestra el registro
fotográfico de la corrida electroforética de los fragmentos obtenidos en algunas de las
muestras analizadas y se puede apreciar que presentaron un tamaño de 269 pb,
correspondiente al esperado. Este mismo patrón de banda se obtuvo en todas las
muestras analizadas para el polimorfismo 106G>T.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 pb
300 pb
Figura 15. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los
productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 106G>T presente en el gen
VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. En el carril 1, marcador de peso molecular
de 100 pb, carriles 2 al 11, productos de PCR del SNP 106G>T. Carril 12, control negativo de la
reacción en cadena de la polimerasa.
Para el análisis mediante RFLP del polimorfismo 106G>T, se procedió a la
digestión con la enzima de restricción RsaI, cuya secuencia de reconocimiento se
indica en la tabla V de la metodología. La mutación genera el sitio de reconocimiento
62
para la enzima, de tal manera que los fragmentos contentivos del polimorfismo en
presencia del genotipo homocigoto normal (GG) no presentaran ningún sitio y se
observara un fragmento de 269 pb. De presentarse la mutación en condición
homocigota (TT) se esperaría obtener dos fragmentos producto de la digestión, uno
de 118 pb y otro de 151 pb. Por su parte, el genotipo heterocigoto (GT) presentaría
un perfil de digestión identificados por tres fragmentos, uno de 269 pb, uno
intermedio de 151 pb y el menor de ellos de 118 pb.
En la población estudiada, no se presentó ningún caso de genotipos
homocigotos mutados (TT), ni de heterocigotos (GT). En la figura 16 puede
observarse los resultados obtenidos en algunas de las muestras analizadas de
controles y pacientes que corresponden al genotipo homocigoto normal (GG), con la
presencia de un único fragmento.
1
A
2
3
4
5
1
6
2
3
4
5
6
7
8
B
300 pb
269 pb
Figura 16. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8%
de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa. (A) En el carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb, del carril 2
al 5, productos de amplificación (PCR) del SNP 106G>T digeridos con la enzima RsaI. Carril 6
producto de PCR sin digerir (control). (B) En el carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb, del
carril 2 al 7, productos de amplificación (PCR) del SNP 106G>T digeridos con la enzima RsaI y
purificados para secuenciar. Carril 8, producto de PCR sin digerir (control)
Debido a que no se observó digestión por parte de la enzima RsaI en las
muestras analizadas, se procedió a realizar una prueba control para determinar si la
enzima estaba activa. Para ello se empleó el ADN de un plásmido purificado (pUC19)
que posee diferentes sitios de reconocimiento para esta enzima de restricción.
63
Luego de someter el ADN plasmídico pUC19 a la acción de la enzima de
restricción RsaI se realizó en una corrida electroforética en un gel de poliacrilamida y
se obtuvo el patrón de bandas esperado de acuerdo a los sitios de reconocimiento
presentes en el plásmido (168, 409 y 2178) generando fragmentos de 241, 676 y
1769 pb (Figura 17). De esta manera se comprobó que la ausencia de cortes en los
fragmentos de las muestras analizadas se debió a que sólo habían individuos
homocigotos normales (GG) para el polimorfismo 106G>T en el gen VKORC1 en la
población analizada.
1
2
3
4
5
6
7
500 pb
300 pb
269 pb
Figura 17. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 8% de
productos de digestión con la enzima RsaI. En el carril 1 marcador de peso molecular de 100 pb.
Carril 2, pUC19 sin digerir. Carriles 3 y 4, pUC19 digerido con la enzima RsaI. Carriles 5 y 6, producto
de amplificación (PCR) del SNP 106G>T digerido con la enzima RsaI. Carril 7, marcador de peso
molecular de 50 pb
Según los resultados obtenidos, el 100% en ambos grupos (pacientes y
controles) de la población analizada presentó el genotipo homocigoto normal (GG)
para el polimorfismo 106G>T.
VI.2.2.3 Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 698C>T en el gen
VKORC1
En lo que respecta al análisis del polimorfismo 698C>T presente en el primer
intrón del gen VKORC1, se procedió a la amplificación por PCR del fragmento
contentivo de dicho polimorfismo en todas las muestras (controles y pacientes). En la
figura 18 se muestra el registro fotográfico de una corrida electroforética de algunas
64
de las muestras analizadas, donde se observa la presencia de fragmentos con el
tamaño esperado (271 pb). Resultados similares fueron obtenidos para todas las
muestras analizadas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 pb
300 pb
Figura 18. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los
productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 698C>T presente en el gen
VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. En el carril 1, marcador de peso molecular
de 50 pb, carriles 2 al 11, productos de PCR del SNP 698C>T. Carril 12, control negativo de la
reacción en cadena de la polimerasa.
Una vez obtenidos los fragmentos contentivos del polimorfismo 698C>T, se
procedió al análisis del genotipo mediante RFLP, utilizando la enzima de restricción
BfaI, cuya secuencia de reconocimiento se indica en la tabla V de la metodología. La
digestión con esta enzima de restricción produce dos fragmentos de 124 pb y 145 pb
cuando el genotipo del individuo es homocigoto mutado (TT), debido a que la
presencia de la base mutada T crea el sitio de reconocimiento enzimático. De esta
manera, los fragmentos provenientes de muestras de individuos con el genotipo
homocigoto normal (CC) presentarán una sola banda después de ser sometidos a la
acción de la enzima (271 pb) y tres en presencia del genotipo heterocigoto (CT) (271,
145 y 124 pb). En el registro fotográfico del gel de poliacrilamida presentado en la
figura 19 se muestran los resultados obtenidos en algunas de las muestras
analizadas, y se observa en los carriles 2, 3 y 8 el patrón de tres bandas
correspondiente al genotipo heterocigoto y en los carriles 4 al 7 el de una banda
correspondiente al homocigoto normal. No se obtuvo ningún resultado homocigoto
mutado en la población investigada.
65
Del total de muestras estudiadas (300) para el polimorfismo 698C>T en la
población, 254 individuos fueron identificados con el genotipo homocigoto normal CC
y 46 de ellos con el genotipo heterocigoto mutado CT. Las frecuencias genotípicas y
alélicas específica para cada grupo de estudio puede detallarse en la tabla VIII. Se
obtuvo que la mayor frecuencia genotípica fue para el genotipo CC tanto en el grupo
control como en el grupo de pacientes (0,860 y 0,833, respectivamente), en
comparación con el genotipo CT en los mismos grupos (0,140 y 0,167) sin embargo,
esta diferencia no fue es estadísticamente significativa al obtenerse un OR = 1,228
(IC 95%; 0,658-2,212).
1
2
3
4
5
6
7
8
300 pb
271 pb
Figura 19. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 8% de
productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa. En el carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb. Carriles 2 al 8
productos de amplificación (PCR) del SNP 698C>T digeridos con la enzima BfaI.
En cuanto a las frecuencias alélicas para el polimorfismo 698C>T, se obtuvo
una frecuencia de 0,930 y
0,916 para el alelo C en los grupos de controles y
pacientes respectivamente y 0,070 y 0,084 para el alelo T para los mismos grupos,
respectivamente. El OR obtenido (OR =1,228; IC 95%, 0,658 – 2,212) indica que es
más probable encontrar el alelo de riesgo (T), en el grupo de pacientes que en el
grupo control, a pesar de no ser estadísticamente significativo.
66
Tabla VIII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 698C>T.
SNP 698C>T
Grupo Control
Número de
Frecuencia
IC (95%)
Total
Individuos, (%)
129 (86)
0,860
0,855 - 0,865
CC
Grupo Pacientes
Número de
Frecuencia
IC (95%)
Total
Individuos, (%)
125 (83,3)
0,833
0,828 - 0,838
25 (16,7)
0,167
0,162 - 0,172 150
150
CT
21 (14)
0,140
0,135 - 0,145
TT
0
0,000
-
0
0,000
Alelo C
279 (93)
0,930
0,927 - 0,933
275 (91,6)
0,916
0,912 - 0,920
Alelo T
21 (7)
0,070
0,067 - 0,073
25 (8,4)
0,084
0,080 - 0,088
300
Resultados del análisis estadístico: OR=1,228 (IC 95%= 0,658 – 2,212) χ2 = 0,231 (1 g.l= 3,84) P= 0,6307
VI.2.2.4 Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 2255C>T en el
gen VKORC1
En cuanto al análisis del polimorfismo 2255C>T, presente en el segundo intrón
del gen VKORC1, el tamaño del producto de amplificación obtenido por PCR fue el
esperado (198 pb), tal como se observa en la figura 20 donde se señala el registro
fotográfico de la corrida electroforética de algunas de las muestras analizadas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 pb
200 pb
Figura 20. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los
productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 2255C>T presente en el gen
VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. En los carril 1, marcador de peso molecular
de 100 pb, carriles 2 al 11, productos de PCR del SNP 2255C>T. Carril 12, control negativo de la
reacción en cadena de la polimerasa.
300
67
El análisis mediante RFLP del polimorfismo 2255C>T fue realizado utilizando
la enzima de restricción NcoI, cuya secuencia de reconocimiento se indica en la tabla
V de la metodología. La modificación nucleotídica crea el sitio de reconocimiento
para esta enzima, de tal manera que en presencia del alelo T en condición
homocigota se obtendrán dos fragmentos de 172 pb y 26 pb. En presencia del
genotipo homocigoto normal (CC) se observará una sola banda (198 pb) y en
presencia del heterocigoto tres (198,176 y 26 pb).
En los carriles 3 y 4 de la corrida electroforética de la figura 21A y 2, 3 y del 7
al 9 de la figura 21B se muestra el patrón de bandas característico de heterocigotos
para el polimorfismo. El fragmento de 26 pb no se observa debido a que éste sale del
gel en las condiciones empleadas en la corrida electroforética. Por su parte, en el
carril 2 de la figura 21A se observa un sólo fragmento que se corresponde con un
genotipo homocigoto normal para este polimorfismo. Finalmente, en los carriles 5 al
7 de la figura 21A y del 4 al 6 de la figura 21B se aprecia un patrón característico de
homocigotos mutados, una única banda de las dos esperadas (una de 172 pb y otra
de 26 pb), que como se mencionó anteriormente el fragmento de menor tamaño no
es posible apreciarlo debido a las condiciones de la corrida electroforética
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
198 pb
172 pb
200 pb
172 pb
A
B
Figura 21. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8%
de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa. (A) En el carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb, carril 2 al
7 productos de de amplificación (PCR) del SNP 2255C>T digeridos con la enzima NcoI. (B) En el
carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb, del carril 2 al 9 productos de amplificación (PCR) del
SNP 2255C/T digeridos con la enzima NcoI.
68
Del total de muestras analizadas en la población (300 individuos), se logró
identificar 105 sujetos cuyo genotipo es homocigoto normal, 136 heterocigoto
mutados y 59 del genotipo homocigoto mutado.
Tanto a los pacientes como a los controles estudiados para el polimorfismo
2255C>T, se les determinó las frecuencias genotípicas y alélicas (Tabla IX). Los
controles que resultaron ser homocigotos normales (genotipo CC) se encuentran en
la población estudiada con una frecuencia de 0,373, de manera similar a lo
encontrado en el grupo de pacientes (0,327). Los heterocigotos CT encontrados en
una frecuencia mayor (0,453), para ambos grupos. Los individuos que presentaron
genotipos mutados TT resultaron estar en una frecuencia de 0,173 y 0,220 para los
controles y pacientes, respectivamente. Pese a estos resultados las diferencias no
son estadísticamente significativas entre ambos grupos. En cuanto a las frecuencias
alélicas, la presencia del alelo de riesgo o mutado (T), se encuentra más frecuente
en el grupo de pacientes respecto al grupo control, siendo está de 0,450 en
comparación con el 0,400 expresado por grupo de pacientes. El alelo C se encuentra
en una frecuencia de 0,600 y 0,550 para el grupo control y paciente,
respectivamente,
sin
embargo,
estas
diferencias
no
son
estadísticamente
significativas para poder establecer un criterio definitivo en cuanto al comportamiento
de la población frente al genotipo de este polimorfismo.
