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DUPLICACIÓN Y SILENCIAMIENTO DEL GEN ACETOHIDROXIÁCIDO S I N TA S A ( A H A S ) E N E L TETRAPLOIDE Chenopodium quinoa Camilo Mestanza Uquillas IV Congreso Mundial de la Quinua Ibarra – Ecuador 2013 La quínoa es pseudocereal de alto valor alimenticio. Descrita como el alimento de origen vegetal más completo para la nutrición humana. www.balancedlivingmag.com 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 FAOSTAT, 2012 2500 2000 1500 1000 500 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Los potenciales productivos para quínoa en Chile son altos. En siembras comerciales con la variedad Regalona-Baer se llega a rendimientos de sobre 3 t ha-1 y en ensayos se han sobrepasado las 8 t/ha (Martínez y col., 2007). La quínoa posee factores que impiden su masificación. El control de malezas, dado que no existe un herbicida que actúe de manera adecuada en este cultivo, ya que muchos de los herbicidas utilizados con este fin no son selectivos. www.inforjardin.com Chenopodium hircinum Chenopodium quinoa Chenopodium album Aguerrea (1998), concluye que los rendimientos de quínoa disminuyen cuando compite con malezas, logrando tan solo el 9% de rendimiento, y un 50% de la producción al aplicar herbicidas. Cultivos resistentes a herbicidas han ayudado a solventar en gran parte este inconveniente. Entre los principales cultivos tenemos los Ready® y Clearfield ®. Tabla 1 Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas de los grupos Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la enzima AHAS). Dominio Aminoácido y posición a (C) VFAYPGGNANSMEIHQALTRS Ala122 (A) AITGQVPRRMIGT Pro197 (D) AFQETP Ala205 Zona intermedia Asp376 (B) QWED Trp574 Nivel de Resistencia Sustitución Ser653 (E) IPSGG Gly-654 Thr Tyr His Thr Arg Leu Gln Ser Ala Ile Met Lys Trp Val Asp Glu Leu Arg Asp Thr Asn Ile Glu Asp Sulfonilureas (SU) S MR R R R R R R R R R R R MR/S R R/MR R R MR S/MR S/MR MR ? S Imidazolinonas (IMI) R R S/MR S/MR S R/MR/S S S S MR ? ? ? R/MR ? R R R R R R R R R a Numeración en base a la secuencia de A. thaliana Cultivos comerciales denominados Clearfield FUENTE: Kogan y Pérez, 2004; Powles y Yu., (2010) La quínoa es un miembro de la familia Amarantaceae. Cuenta con numerosas especies silvestres emparentadas con el número de cromosomas de 2n = 18, 36 y 54. De acuerdo a su origen genético C. quinoa es un alotetraploide (2n = 4x = 36) formado por hibridación interespecífica de dos genomios de especies diploides y una posterior duplicación. Dado que es una especie alotetraploide, la quinua alberga por lo menos dos loci homeólogos AHAS. Caracterizar la familia génica que codifica la enzima AHAS en plantas de Chenopodium quinoa. Material vegetal: Se emplearon plantas variedad Regalona Baer. Selección y diseño de partidores para la amplificación del gen AHAS -‐ Partidores de otros trabajos en especies cercanas -‐ Diseño basado en secuencias conservadas à alineamiento Esquema del anclaje de los partidores empleados para amplificar el gen AHAS en C. quinoa. Análisis de secuencias. La confirmación de la identidad. Búsqueda de Polimorfismos en cromatogramas (sugiere poliploidía) Clonación y secuenciación kit pGEMT Easy Vector (Promega) Análisis de clonación Traducción de secuencias Comparación de cambios Árboles filogenéticos Validación de las copias de genes AHAS Empleando enzimas de restricción (Fermentas) Southern Blot (Biotin DecaLabel™ DNA Labeling Kit) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la amplificación del gen AHAS en C. quinoa. INESPECÍFICA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL GEN AHAS EN C. quinoa (Secuencia consenso) Los fragmentos de PCR seleccionados para la secuenciación directa abarcaron un tamaño cercano a las 2000 pb. Gen AHAS en C. quinoa no está interrumpido por intrones con de 667 aa. VARIACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN AHAS EN C. quinoa (Posterior a la clonación) - CQALS1 CQALS2 CQALS3 CQALS4 CQALS5 CQALS6 - 2238ALS1 2237ALS2 Secuencias obtenidas de cDNA, facilitadas por el laboratorio de la Universidad de Chile. - La existencia de variantes del gel AHAS en C. quinoa podrían ser esperables, si consideramos distintos puntos: I: fundamentando la tetraploidía de C. quinoa y que por lo tanto puede poseer hasta cuatro variantes alélicas de un mismo gen. II: de acuerdo a los análisis de la secuencia de CQALS3, un segmento es homólogo a CQALS1 y otro a CQALS2 à señal de duplicación Esta duplicación génica podría haber ocurrido luego de un apareamiento de cromosomas homeólogos, un posterior “crossingover” acompañado por un intercambio genético de los subgenomas. Dado que, los genes duplicados tienen distintos destinos Wendel, 2005) las variantes puede ser: i) una isoforma silenciada (?). ii) Isoforma retenida que conserva su función original. iii) Isoforma retenida subfuncionalizada. iv) Isoforma con una nueva función (neofuncionalización) (?). (Adams y VALIDACIÓN DE COPIAS Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de los fragmentos AHAS en C. quinoa resultantes de la digestión con las enzimas SexAI (flecha roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha azul) y BspPI (flecha negra) en la variedad Regalona-Baer. Detección de tres copias del gen AHAS en C. quinoa variedad RegalonaBaer empleando endonucleasas. (ADN sin digerir, Marcador, y Digestion). CQALS1 CQALS2 CQALS2 CQALS3 Southern Blot Membrana al finalizar la detección. Análisis de las bandas con la ayuda del programa UN-SCAN-IT gel 6.1 - Se lograron describir 6 copias distintas del gen AHAS en quínoa - La secuencia de gen AHAS no posee intrones - Las secuencias aisladas forman tres grupos - Al menos una de las copias presenta el marco de lectura modificado, siendo una copia silenciada Se hacen necesarios más análisis para seguir profundizando y resolver algunas inquietudes: Organización: - ¿3 en cada genomio diploide? - Número de repeticiones en tandem Expresión: - Dos copias con similares expresiones - Más de dos copias expresadas - Expresión en tejidos y etapa específica de alguna copia Un mayor número de copias puede representar una ventaja dentro del proceso del mejoramiento genético. Al aumentar el número de alelos ALS-mutantes es factible lograr un efecto aditivo, mejorando los niveles de resistencia a herbicidas. GRACIAS