Tabla IX. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 2255C>T.
SNP 2255C>T
Grupo Control
Número de
Frecuencia
Individuos, (%)
Grupo Pacientes
IC (95%)
CC
56 (37,3)
0,373
0,367 - 0,379
CT
68 (45,3)
0,453
0,446 - 0,460
TT
26 (17,3)
0,173
0,168 - 0,178
Alelo C
180 (60)
0,600
0,593 - 0,606
Alelo T
120 (40)
0,400
0,393 - 0,406
Total
150
300
Número de
Frecuencia
Individuos, (%)
IC (95%)
49 (32,7)
0,327
0,321 - 0,330
68 (45,3)
0,453
0,446 - 0,460
33 (22,0)
0,220
0,215 - 0,225
166 (55)
0,550
0,547 – 0,560
134 (45)
0,450
0,440 – 0,453
Resultados del análisis estadístico: OR=1,228 (IC 95%= 0,765 – 1,972) χ2 = 0,527 (1 g.l= 3,84) P=0,468
Total
150
300
69
VI.2.2.5 Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 3730G>A en el
gen VKORC1
Para el análisis del polimorfismo 3730G>A presente en la región 3’ no
traducida (3’ UTR) del gen VKORC1, se procedió a la amplificación mediante PCR
del fragmento de 282 pb que lo contiene, obteniéndose en cada caso el resultado
esperado (Figura 22).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
500 pb
300 pb
Figura 22. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los
productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 3730G>A presente en el gen
VKORC1 de muestras de algunos pacientes con trombosis venosa. En los carriles 1 al 10
productos de PCR del SNP 3730G>A. Carril 11, control negativo de la reacción en cadena de la
polimerasa. Carril 12, marcador de peso molecular de 100 pb.
Para el análisis del genotipo por RFLP del polimorfismo 3730G>A se utilizó la
enzima de restricción AciI, cuya secuencia de reconocimiento se indica en la tabla V
de la metodología. Existe un sitio de reconocimiento para esta enzima en presencia
del alelo normal G, generándose dos fragmentos uno de 180 pb y otro de 102 pb. El
cambio nucleotídico al alelo A, elimina el sitio de reconocimiento de la enzima por lo
que al someterlo a la digestión con la enzima AciI, se generará un sólo fragmento de
282 pb. Así, de una muestra procedente de un individuo heterocigoto mutado (GA)
para este SNP se obtendrán 3 fragmentos (282, 180 y 102 pb).
En la figura 23 se muestra los resultados obtenidos en algunas de las
muestras analizadas. En los carriles del 2 al 7 de la figura 23 B se observa una única
banda correspondiente al genotipo homocigoto mutado y los carriles del 3 al 5 de la
70
figura 23A el patrón de tres bandas correspondiente al genotipo heterocigoto. En
algunas muestras de individuos con el genotipo homocigoto normal (GG) se obtuvo
el patrón de bandas esperado (resultados no mostrados).
De los resultados obtenidos en la población estudiada (300 individuos), 43
individuos con el genotipo homocigoto normal GG, 179 con el genotipo heterocigotos
mutado y 78 sujetos con el genotipo homocigoto mutado.
1
300 pb
2
3
4
5
6
1
7
2
3
4
5
6
7
8
282 pb
100 pb
A
B
Figura 23. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8%
de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos
pacientes con trombosis venosa. (A) En el carril 1 marcador de peso molecular de 100 pb, del
carriles 2 al 6 productos de amplificación (PCR) del SNP 3730G>A digeridos con la enzima AciI. Carril
7, producto de PCR sin digerir (control). (B) En el carril 1 marcador de peso molecular de 50 pb, del
carriles 2 al 7 productos de amplificación (PCR) del SNP 3730G>A digeridos con la enzima AciI y
purificados para secuenciar. Carril 8, producto de PCR sin digerir (control)
Se determinaron las frecuencias genotípicas y alélicas en la población para el
polimorfismo 3730G>A (Tabla X). No se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre los grupos control y pacientes. La frecuencia encontrada de los
genotipos homocigotos normales (GG) en ambos grupos fue muy similar; 0,133 para
el primero y 0,153 para el segundo.
Una frecuencia de 0,594 de heterocigotos
mutados GA encontrado en los controles, y de 0,600 presentado el grupo pacientes.
Para que los sujetos con alelos mutados (AA) se obtuvieron una frecuencia de 0,273
en los controles en comparación con 0,247 en los pacientes. Los resultados
71
obtenidos al calcular las frecuencias alélicas indican que es menos frecuente
encontrar el alelo mutado A en los pacientes que en los controles. Al calcular el OR,
este indicó que la presencia del alelo A podría tener un efecto protector (OR= 0,849;
IC 95%, 0,488 – 1,611), aunque ello no fue estadísticamente significativo.
Tabla X. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la
población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 3730G>A
SNP 3730G>A
Grupo Control
Grupo Pacientes
Número de
Individuos, (%)
Frecuencia
IC (95%)
GG
20 (13,3)
0,133
0,129 - 0,137
GA
89 (59,4)
0,594
0,588 - 0,600
AA
41 (27,3)
0,273
0,267 - 0,279
Alelo G
129 (43)
0,430
0,423 - 0,436
Alelo A
171 (57)
0,570
0,563 - 0,576
Total
150
300
Número de
Frecuencia
Individuos, (%)
IC (95%)
23 (15,3)
0,153
0,148 – 0,158
90 (60,0)
0,600
0,594 - 0,606
37 (24,7)
0,247
0,241 - 0,253
136 (45,3)
0,453
0,446 - 0,460
164 (54,7)
0,547
0,540 - 0,554
Resultados del análisis estadístico: OR= 0,849 (IC 95%= 0,488 – 1,611) χ2 = 0,109 (1 g.l= 3,84) P= 0,742
VI.2.3. Análisis de secuencias
Para verificar los genotipos detectados por PCR-RFLP en el gen VKORC1, se
procedió a la secuenciación de algunas de las muestras. Se seleccionaron para
todos los polimorfismos evaluados, muestras representativas de cada genotipo
encontrado. Los resultados obtenidos del análisis de las secuencias corroboraron los
resultados obtenidos mediante RFLP y algunos de éstos se muestran en el anexo 3.
VI.3. Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg en la población
Previo a los análisis de asociación de los genotipos de los polimorfismos con
la ocurrencia de la trombosis venosa, se determinó en el grupo control, como
representante de la población general, si dichos alelos están en equilibrio de Hardy
Weinberg (H-W) (Tabla XI). Se encontró que en tres de los cuatro polimorfismos
estudiados (1639G>A, 698C>T, 2255C>T) se cumple el equilibrio de H-W y por su
parte el polimorfismo 3730G>A no se encuentra en equilibrio H-W (Tabla XI), por lo
Total
150
300
72
que debe considerarse al realizar los estudios de asociación con la trombosis
venosa.
Tabla XI. Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg (H-W) para los
polimorfismos estudiados en el gen VKORC1 en el grupo control.
EQUILIBRIO DE HARDY WEINBERG
Grupo Control
Grupo Pacientes
Polimorfismo
χ2
p (1 g.l)
χ2
P 1 (g.l)
SNP-1639G>A
0,570
> 0,05
5,320
< 0,05
SNP 698C>T
0,850
> 0,05
1,119
> 0,05
SNP 2255C>T
0,458
> 0,05
1,032
> 0,05
SNP 3730G>A
6,060
< 0,05
7,020
< 0,05
Resultados del análisis estadístico:χ crítico (1 g.l = 3,84) P< 0,05 = Valor significativo
2
Para el polimorfismo 106G>T no se calculó el equilibrio H-W, debido a que no
se detecto ningún cambio en la población estudiada, el 100% de los individuos
analizados resultaron ser homocigotos normales por lo tanto evaluar un equilibro
para este SNP no es posible bajo ningún criterio estadístico.
VI.4. Asociación de la edad de los pacientes con trombosis venosa y los
requerimientos de anticoagulante oral (dosis de warfarina).
En este trabajo se evaluó el grado de asociación entre los alelos de los
polimorfismos en el gen VKORC1 y la respuesta al tratamiento anticoagulante,
específicamente a la warfarina. Previo al análisis de asociación genética se procedió
a evaluar el grado de asociación o independencia de las variables edad y dosis de
tratamiento con warfarina en el grupo de pacientes, lo cual se determinó mediante
correlación y regresión lineal, a través de un coeficiente de correlación de Pearson y
de Spearman.
73
De acuerdo a los resultados obtenidos al aplicar ambas pruebas (Anexo 4), se
obtuvo que la dosis del tratamiento con warfarina recibida en el grupo de pacientes
disminuye conforme aumenta la edad, lo cual fue estadísticamente significativo (p
≤0,05) y señala que ambas variables en la población están relacionadas linealmente.
Estos resultados confirman la mínima regresión lineal entre ambas variables, una
baja correlación entre la dosis de warfarina y la edad de los pacientes, pero
estadísticamente significativa
VI.5 Análisis de asociación por coeficiente de determinación de la dosis
de warfarina en relación al polimorfismo genético.
Una vez determinada la frecuencia genotípica y alélicas de los polimorfismos
del gen VKORC1 de los pacientes con trombosis venosa a los requerimientos de
anticoagulante oral, se procedió a evaluar si hay alguna diferencias entre los
genotipos de cada polimorfismo y la dosis de anticoagulante requerida a través de un
análisis de varianza (Tabla XII). De acuerdo a los resultados obtenidos se observó
que para los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T hubo diferencias estadísticamente
significativas (p< 0,001), entre las dosis promedio requeridas y el genotipo del
polimorfismo observándose en ambos casos que en presencia del genotipo
homocigoto mutado hubo un menor requerimiento de la droga en comparación con el
heterocigoto y el homocigoto normal en cada caso.
Contrariamente, el análisis de varianza para los genotipos de los
polimorfismos 698C>T y 3730G>A indicó que los individuos portadores del alelo
mutado T o A respectivamente, requirieron mayores dosis de la droga en
comparación con la de los individuos homocigotos normales.
Asimismo, la dosis media que reciben los pacientes con el genotipo normal
GG del SNP 106G>T es de 5,084 mg/día y no se pudo establecer una comparación
74
entre los genotipos y la dosis de warfarina, debido a la ausencia de alelo mutado de
este SNP en la población estudiada.
Dosis Media de
Warfarina
(mg/día)
Error
Típico
IC (95%)
GG
6,303
0,271
5,788 - 6,849
GA
4,645
0,253
4,139 - 5,151
AA
3,946
0,345
3,255 - 4,674
GG
5,084
0,180
4,727 - 5,441
698C>T
CC
5,025
0,203
4,622 - 5,428
CT
5,363
0,382
5,572 - 6,153
2255C>T
CC
6,532
0,318
5,891 - 7,174
CT
4,595
0,214
4,166 - 5,025
TT
3,958
0,316
3,311 - 4,605
GG
4,459
0,400
3,627 - 5,291
GA
4,989
0,229
5,533 - 5,445
AA
5,716
0,390
4,922 - 6,510
106G>T
-1639G>A
Variable
Genotípica
(SNP)
3730G>A
Tabla XII. Análisis de Varianza mediante ecuación de regresión lineal simple
estableciendo los requerimientos de warfarina basados en el polimorfismo y
las variantes genotípicas.
r
r2
0,0001
-0,423
0,179 (17,9%)
0,020
-0,193
0,037 (3,7%)
<0,0001
-0,467
0,218 (21,8%)
0,025
0,191
0,037 (3,7%)
P
Resultados del análisis estadístico: ANOVA P< 0,001 = Valor significativo
Los resultados del análisis de varianza permite sugerir que en cuatro de los
cinco polimorfismos (-1639G>A, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A) analizados el
genotipo estuvo asociado a la dosis de warfarina requerida. Para evaluar la
asociación entre las variantes de los polimorfismos y la dosis, se procedió a realizar
75
un segundo análisis, el cual consistió en un estudio de regresión lineal simple donde
los valores obtenidos del coeficiente de correlación (r) y de determinación (r2)
permiten establecer cuanto de la variabilidad de la dosis es explicada por los distintos
genotipos de cada uno de los polimorfismos. Los resultados de este análisis están
reflejados en la Tabla XII.
Según los resultados obtenidos por el valor R, esta
asociación es débil en los polimorfismos 698C>T y 3730G>A y moderada en los
polimorfismos -1639G>A y 2255C>T. En consecuencia, según los valores de R2, en
los polimorfismos 698C>T y 3730G> el genotipo sólo puede explicar en un 3,7% la
variabilidad de la dosis y en un 17,9% y 21,8% por los SNPs -1639G>A y 2255C>T,
respectivamente.
VI.6. Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1 y
Trombosis Venosa.
Diversos estudios han demostrado que además de la asociación de los
genotipos de los polimorfismos analizados en este trabajo con la dosis del
anticoagulante oral utilizado, también puede existir entre ellos alguna relación con la
ocurrencia de la trombosis venosa, ya que de alguna manera pudieran estar
afectando positiva o negativamente la activación de factores de la coagulación
dependientes de la vitamina K.
Anteriormente, se realizó el calculo de los OR con los datos obtenidos de las
frecuencias genotípicas de cada uno de los polimorfismos (Tabla VII a la X),
obteniéndose que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre la
distribución de genotipos entre pacientes y controles. En consecuencia se puede
sugerir que no existe un riesgo aumentado en los individuos a padecer trombosis
venosa asociado al genotipo de los polimorfismos estudiados. Sin embargo, se
procedió a realizar el análisis detallado para evaluar si con alguna de las
combinaciones genotípicas podría variar el riesgo asociado a la patología
dependiendo del polimorfismo.
76
Para evaluar la asociación de los polimorfismos estudiados con la trombosis
venosa se elaboraron tablas de contingencia de acuerdo al genotipo de cada SNP y
se contrastó la hipótesis de asociación mediante una prueba de χ2. Se evaluaron tres
de los cuatros modelos principales de herencia: el dominante, el recesivo y el aditivo,
para los polimorfismos -1639G>A, 2255C>T y 3730G>A y uno: modelo co-dominante
para el SNP 698C>T.
Tal como se señaló previamente el polimorfismo 3730G>A no se encuentra en
equilibrio de Hardy Weinberg, lo cual debe ser considerado a la hora de interpretar
los resultados de asociación con la trombosis venosa, donde se probaron los
modelos de herencia. El modelo dominante, supone que una única copia del alelo
variante es suficiente para modificar el riesgo y que ser portador de dos alelos lo
modifica igual. El modelo recesivo, supone que son necesarias dos copias del alelo
variante para modificar el riesgo, así que heterocigotos y homocigotos del alelo mas
frecuente tienen el mismo riesgo. Aquí se compara estos dos genotipos con el
homocigoto del alelo variante. Por su parte el modelo aditivo, supone que cada copia
del alelo variante modifica el riesgo en una cantidad aditiva, por lo tanto un
homocigoto tiene el doble de riesgo que los heterocigotos. El modelo co dominante
supone que cada alelo aporta un riesgo a la enfermedad diferente y no aditivo, con el
se pueden comparar heterocigotos y homocigotos variantes por separado.
En los resultados obtenidos en la Tabla XIII, se observa que no existe
asociación entre los genotipos de los polimorfismos en el gen VKORC1 estudiados
en el grupo de pacientes y la patología, excepto para el polimorfismo -1639G>A el
cual resultó estadísticamente significativo para el modelo recesivo, es decir que
existe una mayor probabilidad de encontrar el alelo mutado en condición homocigota
en la población de pacientes que en controles, lo cual sugiere su asociación con la
patología.
77
Tabla XIII. Análisis de riesgo para la trombosis venosa en relación a las
variantes genómicas de los SNPs en el gen VKORC1.
RELACIÓN ENTRE LOS POLIMORFISMOS Y TROMBOSIS VENOSA
3730G>A
2255C>T
698C>T
-1639G>A
Modelo de Asociación
Modelo Recesivo
AA Vs GA + GG
Modelo Dominante
GA + AA Vs GG
Modelo Aditivo
AG--> GG
AA--> GG
Modelo Co-Dominante
CT
Modelo Recesivo
TT Vs CT + CC
Modelo Dominante
CT + TT Vs CC
Modelo Aditivo
TT --> CC
TC--> CC
Modelo Recesivo
AA Vs GA + GG
Modelo Dominante
GA + AA Vs GG
Modelo Aditivo
AA --> GG
GA --> GG
OR
IC (95%)
χ2
P
2,250
(1,164-4,345)
5,124
0,024
1,000
(0,621-1,610)
0
1
0,821
2,000
(0,498-1,355)
(0,969-4,124)
0,410
2,865
0,522
0,091
1,229
(0,658-2,292)
0,231
0,631
1,345
(0,762-2,375)
0,760
0,383
1,228
(0,765-1,972)
0,527
0,468
1,451
1,143
(0,767-2,745)
(0,687-1,900)
0,953
0,147
0,329
0,701
0,870
(0,521-1,456)
0,156
0,693
0,849
(0,448-1,611)
0,109
0,742
0,785
0,879
(0,374-1,646)
(0,454-1,702)
0,200
0,043
0,655
0,835
Resultados del análisis estadístico: χ2 crítico (1 g.l = 3,84) P< 0,05 como valor significativo
VI.7 Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1.
Debido a que en los análisis anteriores se ha observado una asociación entre
los diferentes genotipos de los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T en la población,
en relación con la frecuencias genotípicas y alélicas, así como con la dosis de
warfarina requerida por los pacientes, se evaluó por pruebas específicas si la
presencia de los alelos mutados de ambos están ligados. Para ello, se consideraron
las frecuencias genotípicas y alélicas de cada uno, tanto en controles como en
pacientes. Se evaluaron los estadísticos; exacto de Fisher, razón de verosimilitudes y
asociación lineal, los dos primeros con 4 grados de libertad y el último con un grado
78
de libertad. En la tabla XIV se resume el número de individuos por genotipo de cada
polimorfismo. Los resultados del análisis mostraron una asociación entre ambos
estadísticamente significativos (p< 0,0001) (Anexo 5). Puede comprobarse que los
individuos, tanto controles como pacientes coinciden en una proporción apreciable en
su genotipo, es decir, que los individuos expresan un genotipo heterocigoto GA, para
el polimorfismo -1639G>A lo presentan también para el genotipo heterocigoto CT del
SNP 2255C>T. El mismo resultado fue observado en sujetos con los genotipos
homocigotos AA y TT de los mismos polimorfismos y en ambos grupos de estudio.
Tabla XV. Resumen de análisis de asociación entre los Polimorfismos de
Nucleótidos Simples -1639G>A y 2255C>T en el gen VKORC1 en los grupos
control y pacientes.
Pacientes
2255C>T
CC
CT
TT
Total
GG
42
7
2
51
GA
13
58
13
84
AA
1
3
11
15
Total
56
68
26
150
-1639G>A
-1639G>A
Controles
2255C>T
CC
CT
TT
Total
GG
42
8
1
51
GA
6
59
4
69
AA
1
3
28
30
Total
49
68
33
150
Resultados del análisis estadístico:χ2 crítico (1 y 4 g.l) P< 0,0001 como valor significativo.
VI.8 Análisis de riesgo para dos polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T del
gen VKORC1 en relación a la Trombosis Venosa.
Debido a que los resultados anteriores señalan una asociación entre los
diferentes genotipos de los SNPs -1639G>A y 2255C>T en la población, se
seleccionaron estos dos polimorfismos para comparar la presencia del genotipo
homocigoto mutado contra de la ausencia del mismo en pacientes y controles. Así
como también se estimó el riesgo en la población de padecer trombosis venosa
79
cuando los individuos posean simultáneamente ambos genotipos mutados. Para ello
se calculó el OR y se aplicó una prueba de χ2 partiendo de los datos obtenidos de
esta investigación y señalados en la tabla XIV.
Los resultados indican que hay un riesgo aumentado a padecer de trombosis
venosa cuando un individuo presenta simultáneamente el alelo mutado A del
polimorfismo -1639G>A y el alelo mutado T del polimorfismo 2255C>T, ambos
genotipos en condición homocigota. El OR obtenido fue de 2,703 (IC 95% 1,300 –
5,611) con un χ2 = 7,26 y un p valor = 0,007. Estos resultados fueron
estadísticamente significativos en ambos grupos de estudio para un p<0,01 de
significancia.
VI.9
Determinación
del
Desequilibrio
de
ligamiento
entre
los
polimorfismos -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1
Debido a que es difícil definir cual de los genotipos de los polimorfismos
analizados es el responsable de influir o modificar el riesgo de la enfermedad
(trombosis venosa), se analizaron en conjunto dos de los cinco SNPs estudiados en
el gen VKORC1 (-1639G>A y 2255C>T) debido a que se observó por resultados
previos, que ambos tienen cierto grado de correlación o asociación estadística. Esta
asociación es denominada Desequilibrio de Ligamiento. Para ellos se determinaron
las frecuencias alélicas y gaméticas, tanto las esperadas como las observadas en el
grupo control, partiendo de los datos resumidos en la tabla XIV, los cuales
permitieron determinar el desequilibrio de ligamiento aplicando un χ2. Los resultados
indican que el desequilibrio (D) fue distinto de cero, obteniéndose un valor de
χ2=
26,995 con un grado de libertad, un intervalo de confianza del 95% (2,194-5,834) y
un P<0,0001. Se determinó que los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T se
encuentran en desequilibrio de ligamiento en el grupo control.
80
VII. DISCUSIÓN
La incidencia de trombosis venosa en los individuos de una población se ve
influenciada no sólo por la suma de factores adquiridos (ambientales), sino que juega
un papel importante las variaciones genéticas inherentes de cada individuo (Lacut y
col., 2007). En conjunto, todos estos factores contribuyen con el desarrollo de dicha
patología, considerada como una de las causas de morbilidad y mortalidad, tanto en
nuestra población como a nivel mundial. Si bien en algunos casos el origen de la
enfermedad es conocida, en otros no lo es, por lo que la investigación en esta área
ha cobrado interés en los últimos años, principalmente porque se hace difícil tratar a
los pacientes con trombosis, los cuales en la mayoría de los casos no responden
bien a la terapia primaria con anticoagulantes orales.
La warfarina es el anticoagulante por elección y una de las principales drogas
usadas en la terapia y la prevención de enfermedades trombóticas a nivel mundial
(Sconce y col., 2005. D’Andrea y col., 2005). Sin embargo, exhibe una amplia
variabilidad en cuanto a la dosis requerida y a la respuesta en los pacientes (Limdi y
col., 2010) y Las investigaciones de la farmacocinética de la warfarina indican que los
factores genéticos explican en gran parte esta variabilidad (Wadelius y Pirmohamed,
2007).
En el estudio de enfermedades genéticamente complejas juega un rol
importante los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) (Zhang y col., 2005). En la
actualidad es usado con frecuencia los genotipos de algunos SNPs como
marcadores genéticos para establecer asociación entre variables de una población
(variables genéticas) y determinado fenotipo (riesgo de enfermedad). Generalmente,
establecer una relación estadística entre las variables, es posible cuando se
desarrollan estudios de casos-controles donde se valora el componente genómico
respecto a otros factores de tipo ambiental o adquirido, en el riesgo a desarrollar la
enfermedad (Sevilla, 2007). Se recomienda por tanto hacer una combinación en la
selección en el gen de interés, de los polimorfismos a estudiar, donde se evalúe tanto
81
las variantes funcionales que pueden contribuir a la enfermedad, así como aquellas
regiones regulatorias de la expresión genética que son conservadas, debido a que
éstas en conjunto son regiones regulatorias importantes.
Partiendo de este principio, en este trabajo se analizaron mediante PCRRFLP, cinco SNPs ubicados en regiones distintas en el gen VKORC1: -1639G>A,
106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A que abarcan desde la región promotora
hasta la región 3’ no traducida, incluyendo el primer exón así como, el primer y
segundo intrón. Este análisis fue hecho en una población constituida por 300
individuos (150 pacientes y 150 controles) con el objeto de investigar la relación de
los genotipos de estos polimorfismos con la respuesta a la dosis de warfarina y con
el desarrollo de la trombosis venosa.
La determinación de la frecuencia genotípica y alélicas de los cinco
polimorfismos estudiados en el gen VKORC1, permitieron estudiar parte de la
población venezolana sometida a tratamientos continuos con anticoagulantes orales
de tipo cumarínico como la warfarina. Varias investigaciones previas sostienen la
importancia de investigar el efecto de los diferentes genotipos de los SNPs sobre la
regulación de la dosis de este fármaco. Como se mencionó anteriormente, una de
ellas fue la realizada por Rieder y colaboradores (2005), quienes establecieron una
clasificación por haplotipos en la respuesta al tratamiento. Estos autores distinguen
dos grupos, el grupo A, que fue asociado con dosis bajas de warfarina y el grupo B
asociado a altas dosis.
En ambos casos estas diferencias en la respuesta fue
explicada por los diversos niveles de expresión hepática de la proteína VKORC1
(Rieder y col., 2005).
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple -1639G>A en el gen
VKORC1
Con relación a las frecuencias alélicas y genotípicas encontradas del
polimorfismo -1639G>A del grupo de pacientes, se observó que está en equilibrio de
Hardy Weinberg y fue comparable a la reportada en otros trabajos (Sconce y col.,
82
2005; Zhu y col., 2007; Scott y col., 2008). La frecuencia del alelo G encontrada en
la población de pacientes en este estudio fue de 57% y la del alelo A en un 43%,
igual a la frecuencia reportada por Sconce en el 2005 para los mismos alelos en una
población de pacientes estudiada en el Reino Unido. El resultado obtenido en el
presente estudio también fue similar al
hallado en dos poblaciones Judías,
Ashkenazi y Sephardi, donde encontraron 53,3% y 50% para el alelo G y 56,7% y
50% para el alelo A, respectivamente (Scott y col., 2008). Por su parte, en lo que
respecta a las frecuencias genotípicas encontradas en el grupo de pacientes
investigados en este trabajo, se observó que el genotipo homocigoto mutado AA fue
de 20%, a diferencia de la encontrada en la población asiática la cual alcanza un
82,1% (Yuan y col., 2005). Para los genotipos homocigoto normal (GG) y
heterocigoto (GA) estas fueron menores en comparación con los valores obtenidos
en los individuos con el genotipo AA. En este trabajo se encontró en el grupo de
pacientes una frecuencia del 46% para el genotipo GA frente al 17,9% y al 46,7%
reportado en pacientes chinos y caucásicos, respectivamente (Yuan y col., 2005).
Se han encontrado diferencias de acuerdo al origen étnico y ello se ha
correlacionado con la presencia del alelo mutado A del polimorfismo. Este alelo está
asociado a la sensibilidad a la warfarina de los pacientes. En un estudio realizado en
varias poblaciones de diferentes orígenes étnicos del mundo: Asiáticos, Blancos,
Hispanos, Africanos – Americanos, se observa como esta diversidad influye
fuertemente en la distribución de la dosis, siendo baja para los primeros y alta para
los últimos, encontrándose asociación con la presencia del alelo A del polimorfismo
(Johnson, 2008).
Durante los últimos años, los pacientes con trombosis venosas han sido
tratados
siguiendo
las
recomendaciones
del
Consorcio
Internacional
de
Farmacocinética de la Warfarina (IWPC, 2009). Este consorcio estableció tres rangos
terapéuticos de acuerdo a la construcción de algoritmos donde se consideran la
dosis del fármaco según las variantes alélicas del polimorfismo -1639G>A (alelo G y
Alelos A) y de los genotipos de éste SNP, en las diferentes poblaciones mundiales.
Pacientes quienes requieren menos de 21 mg por semana (bajas dosis), aquellos
83
que necesitan dosis intermedias (entre 21 y 49 mg de droga por semana) y pacientes
que requieren más de 49 mg por semana (altas dosis). En este trabajo se encontró,
que la dosis de warfarina que reciben diariamente el grupo de pacientes estudiados
con el SNP -1639G>A varió desde 6,303 mg/día para el genotipo homocigoto normal
GG, 4,645 mg/día para los pacientes heterocigotos GA, hasta 3,946 mg/día para los
individuos homocigotos mutados AA (Tabla XII). Estas dosis recibidas por los
pacientes corresponden a una terapéutica de respuesta normal y estable, es una
dosis que no les ocasiona a los pacientes efectos secundarios ni alteraciones en su
coagulación. Éste rango terapéutico recibido por estos pacientes está en
concordancia con la dosis establecida por el Consorcio Internacional de
Farmacocinética de la Warfarina para los mismos genotipos de este polimorfismo.
Los resultados obtenidos tanto en este trabajo como en los reportados por otros
(Sconce y col., 2005;
Scott y col., 2008; IWPC,
2009), concuerdan en que la
presencia del alelo A, debe modificar la respuesta a la droga y condiciona al uso de
una menor concentración en la dosis. Los resultados obtenidos en el presente trabajo
(estadísticamente significativos) se apoyan en el análisis de varianza y de correlación
entre la dosis y el polimorfismo, donde estos cambios en el polimorfismo sólo pueden
explicar el 17,9% de la variabilidad en la dosis de warfarina (Tabla XII). Esto coincide
con los porcentajes de variabilidad presentado por dos poblaciones diferentes:
asiáticos y blancos 18,4% y 22,5%, respectivamente. En estas poblaciones fueron
comparados los diferentes genotipos del SNP -1639G>A con la dosis de warfarina
recibida (Limdi y col., 2010). Podría considerarse, de acuerdo a los resultados
obtenidos y a las investigaciones previas que el alelo A del polimorfismo -1639G>A
es un alelo que confiere una respuesta de sensibilidad, mientras que el alelo G
puede otorgar cierta respuesta de resistencia al tratamiento con warfarina.
El polimorfismo -1639G>A, está ubicado en la región promotora del gen,
específicamente se encuentra en el segundo nucleótido una E-box (CA/GNNTG) la
cual se encuentra cercana a tres cajas más a muy corta distancia (200 pb). Se ha
sugerido que estas cajas son un sitio importante para mediar la transcripción tejido
específico, como el músculo, neurona, hígado y páncreas. Yuan y colaboradores en
84
el 2005, empleando ensayos de actividad con luciferasa evaluaron la actividad del
promotor. Para ello, realizaron construcciones donde fusionaron el promotor
conteniendo los diferentes genotipos del polimorfismo -1639G>A (genotipo GG y
AA), a el gen reportero (luciferasa) para posteriormente, transfectar ambas
construcciones genéticas en células de hepáticas de mamífero (HepG2), debido a
que estos dos genotipos tienen unos altos niveles de expresión en hígado. A través
de los niveles de luciferasa, los investigadores encontraron que la actividad
transcripcional en presencia del alelo G fue un 44% más alta comparado con el alelo
A. Por lo tanto sugieren que el cambio que ocurre en el segundo nucleótido de la
secuencia consenso de la E-Box (CA/GNNTG) aumenta la actividad del promotor en
el VKORC1 (Yin y Miyata, 2007), posiblemente evitando la unión de algún represor y
en consecuencia aumentando los niveles de VKORC1. Estos resultados están
apoyados por los obtenidos por Rieder y colaboradores (2005), los cuales cuando
examinaron los niveles de expresión del ARN mensajero de VKORC1 en tejido de
hígado humano, encontraron que éste fue significativamente más alto (alrededor de
tres veces más) en el grupo con el haplotipo que cursa con altas dosis (grupo B) el
cual contiene el alelo G del polimorfismo -1639G>A) en comparación con el grupo de
bajas dosis (grupo A, el cual contiene el alelo A del dicho polimorfismo). Estos
resultados podrían explicar la asociación que existe entre el alelo A del polimorfismo
y la variabilidad individual en la dosis de warfarina, la cual podría deberse a una
disminución de los niveles de ARN mensajero de VKORC1.
Así, lo anterior explica porque los individuos con el genotipo GG requieren de
altas dosis, ya que en presencia de este nucleótido la actividad del promotor está
aumentada, la expresión de ARN mensajero se eleva, incrementándose así los
niveles de la proteína VKORC1 (Yuan y col., 2005). Un incremento en esta proteína
contribuye a la generación de una mayor cantidad de vitamina K reducida, la cual a
su vez podrá contribuir a la γ-carboxilación de los factores de coagulación
dependiente de vitamina K. De esta manera, se activaría una mayor cantidad de
estos factores de coagulación, haciendo que sean mayores los requerimientos de
warfarina para garantizar la anticoagulación.
85
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 106G>A en el gen
VKORC1
En cuanto al análisis del polimorfismo 106G>T, en este trabajo se observó que
en el 100% de la población estudiada, que incluye tanto el grupo de pacientes como
de controles mostraron ser genotípicamente homocigotos normales (GG), esto se
corresponde con una frecuencia del alelo G del 100% en la población analizada. Este
porcentaje genotípico y alélico es muy similar al reportado por Scott y colaboradores
(2008), quienes encontraron un 95,7% del alelo normal G y 4,3% del alelo mutado T
para una de las dos poblaciones Judías en estudio (Ashkenazi). En el otro grupo
poblacional que estudiaron estos autores (Shepardi), encontraron un 99,4% para el
alelo G y un 0,6% para el alelo T (Scott y col., 2008).
En este trabajo, la dosis media de warfarina que requieren los pacientes con
trombosis venosa y que expresan el genotipo GG del SNP 106G>T es de 5,084
mg/día (equivalente a 35,8 mg/semana, una dosis intermedia de warfarina) (Tabla
XII). Estos requerimientos están más relacionados con dosis intermedias establecida
entre los 20 y 70 mg/sem y coincide con el grupo control de otros trabajos realizados
en población Sueca, Judía y de Etiopia, donde la variabilidad en los requerimientos
se ve influenciada no sólo por factores genéticos, sino también por la edad y la masa
corporal, llegando a explicarse por todos estos factores un 62% esta variabilidad en
la dosis intermedia requerida en este grupo control. Estos autores en su trabajo
encontraron un grupo de individuos que requerían de dosis más elevadas del
fármaco (alrededor de 80 miligramos semanales) en comparación con la dosis
requerida por el grupo anterior, estos sujetos fueron encontrados como portadores
del cambio alélico o con el genotipo homocigoto mutado (TT) del polimorfismo
106G>T (Lobestein y col., 2007).
Tal como se ha señalado previamente, el cambio de una G por una T origina
una mutación sin sentido en el primer exón del gen VKORC1, conllevando a la
86
sustitución del aminoácido ácido aspártico (D o Asp) en la posición 36 de la proteína
por una tirosina (Y o Tyr). Este cambio ocurre muy cerca de la cisteína 43, un residuo
conservado en la estructura de la proteína en varias especies y muy próximo a los
residuos que forman parte del centro activo de la enzima. Probablemente esta
modificación interfiere en la estructura terciaria de la proteína VKORC1 en el
segundo motivo α hélice de la región transmembrana, el cual se extiende desde la
posición 101 a la 123. Este segundo motivo a su vez está ubicado muy cerca del sitio
de unión a la warfarina y al motivo redox de la proteína (figura 7), lo que
probablemente ocasione un incremento en los requerimientos en la dosis del
anticoagulante (warfarina). (Tie y col., 2005. D’Ambrosio.y col., 2007). Esto apoya lo
reportado por Harrington y colaboradores (2008) quienes señalan que posiblemente,
la mutación y específicamente la presencia del alelo mutado T en el gen genere
modificación en la región entre la membrana y el primer lazo de la proteína
ocasionando un cambio en ese dominio y una reducción en la unión de los
cumarínicos (como la warfarina) a esta estructura, generando de esta forma una
resistencia al fármaco.
El efecto previamente señalado de resistencia al fármaco ha tratado de ser
explicado por diversos estudios realizados por otros autores (Oldenburg 2005.
Oldenburg y col., 2007. D’Ambrosio y col., 2007). En esos estudios se investigó la
sustitución nucleotídica en este polimorfismo (106G>T) en diferentes grupos de
individuos (en europeos, judíos y sujetos de Reino Unido) identificándose por
secuenciación, el cambio molecular y la modificación en la estructura de la proteína.
Específicamente, Harrington y colaboradores (2008), estudiaron varias sustituciones
nucleotídicas en el gen VKORC1, que estaban asociadas con la farmacocinética de
resistencia a la warfarina, una de ellas fue la sustitución nucleotídica del polimorfismo
106G>T.
Este estudio fue realizado únicamente en 15 sujetos con enfermedad
trombótica venosa, de los cuales sólo 8 presentaron 4 modificaciones (sustituciones)
nucleotídicas (p.V66M, p.L128R, p.V45L o p.D36Y) . A pesar de estar relacionados a
la resistencia, estos individuos no cursaron con complicaciones en el tratamiento, por
lo que los investigadores concluyeron que las mutaciones asociadas a la resistencia
87
de la warfarina reducen la potencia anticoagulante, sugieren que pueden ser un
efecto combinado sobre las posibles modificaciones estructurales que pueda
presentarse en la proteína, pero éstas no causan defectos importantes en la función
reductasa de la VKORC1. Como el lugar donde ocurren las sustituciones esta
ubicado muy cerca del lazo citoplasmático en la estructura de la proteína VKORC1,
los investigadores sugieren a esta región como un candidato para las sustituciones
nucleotídicas, alterando la estructura de la proteína, reduciendo la unión en ese
dominio de parte de los cumarínicos y causando resistencia a la warfarina
(Harrington y col., 2008).
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 698C>T en el gen
VKORC1
Otro polimorfismo estudiado en el presente trabajo y cuyo alelo mutado se ha
asociado con cierta resistencia a la terapia con anticoagulantes orales es el 698C>T,
ubicado en el primer intrón del gen VKORC1. Éste conforma el grupo B de los
haplotipos establecido por Rieder y colaboradores en el 2005. Específicamente al
haplotipo VKORC1*1 por el alelo C y al VKORC1*4 por el alelo T (Reitsma, 2007). Se
observó que este polimorfismo está en equilibrio de Hardy Weinberg. En la población
en estudio, los genotipos fueron encontrados sólo en condición homocigota normal
(CC) y en condición heterocigota (CT). La frecuencia de individuos portadores del
cambio nucleotídico fue similar entre el grupo control y pacientes (Tabla VIII).
Específicamente el genotipo CC se encontró en un 86% para los controles y en un
83,3% para los pacientes, mientras que el genotipo CT en un 14% y 16,7%,
respectivamente. Estos resultados son comparables por los encontrados en el 2006
por Osman y colaboradores, los cuales reportaron que la frecuencia genotípica fue
de 77% y 23% para el grupo control y 75% y 25% para el grupo de pacientes para
los genotipos CC y CT, respectivamente . En cuanto a la frecuencia alélicas y de
acuerdo a los resultados de obtenidos en esta investigación, el alelo C es más
frecuente (91,6%) que el alelo T (8,4%) en el grupo de pacientes, este porcentaje
obtenido de la frecuencia alélicas es superior al reportado por otros investigadores al
analizar este polimorfismo en un grupo de pacientes de una población Europea
88
Americana donde encontraron una frecuencia del 79.6% para el alelo C y 20,4% para
el alelo T (Li y col., 2006).
En relación a la dosis de warfarina requerida por los pacientes con los
diferentes genotipos del SNP 698C>T analizados en este trabajo, ésta se ubicó entre
5,025 mg/día para el genotipo homocigoto normal CC y 5,363 mg/día para el
genotipo heterocigoto CT, lo que se traduce en una media semanal de 35,175 y
37,541 miligramos, respectivamente (Tabla XII). Estos resultados coinciden con los
encontrados por Li y colaboradores en el 2006, lo cuales están entre los 35,2 y 40
miligramos por semana para los genotipos CC y CT, respectivamente. Por su parte,
se reporta en la misma investigación que los individuos que poseen el alelo mutado T
o genotipo TT cursan con dosis mas elevadas hasta llegar a una media de 54,7
miligramos por semana (Li y col., 2006). De los datos obtenidos, sólo el 3,7% de la
variabilidad en los requerimientos del fármaco pueden ser explicados por el
componente genético y las variables alélicas presentadas por los pacientes con el
polimorfismo 698C>T (Tabla XII). El resto de las variables extrínsecas, como el factor
ambiental, la dieta, el índice de masa corporal o la combinación con otros factores
genéticos (otros polimorfismos presentes en el gen) podrían estar afectando la dosis
requerida por estos individuos. Como son pocos los trabajos que han estudiado el
polimorfismo 698C>T, se manejan escasos datos referente a la resistencia al
tratamiento con anticoagulante, sin embargo, hay ciertas evidencias que señalan que
en
éstos individuos (de diferentes poblaciones de pacientes) que poseen
el
genotipo CT o TT del polimorfismo 698C>T y padecen de enfermedad trombótica,
sus requerimientos de anticoagulantes son mayores a los necesitados por los
individuos que poseen genotipo homocigoto normal para el mismo polimorfismo.
La variación que ocurre en el primer intrón del gen VKORC1 (698C>T) podría
generar un sitio de corte y empalme (splicing) alternativo que compita con un sitio de
corte normal durante el procesamiento del ARN. Probablemente esto contribuya a
que los requerimientos de anticoagulantes sean mayores cuando un individuo
89
presente un cambio alélico o genotípico en el polimorfismo estudiado en
esta
región.
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 2255C>T en el gen
VKORC1
Al estudiar los datos obtenidos de la investigación correspondiente al SNP
2255C>T ubicado en el segundo intrón del gen VKORC1, se determinó que está en
equilibrio de Hardy Weinberg y que el genotipo heterocigoto CT fue el más frecuente
en la población estudiada, tanto en pacientes como en controles con un 45% en
ambos grupos. Por su parte, los sujetos homocigotos normales CC (37,3% controles
y 32,7% pacientes) superan a los homocigotos mutados TT en ambos grupos de
estudio (17,3 % controles y 22% pacientes) (Tabla IX). Estos resultados difieren de
los reportados por Wang y colaboradores en el 2006, los cuales encontraron en un
grupo de pacientes con trombosis venosa que para el genotipo CC la frecuencia fue
de 0,6%, la del genotipo CT de 17,8% y la correspondiente al genotipo homocigoto
mutado TT alcanza el 81,6%. En cuanto a la frecuencia alélicas para el polimorfismo
2255C>T se encontró en esta investigación que el alelo normal C en el grupo control
es similar al encontrado en los pacientes, siendo del 60% para el primer grupo y del
55% para el segundo, mientras que la frecuencia del alelo mutado T fue de un 40%
para los controles y 45% para los pacientes. Probablemente la presencia del alelo
normal C podría incrementar la actividad del promotor y la mayor expresión de ARN
mensajero y de proteína (Wang y col., 2006).
Por su parte Rieder y colaboradores en el 2005, hacen referencia al alelo C
del polimorfismo 2255C>T y lo incluye en un grupo junto a otros 4 SNPs más, donde
en conjunto estos haplotipos (-1639G>A, 1173C>T, 1542G>G, 2255C>T, 3730G>A,)
contribuyen aproximadamente en tres veces más al requerimiento de altas dosis de
anticoagulante (Rieder y col., 2005). Así mismo se sugiere que el alelo C contribuye
a una alta eficiencia funcional del complejo VKORC1 y confiere casi dos veces el
riesgo en el individuo a padecer enfermedad vascular (Wang y col., 2006).
Así
90
mismo, el alelo C del SNP 2255C>T, también está asociado con los requerimientos
de altas dosis de warfarina, hecho que fue observado en un estudio multiétnico
realizado con poblaciones Asiáticas, Caucásicas, Hispanos y Afro Americanos;
particularmente en estos últimos son mas comunes estas variantes (Langley y col.,
2009).
En cuanto a la dosis media de anticoagulante (warfarina) requerida por los
pacientes con el polimorfismo 2255C>T obtenidos en este trabajo (Tabla XII), se
encontró que los resultados varían dependiendo del genotipo de cada individuo.
Específicamente las dosis requeridas por los sujetos con el genotipo CC fue de 6,532
mg/día (45,7 mg/sem.); para los del genotipo CT fue de 4,595 mg/día (32,1 mg/sem)
y 3,958 mg/día (27,7 mg/sem.) para el genotipo TT. Estos resultados son
estadísticamente significativos, y se apoyan en un análisis de correlación entre la
dosis requerida y el polimorfismo, donde el 21,8% de la misma es explicada por la
variabilidad genética encontrada en los pacientes portadores de alguno de estos
genotipos del SNP 2255C>T (Tabla XII). Estos datos coinciden con la dosis semanal
requerida por Europeos-Americanos presentado en el estudio por Li y colaboradores
(2006), donde los pacientes con el genotipo CC tienen una respuesta estable con
una dosis de 47,1 mg/semana, disminuyen los requerimientos en los que presentan
el genotipo CT con un 35,7 mg/semana y un 26,5 mg/semana para los del genotipo
TT (Li y col., 2006).
Es evidente que las variantes genotípicas del polimorfismo 2255C>T influyen
en la dosis de warfarina y que estas modificaciones están asociadas a las bajas
dosis requeridas por los sujetos con el genotipo TT, en comparación con las dosis
mayores en aquellos sujetos que poseen el genotipo CC; de manera similar a lo que
ocurre con el polimorfismo -1639G>A cuando se evaluó las variantes alélicas para
ese polimorfismo y la dosis de anticoagulante (Wadelius y col., 2009).
Al igual que el polimorfismo encontrado en el primer intrón (698C>T), éste
SNP (2255C>T) ubicado en el segundo intrón podría estar afectando en el
91
procesamiento del ARN (Wang y col., 2008). Con éste cambio alélico de una C por
una T en el polimorfismo 2255C>T, se podría inferir que los niveles de transcripción
de la proteína VKORC1 y la modulación de la carboxilación de los factores de
coagulación están afectados. Sin embargo, los resultados del estudio desarrollado
por Wang y colaboradores (2008) al evaluar los niveles de expresión de ARN
mensajero, señalaron que los SNPs encontrados en las regiones intrónicas del gen
VKORC1 no afectan el procesamiento de corte y empalme, por lo que no se encontró
variaciones los niveles del ARN mensajero. Esto fue posible
mediante RT-PCR
(PCR en tiempo real) donde cuantificaron en distintas células y tejidos (de corazón,
pulmón, riñón, intestino delgado, cerebro, linfocitos B, células HEK293, HepG2), la
cantidad de ARN mensajero de VKORC1. Los patrones de empalme obtenidos
fueron similares, excepto en cerebro y células HEK293. Otros ensayos para soportar
esto consistieron en la amplificación de ciertas regiones intrónicas del gen VKORC1,
clonar dentro de un plásmido (pcDNA3), para posteriormente transfectar en cuatro
líneas celulares diferentes y se midió el empalme en ellas mediante fluorescencia. En
los resultados todas las células expresaron una cantidad similar de la proteína. El
resultado arrojó que no había diferencias en las variantes independientemente de la
línea celular evaluada. Esto permitió confirmar que los SNPs en los intrones no
afecta el empalme del ARN. Finalmente, aunque no esté totalmente claro como la
mutación afecta la actividad de la proteína, es posible considerar un ajuste en la
dosis de warfarina prescrita a cada paciente para cumplir con un tratamiento
adecuado y estable según el genotipo.
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 3730G>A en el gen
VKORC1
En cuanto al análisis del polimorfismos 3730G>A en este trabajo, se encontró
que la frecuencia genotípica predominante del SNP en ambos grupos analizados fue
el heterocigoto GA, 60% en pacientes y 59,4% en controles, seguidos de los
individuos con el genotipo homocigoto mutados AA, 24,7% en pacientes y 27,3% en
controles, para finalizar con una frecuencia menor a las anteriores en los
homocigotos normales GG, 15,3% en pacientes y 13,3% en controles (Tabla X). Al
92
comparar la frecuencia genotípica encontrada en esta investigación con la
encontrada en otros trabajos varían en otras poblaciones de pacientes de origen
Europeo (italianos), para encontrar el genotipo homocigoto normal GG en una
frecuencia de 45,5%, para los heterocigotos mutados GA en un 39,5% y para los
portadores homocigotos mutados AA, en un 15% (D’Andrea y col., 2005). En cuanto
a las frecuencias alélicas reportada en este estudio, fue mayor para el alelo G (54,7%
en pacientes y 57% en controles) que para el alelo A (45,3% en pacientes y 43% en
controles) (Tabla X), estos resultados son similares a los reportados en un estudio
realizado en pacientes donde la frecuencia para el alelo G fue de 65,3% y 34,7%
para el alelo A (D’Andrea y col., 2005). A su vez, este reporte fue similar al obtenido
en otro trabajo con pacientes de origen Europeo Americano, donde la frecuencia del
alelo normal G llega a alcanzar un 64,5% (Li y col., 2006). En otro estudio realizado
por Marsh y colaboradores (2006), basados en la clasificación por haplotipos
establecida previamente por Rieder en el 2005, se analizó la frecuencia de algunos
polimorfismos del grupo B, entre ellos el polimorfismo 3730G>A y específicamente la
variante alélica (alelo A). Los resultados de ese análisis para el alelo A (en
frecuencia) realizado en peruanos y mexicanos fueron del 62% y 46%,
respectivamente.
En el análisis de asociación entre la dosis de warfarina y la variante genotípica
encontrada para el SNP 3730G>A, los resultados obtenidos de esta investigación
señalan que están asociadas las dosis de warfarina requeridas por los pacientes de
acuerdo al genotipo característico de cada uno. Específicamente, los pacientes que
poseen el genotipo GG cursan con una dosis media de 4,459 mg/día, aquellos con el
genotipo GA tienden a aumentar a 4,989 mg/día, mientras que aquellos pacientes
con el genotipo homocigoto AA requieren de 5,716 mg/día para establecer un control
estable en su tratamiento. Esto coincide con los resultados encontrados por
D’Andrea y colaboradores (2005) donde las dosis se extienden desde 6,9 mg/dia
para los AA, 5,2 mg/día para los GG hasta 5,3 mg/día para los GA. La dosis
requeridas por los pacientes obtenida producto de la presente investigación son un
poco mas bajas a las reportadas en una población Judía los cuales requerían de una
93
dosis promedio de 8,29 mg/día (Osman y col., 2006). Esta variabilidad genética
encontrada en estos pacientes sólo puede ser explicada por el 3,7% sobre los
diferentes genotipos encontrados para este SNP (Tabla XII). Ésta es un poco menor
a la reportada en 93 pacientes Japoneses donde se encontró en un 8,2% la
contribución de este mismo polimorfismo a la variabilidad de la dosis de droga
suministrada en el grupo de estudio (Kimura y col., 2007).
Se ha reportado que el polimorfismo 3730G>A esta asociado con diferencias
en la dosis promedio prescrita de warfarina (Rieder y col., 2005. D’Andrea y col.,
2005). Tal como se señaló previamente, los pacientes que poseen el genotipo GG
muestran un requerimiento de dosis diaria baja de este anticoagulante. Sin embargo,
bajo la clasificación por haplotipos preestablecida por estos trabajos, éste SNP forma
parte del grupo B que cursa con altas dosis de warfarina para los otros genotipos
posibles de este polimorfismo. Los resultados encontrados para el polimorfismo de
nucleótido simple 3730G>A ubicado en la región 3’ no traducida del gen VKORC1
reflejan una vez mas que las variantes genéticas contribuyen y modulan la dosis
media de warfarina prescrita en pacientes con tratamiento anticoagulante y muestra
la alta variabilidad interindividual de estos requerimientos (D’Andrea y col., 2005).
Esto podría explicarse parcialmente debido a que el polimorfismo ocurre en la región
3’ no traducida del gen VKORC1, una zona importante en la regulación de la
expresión génica, además de estar implicada en la correcta expresión de la proteína,
también esta involucrada en la estabilidad, localización y traducción de los ARN
mensajero (Watson y col., 2004). Probablemente la modificación en el genotipo del
polimorfismo 3730G>A aumenta la estabilidad del mensajero y en consecuencia
habrán mayores niveles de la proteína VKORC1. Si el cambio origina una
modificación de la expresión y en la cantidad de la proteína este efecto finalmente se
ve reflejado en los niveles de carboxilación de los factores de coagulación y por tanto
en la modificación de los requerimientos de anticoagulante, donde se hace necesario
aumentar o ajustar la dosis para tratar efectivamente a los pacientes con trombosis
venosa.
94
Asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1 y Trombosis
Venosa.
Una vez investigado el riesgo de cada genotipo de los polimorfismos estudiado
en la respuesta a la terapia anticoagulante, se procedió a estimar algún grado de
asociación entre estos y la trombosis venosa en la población analizada. Esto fue
investigado por Smadja y colaboradores (2008), los cuales encontraron resultados
que indicaron que no está clara dicha asociación. Estos autores se basaron en la
clasificación de haplotipos establecida por Rieder y colaboradores en el 2005,
señalada previamente. Estudiaron los distintos genotípicos en el SNP -1639G>A,
establecieron la frecuencia de cada genotipo posible y de los alelos y aplicaron un
modelo dominante de herencia para predecir la influencia de estos cambios en el
riesgo a padecer trombosis venosa. Con los resultados de su estudio determinaron
que los genotipos del SNP -1639G>A no influye en el riesgo a padecer trombosis
venosa. Específicamente los resultados de Smadja y colaboradores (2008)
correspondiente a la frecuencia del genotipo GA o AA, del polimorfismo -1639G>A
tanto en casos como en controles estuvo entre un 61% y 65% con un OR=0,85 y un
IC al 95%=0,60-1,21, respectivamente, concluyendo que no hay una asociación clara
entre el polimorfismo que analizaron y el riesgo a trombosis. Los hallazgos obtenidos
por estos autores no coinciden con los conseguidos en esta investigación. En la tabla
XIII, se muestran los resultados al asociar el genotipo y alelo de cada polimorfismo
con el riesgo a padecer trombosis. En todos los casos se determinó que no hubo
asociación estadísticamente significativa entre los genotipos de los polimorfismos del
gen VKORC1 y la patología, excepto para el SNP -1639G>A al aplicar el modelo
recesivo.
Específicamente, el modelo que mejor explica la asociación entre la variante
genotípica de -1639G>A y la patología es el modelo recesivo, donde el OR alcanzó el
valor de 2,250 (p<0,05). Así mismo, al evaluar el modelo aditivo aplicado al mismo
polimorfismo se observó la influencia del alelo A para potenciar este efecto y a pesar
de obtener un cierto riesgo (OR=2) no fue estadísticamente significativo (p=0,091).
Esto permite inferir que a pesar de asociar un modelo en particular de herencia, el
95
riesgo se ve influencia por otros factores, evidenciando una tendencia respecto al
genotipo homocigoto mutado AA y heterocigoto GA del polimorfismo -1639G>A.
Esto indica que aquellos individuos que presenten el alelo mutado del polimorfismo,
es decir que posean el alelo A en su genotipo tienen un mayor riesgo de padecer la
enfermedad, sin embargo y de acuerdo a los resultados obtenidos de esta
investigación (Tabla XII) y a los reportados por otros investigadores (Sconce y col.,
2005. Scott y col., 2008. IWPC, 2009) el poseer el alelo A en su genotipo está
asociado a menor dosis de warfarina, lo cual se contradice con lo esperado.
Por su parte para el polimorfismo 698C>T el modelo de asociación aplicado
fue el co dominante, los resultados muestran que existe una tendencia mas que un
riesgo entre el cambio nucleotídico de este polimorfismo y la trombosis venosa. El
genotipo heterocigoto CT aportó un OR de 1,229, pero no fue estadísticamente
significativo, por lo que no se puede estimar una asociación directa con la patología.
Uno de los polimorfismos que esta asociado a la enfermedad vascular arterial
y venosa es el SNP 2255C>T. Como se mencionó previamente, la presencia del
alelo C con mayor frecuencia, confiere cierta respuesta resistente al fármaco y una
mayor predisposición a la enfermedad (Wang y col., 2006).
En ese mismo estudio
realizado por estos investigadores calcularon en pacientes con trombosis venosa la
frecuencia de los genotipos CT y CC, la cual fue de 18,4%. Obtuvieron el OR para
los mismos genotipos siendo éste de 1,7 (IC 95%= 1,35-2,14). Llegaron a concluir
que el riesgo vascular a presentar la enfermedad es significativamente mas altas en
sujetos con el genotipo CC y CT cuando se les compara con los TT, confiriéndole al
alelo C un riesgo asociado a la enfermedad (Wang y col., 2006).
Al evaluar en esta investigación la asociación entre las variantes genotípicas
de polimorfismo 2255C>T con el riesgo a padecer trombosis venosa, el modelo
recesivo es el que mejor explica la relación que puede causar el cambio nucleotídico
T a la enfermedad. En esta investigación el OR obtenido para los genotipos CT+CC
Vs TT en el modelo de asociación recesivo fue de 1,345, sin embargo, los resultados
96
no fueron estadísticamente significativos (Tabla XIII). Sin embargo se puede sugerir
la presencia de cierta tendencia a sufrir la patología en presencia del alelo mutado
T.
En relación a la evaluación del SNP 3730G>A del gen VKORC1 y la trombosis
venosa en la población estudiada, se encontró que no hay ninguna asociación entre
los diferentes genotipos de éste polimorfismo y la enfermedad, independientemente
del modelo de herencia aplicado (Tabla XIII), a pesar que se ha reportado que éste
SNP pertenece al grupo de polimorfismo que cursa con dosis elevadas de warfarina
y cierta resistencia a este fármaco. Es decir, que no hay asociación entre las
variantes genotípicas o alélicas con la patología y la respuesta al tratamiento.
Así como se ha evaluado la asociación de los diferentes polimorfismos con la
trombosis venosa de manera independiente, también se hizo de manera conjunta
para los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T y se observó que hubo una asociación
entre ellos y la enfermedad. Al evaluar el riesgo manera conjunta se observa que la
presencia
de
los
genotipos
mutados
de
ambos
polimorfismos
aumenta
significativamente el riesgo a padecer trombosis. El OR obtenido fue de 2,703
(p<0,05). Es posible que los cambios que ocurren conjuntamente tanto en la región
promotora como los que puedan observarse en el segundo intrón del gen VKORC1,
estén aumentando el riesgo en los individuos a padecer de la patología trombótica.
En base a esto y a los resultados obtenidos previamente en cuanto a la dosis
requerida de anticoagulante por los pacientes cuando están presentes ambas
modificaciones, se podría inferir que la presencia de los alelos mutados A y T (de los
polimorfismo -1639G>A y 2255C>T) afecta la respuesta farmacológica de la
warfarina explicando así esta variabilidad. Como se determinó que ambos
polimorfismos se encuentran en desequilibrio de unión, no puede determinarse cual
de ellos es responsable del efecto sobre esta variabilidad en la respuesta al
tratamiento. Este desequilibrio de ligamiento entre ambos polimorfismos también fue
encontrado en las poblaciones judías estudiadas por Scott y colaboradores (2008) y
más recientemente por Limdi y colaboradores (2010) quienes evaluaron cual de los
97
SNPs podría explicar en gran medida la variabilidad en la dosis de warfarina
requerida por los pacientes, siendo esencialmente similares, sin embargo, estos
investigadores señalan que es posible discriminar entre los efectos de los
polimorfismos cuando se estudian grupos reciales diferentes.
Asociación de otros factores influyentes en la Trombosis Venosa y la
dosis de warfarina.
La amplia variabilidad interindividual de la respuesta a los fármacos
anticoagulantes como la warfarina, ha permitido desarrollar estudios orientados
inicialmente hacia la farmacocinética, la farmacodinámica y en gran medida dirigidos
a cubrir la base de la farmacogenómica, ya que se han reconocido a los aspectos
genéticos como la principal explicación de esta variabilidad (Belloso y Redal, 2010).
Sin embargo, hay otros factores influyentes, adicionales al componente genético que
se combinan para poder predecir o estimar la dosis ideal de fármaco para cada
paciente con trombosis venosa. Factores intrínsicos y extrínsecos que afectan la
exposición y respuesta al fármaco. Entre los primeros se encuentran la edad, el
origen étnico, el sexo, el peso, el índice de masa corporal, la talla, patologías
diversas como la hipertensión arterial, disfunción orgánica, el embarazo o la
lactancia, entre otros. Podrían detallarse factores extrínsecos como los factores
ambientales, la dieta, el uso de otros fármacos que causen interacciones
farmacológicas, el tabaquismo, el uso de alcohol, entre otros. En conjunto, estos
factores condicionan a cada individuo para establecer una dosis correcta de
anticoagulante oral (Kamali y col, 2004. Molero y col., 2005).
En el presente trabajo, se relacionó
la edad de los individuos con los
requerimientos de la droga, encontrándose que éstos son menores a medida que
aumenta la edad (en años), aunque la proporción es mínima tiene significación
estadística. Estos resultados coinciden con los reportados por Sconce y
colaboradores (2005) quienes obtuvieron una correlación negativa entre los
requerimientos de la dosis y la edad de los pacientes. Los resultados obtenidos de
98
esta investigación también están en concordancia con los datos aportados por un
trabajo recientemente publicado por Le Cam-Duchez y colaboradores (2010), donde
demuestran la influencia de la edad en la dosis de mantenimiento en dos grupos de
pacientes sometidos a estudio, encontrando en ellos el mismo efecto.
En los resultados de este estudio no se encontró una asociación directa entre
otros factores influyentes sobre la patología como el sexo o el uso de otros fármacos
como los anticonceptivos orales (resultados no mostrados), ni se encontró asociación
entre la trombosis venosa con el padecimiento de otras patologías como la
hipertensión arterial o la diabetes mellitus. En consecuencia, es la suma de múltiples
factores más el componente genético, lo que lleva a considerar un incremento en el
riesgo a padecer problemas de hipercoagulabilidad sanguínea.
Cabe resaltar que cuando un individuo inicia tratamiento con anticoagulante
oral (warfarina), debe ajustarse la dosis requerida considerando los factores
intrínsecos y extrínsecos. Una dieta con bajo o alto contenido alimentario de vitamina
K, podría alterar la coagulación por varios mecanismos, inhibiendo o induciendo la
farmacocinética de la warfarina. Aunque hay sólo unas cuantas sustancias que han
demostrado en forma consistente que son capaces de interferir los efectos de la
warfarina en forma clínicamente relevante (Isaza y col., 2010).
Hay investigaciones donde se ha evaluado el efecto de otros factores no
genéticos asociados con la dosis estable de warfarina. La evaluación de los factores
clínicos como la edad, el género, área de superficie corporal, junto con la influencia
de la patología como la diabetes mellitus o enfermedad cardíaca, han explicado
hasta el 56% de la variabilidad en la dosis terapéutica de warfarina (Caldwell y col.,
2007). En otros casos, se ha considerado el efecto de estos factores clínicos y los
mismos pueden explicar el 21,5% de la variabilidad (Gage y col., 2008). Hay
discrepancias entre investigaciones en cuanto al porcentaje de influencia de estos
factores, sin embargo en las poblaciones estudiadas es evidente que hay otros un
aporte importante que no es debido al componente genético (Sconce y col., 2005)
99
Hoy en día, se esta aplicando en los pacientes con trombosis venosa, el uso
de algoritmos que permiten estimar e inferir la dosis adecuada de anticoagulante,
sustentados siempre en la identificación de alguno de los genotipos de los principales
polimorfismos presentes en el gen VKORC1 y considerando las características
clínicas de cada individuo (Le Cam-Duchez, 2010). La construcción de algoritmos
incluye las variables de edad, componente genético (genotipos), variables clínicas
(peso, altura, condición patológica, hábitos tabáquicos, entre otros).
Según los resultados de este estudio y el de otros investigadores, es
recomendable considerar los factores clínicos y los estudios genéticos moleculares
en pacientes con problemas de hipercoagulabilidad, para detectar cambios
polimórficos en el gen VKORC1 antes de iniciar los tratamientos con anticoagulantes
orales, a fin de evitar complicaciones trombóticas o hemorrágicas. Hay evidencias
por investigaciones previas que sustentan que este gen está involucrado y
desempeña un rol significativo en la modulación en la dosis efectiva de
anticoagulante prescrito a los pacientes con trombosis venosa. (Le Cam-Duchez,
2010).
Algunos de estos algoritmos son una herramienta valiosa para los
profesionales de la salud, quienes tienen de manera electrónica la disponibilidad en
la red (on line) para generar la estimación de la dosis adecuada para cada paciente.
De manera general, los reportes obtenidos de esta investigación son los
primeros estudios realizados en Venezuela, donde se asocia la variabilidad genética
y la trombosis venosa, así como la respuesta a la terapia anticoagulante.
Los
resultados obtenidos de este trabajo son de gran utilidad para el medico tratante, ya
que puede ajustar las dosis de warfarina de manera personal a cada uno de sus
pacientes, de acuerdo a la identificación de los genotipos y alelos en los diferentes
polimorfismos estudiados en el gen VKORC1, evitando de esta manera
complicaciones durante la fase de iniciación y mantenimiento del tratamiento con
warfarina.
100
VIII. CONCLUSIONES
ƒ
Las frecuencias genotípicas y alélicas de los cinco polimorfismos en el gen
VKORC1: -1639G>A, 106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A, son similares
entre individuos sanos de la población y pacientes con trombosis venosa.
ƒ
Se determinó que existe desequilibrio de ligamiento entre los polimorfismos
-1639G>A y 2255C>T presentes en el gen VKORC1.
ƒ
No hay asociación entre los diversos genotipos de los polimorfismos en el gen
VKORC1 y la trombosis venosa, excepto para el SNP -1639G>A cuando el
alelo A se encuentra en condición homocigota.
ƒ
Se evidenció una correlación entre las variaciones alélicas de los
polimorfismos -1639G>A y 2255C>T con la dosis de warfarina requerida por
los pacientes con enfermedad trombótica.
ƒ
La edad y la variante genotípica son factores importantes para establecer y
ajustar la dosis de warfarina empleada en pacientes con trombosis venosa
101
IX. RECOMENDACIONES
De acuerdo al análisis realizado y a los resultados obtenidos de esta
investigación, se hace indispensable evaluar a los pacientes con trombosis venosa
de una manera integral, combinando las características clínicas y las variantes
genéticas a fin de establecer el tratamiento más adecuado y la dosificación correcta
antes de iniciar la medicación.
En base a esto, son importantes los estudios genéticos y la evaluación de los
polimorfismos presentes en el gen VKORC1 de los pacientes con problemas de
hipercoagulación (trombóticos), ya que determinar los genotipos de determinado
SNP podría contribuir en gran medida a establecer y ajustar las dosis de
anticoagulante adecuadas, según la variante genotípica de cada individuo, con la
finalidad de evitar efectos adversos o secundarios.
Durante los últimos años, los pacientes con trombosis venosa han sido
tratados siguiendo las indicaciones del Consorcio Internacional de Farmacocinética
de la Warfarina. Se recomienda al personal de salud, aplicar a sus pacientes pruebas
moleculares y algoritmos de dosificación considerando los factores extrínsecos e
intrínsecos para identificar y establecer la terapéutica de warfarina que más se
adapte a las necesidades de cada sujeto.
102
X. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
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109
XI. FINANCIAMIENTO
Esta investigación fue financiada por:
ƒ
Fondos provenientes del Proyecto Fonacit G2005000398
ƒ
El Decanato de Estudios de Postgrado de la Universidad Simón Bolívar
por medio de la ayuda económica para trabajos finales de grado,
especialización
técnica,
especialización
profesional,
maestría
y
doctorado.
ƒ
Quimbiotec,
C.A.
del
Instituto
Venezolano
de
Investigaciones
Científicas (IVIC), a través del Programa de Ayuda al Desarrollo
Profesional del Personal de la Empresa.
110
XII. ANEXOS
111
ANEXO 1
PLANILLA DE CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN DE PACIENTES Y
CONTROLES INCORPORADOS EN LA INVESTIGACIÓN Y EN EL DIAGNÓSTICO
MOLECULAR DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS ASOCIADOS A LA
TROMBOSIS ARTERIAL Y VENOSA
112
113
114
115
ANEXO 2
PLANILLA DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE
PACIENTES Y CONTROLES INCORPORADOS EN LA INVESTIGACIÓN Y EN EL
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS ASOCIADOS A
LA TROMBOSIS ARTERIAL Y VENOSA
116
N° Registro________
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
División de Ciencias Biológicas
Departamento de Biología Celular
Laboratorio de Genética Molecular Humana B
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS ASOCIADOS A LA
TROMBOSIS ARTERIAL Y VENOSA
I. Datos de identificación del paciente
Apellidos:______________________________,
Nombres:____________________________________,
F.N____________, Sexo: F_____ M_____, Edad:_______, Referido por:
HMPC_____BMS________,
Lugar de Nacimiento______________________,
Teléfono________________/____________________,
Dirección__________________________________________________________________________
__,
Fecha de Ingreso_________________________, N° Historia
Hospital:__________________________,
Diagnóstico Clínico: Trombosis arterial (IAM____TAP____ACV____); Trombosis venosa
(TVP______
TEP____); Hemofilia
(A____B____);Otro__________________________________________________
(IAM: infarto agudo del miocardio, TAP: trombosis arterial periférica, ACV: accidente cerebrovascular, TVP:
trombosis venosa profunda, TEP: tromboembolismo pulmonar)
Polimorfismos a determinar: FI (-455G/A___ -854G/A___BclI___448G/A___), FII(20210G/A____
19911G/A____), FV (1691G/A___), FVII (353G/A____), FVIII (_________), FIX(________)
FXIII
(Val34Leu
___),
Otros___________________
II. Diagnóstico de Ingreso
MTHFR
(677C/T___1298A/C___),
PAI
1
(4G/5G___),
117
SCA con elev del ST:
IM Q
Localización
Clase KK
TIMI
SCA sin elev del ST:
Ang Ines
Tipo Braunwald
TIMI
IM no Q
TIMI
CKK
Localización
Tromboembolismo Pulmonar
Trombosis Venosa Profunda
III. Antecedentes Personales
Hábito Tabáquico
Asma
HTA
Dibetes Mellitus
Cardiopatía isquémica
Cateterismo
Infarto Agudo del Miocardio previo
C. Post Bypass
IRC
Enfermedad Arterial Periférica
Valvulopatía
Angina de Pecho
Angina de esfuerzo
ACV
Trombosis Miembros Inferiores
Hemorragias
Hipercolesterolemia
Hipertrigliceridemia
Hiperhomocisteinemia
Hiperhomocisteinuria
Condición Postmenopáusica
Obesidad
Uso Anticonceptivos Orales o
Terapia Sustitutiva
Enfermedades ginecológicas de base
Cirugía Previa
IV. Bioquímica
Proteínas T
Albúmina
Globulinas
Colesterol T
Triglicéridos T
HDLc
LDLc
VLDLc
Glicemia
Úrea
Creatinina
PCR
Antifosfolípidos
Folato, B12
PT
PTT
Niveles de FI
Niveles de FII
Niveles de FV
Niveles de FVIII
Niveles de FIX
CKT
CKMB
Troponina T
Otros
118
Historia familiar de Trombosis
Nefropatía
Otros
V. Tratamiento
Aspirina
Clopidogel
Ticlodipina
Heparina BPM
Tipo:
Anticoagulantes orales:
Tipo:
Nitratos:
Nitratos VEV (horas)
Nitratos VO
Beta Bloqueante:
Tipo:
Estatina:
Tipo:
Antihipertensivos
Otros
VI.Observaciones:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
______________
119
ANEXO 3
ANÁLISIS DE SECUENCIAS
Verificación de cambios nucleotídicos y genotípicos en algunas muestras de
pacientes con los diferentes polimorfismos de nucleótidos simples presentes en el
gen VKORC1 por secuenciación de productos de PCR
ANEXO 3.1 Análisis de secuencias del SNP -1639G>A en el gen VKORC1
En el perfil del electroferograma señalado a continuación, se observa el
genotipo de un paciente homocigoto mutado AA del SNP -1639G>A.
De esta
manera se verificaron algunos genotipos por secuenciación para este polimorfismo.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP -1639G>A en pacientes con Trombosis Venosa.
Electroferogramas de secuencias parciales de un paciente homocigoto mutado AA. Se muestra con
flechas el lugar de la mutación y el nucleótido cambiado.
Así mismo, como parte del análisis se corroboraron algunos genotipos
heterocigotos por secuenciación. (Anexo 3.1.1).
120
ANEXO 3.1.1 Análisis de secuencias del SNP -1639G>A en el gen VKORC1
Electroesferograma obtenido al analizar el genotipo de un paciente en
condición heterocigoto mutado para el polimorfismo -1639G>A.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP -1639G>A en un paciente con Trombosis
venosa. Electroferogramas de secuencias parciales de un paciente heterocigoto mutado GA. Se
muestra con flechas el lugar de la mutación y el cambio nucleotídico.
Como parte de un análisis complementario, se realizó el alineamiento de las
secuencias y se obtuvo una secuencia denominada consenso, identificada con
puntos y asteriscos (Anexo 3.1.2). Este análisis permite visualizar en el resultado el
cambio del alelo G por el alelo A en todas las muestras seleccionadas, a las cuales
121
se les determinaron un genotipo homocigoto mutado AA, excepto para la muestra
PX123 FyR, la cual expresa el genotipo identificado como heterocigoto mutado GA.
ANEXO 3.1.2 Análisis por alineamiento de secuencias de muestras de algunos
pacientes con el SNP -1639G>A en el gen VKORC1
Empleando un conjunto de herramientas informáticas para el análisis de
secuencias se obtuvo la alienación de las mismas y finalmente la creación de una
secuencia consenso para el SNP -1639G>A en este conjunto de muestras.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP -1639G>A en pacientes con Trombosis venosa.
Alineamiento de secuencias parciales de pacientes homocigotos mutados: AA y de un paciente
heterocigoto mutado: GA (recuadro rojo). Se muestra con una flecha el lugar de la mutación y el
cambio nucleotídico.
122
ANEXO 3.2 Análisis de secuencias del SNP 106G>T en el gen VKORC1
Se muestra un electroferograma con la secuencia parcial de un paciente con
el genotipo homocigoto normal GG para el polimorfismo 106G>T.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 106G>A en pacientes con Trombosis Venosa.
Electroferogramas de secuencias parciales de un paciente homocigoto normal GG representativo de
toda la población. Se muestra con flechas los lugares conservados sin cambio nucleotídico.
Pueden ser observadas en el anexo 3.2.1, mediante el uso de los programas
informáticos de alineamiento, las secuencias de las muestras analizadas, mostrando
en su totalidad el genotipo en condición homocigotos normales GG para el
polimorfismo 106G>T y la obtención de una secuencia consenso.
123
ANEXO 3.2.1 Análisis por alineamiento de secuencias de muestras de algunos
pacientes con el SNP 106G>T en el gen VKORC1
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 106G>A en pacientes con Trombosis venosa.
Secuencias parciales de pacientes homocigotos normales (GG) representativos de toda la población.
Se muestra con flechas los lugares conservados sin cambio nucleotídico. En el parte inferior se
observa la secuencia consenso (con asteriscos) de algunos pacientes secuenciados.
124
ANEXO 3.3 Análisis de secuencias del SNP 698C>T en el gen VKORC1
En una de las muestras analizadas para el polimorfismo 698C>T (muestra del
paciente 12), se confirmó el genotipo heterocigoto para este polimorfismo. El
electroferograma de este paciente puede apreciarse a continuación.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 698C>T en pacientes con Trombosis venosa.
Electroferograma de secuencia parcial de un paciente heterocigoto mutado C>T. Se muestra con
flechas el lugar conservado y el sitio del cambio nucleotídico.
De manera similar, con las secuencias obtenidas de los pacientes, se realizó
empleando las herramientas informáticas un alineamiento de ciertas muestras para
crear finalmente una secuencia consenso (ver anexo 3.3.1), donde puede apreciarse
además un cambio nucleotídico adicional, previo al estudiado para este SNP.
125
ANEXO 3.3.1 Análisis por alineamiento de secuencias de muestras de algunos
pacientes con el SNP 698C>T en el gen VKORC1
Se realizó el alineamiento de ciertas muestras para crear una secuencia
consenso. La muestra del paciente 12 presenta un cambio nucleotídico en uno de los
alelos, clasificándolo como heterocigoto mutado G>T.
G>C
SNP 698C>T
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 698C>T en pacientes con Trombosis venosa.
Secuencias parciales de pacientes con trombosis venosa. Se muestra con flechas lugares
conservados y el sitio del cambio nucleotídico. En el panel inferior la secuencia consenso, junto a la
del paciente Px12FIII698 y PX12RIII698 heterocigoto mutado (encerrada en recuadro rojo).
Se muestra con flechas el lugar de cambios de nucleótidos y cobra real
atención un cambio nucleotídico en la secuencia de dos pacientes: Px97 y Px12;
diferente a la identificada como 698C>T, ubicada 33 nucleótidos antes del SNP
estudiado. El polimorfismo observado es 665G>C.
126
ANEXO 3.4 Análisis de secuencias del SNP 2255C>T en el gen VKORC1
En el electroferograma mostrado a continuación se observa la presencia del
alelo T del polimorfismo 2255C>T.
Análisis de secuencia del polimorfismo SNP 2255C>T en pacientes con Trombosis venosa.
Electroferogramas de secuencias parciales de un paciente homocigoto mutado TT.
En particular, todas las muestras secuenciadas resultaron ser del genotipo
homocigoto mutado TT. Aunque el patrón de alineamiento de secuencias no esta
completo por provenir de lecturas cortas (Anexo 3.4.1), se pudo confirmar los
cambios polimórficos al sustentarse en la combinación con otras técnicas
moleculares descritas previamente (PCR-RFLP).
127
ANEXO 3.4.1 Análisis por alineamiento de secuencias de muestras de algunos
pacientes con el SNP 2255C>T en el gen VKORC1
De manera similar a los polimorfismos anteriores, se realizó una verificación
de los cambios nucleotídicos presentes en las muestras analizadas para el
polimorfismos 2255C>T. En este caso, las secuencias alineadas confirmaron un
cambio nucleotídico en al menos uno de sus alelos. Con una flecha se muestra la
posición donde se genera el cambio en estas muestras.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 2255C>T en pacientes con Trombosis venosa.
Alineamiento de secuencias de pacientes determinados previamente por RFLP como homocigotos
mutados (TT) para el SNP 2255C>T.
128
ANEXO 3.5 Análisis de secuencias del SNP 3730G>A en el gen VKORC1
En la Figura 30 se observa una muestra representativa de las secuencias
analizadas para el SNP 3730G>A. En este caso permitió verificar que los pacientes
seleccionados son portadores del genotipo homocigoto normal GG de este
polimorfismo.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 3730G>A en pacientes con Trombosis Venosa.
Electroferogramas de secuencias parciales de un paciente homocigoto normal GG. Se muestra con
flechas el lugar conservado donde no hay cambio nucleotídico.
Finalmente, al emplear las herramientas informáticas para el alineamiento de
secuencias, se confirma que el cambio nucleotídico no esta presente en las muestras
analizadas para el SNP 3730G>A, apoyando los resultados obtenidos por PCRRFLP.
129
ANEXO 3.5.1 Análisis por alineamiento de secuencias de muestras de algunos
pacientes con el SNP 3730G>A en el gen VKORC1
Se observa en el alineamiento una muestra representativa de total de
pacientes analizados. Estas secuencias indican que los pacientes seleccionados
expresan el genotipo homocigoto normal.
Se señala con puntos los nucleótidos
conservados y con asterisco la secuencia consenso obtenida luego del análisis. Con
flechas se indica la posición donde puede ocurrir la variante nucleotídica, no presente
en estas muestras seleccionadas al azar.
Análisis de secuencias del polimorfismo SNP 3730G>A en pacientes con Trombosis Venosa.
Alineamiento de secuencias de pacientes determinados como homocigotos normales GG para el SNP
3730G>A.
130
ANEXO 4
ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN ENTRE LA EDAD DE LOS PACIENTES CON
TROMBOSIS VENOSA Y LOS REQUERIMIENTOS DE ANTICOAGULANTE ORAL
(DOSIS DE WARFARINA)
ANÁLIS DE ASOCIACIÓN ENTRE LA EDAD DE LOS
PACIENTES CON TROMBOSIS VENOSA Y LA DOSIS DE
ANTICOAGULANTE ORAL (WARFARINA)
Grupo Pacientes
Prueba
Correlación
de Pearson
P
– 0,193
Nivel
Significativo
0,023
p ≤ 0,05
Rho de
Spearman
– 0,196
0,027
131
ANEXO 5
Análisis de asociación entre los Polimorfismos de Nucleótidos Simples
-1639G>A y 2255C>T en el gen VKORC1 en los grupos control y pacientes.
ASOCIACIÓN ENTRE -1639G>A Y 2255C>T
Grupo Control
Grupo Pacientes
Prueba
p
P
χ2
98,560
191,639
Exacto de
Fisher
89,909
167,869
< 0,0001
< 0,0001
Razón de
Verosimilitudes
98,590
175,325
Asociación
Lineal
62,610
102,802