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DUPLICACIÓN Y SILENCIAMIENTO
DEL GEN ACETOHIDROXIÁCIDO
S I N TA S A ( A H A S ) E N E L
TETRAPLOIDE Chenopodium quinoa
Camilo Mestanza Uquillas
IV Congreso Mundial de la Quinua
Ibarra – Ecuador
2013
La quínoa es pseudocereal de alto valor alimenticio. Descrita
como el alimento de origen vegetal más completo para la
nutrición humana.
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8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 FAOSTAT, 2012
2500 2000 1500 1000 500 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Los potenciales productivos para quínoa en Chile son altos. En
siembras comerciales con la variedad Regalona-Baer se llega a
rendimientos de sobre 3 t ha-1 y en ensayos se han sobrepasado las
8 t/ha (Martínez y col., 2007).
La quínoa posee factores que impiden su masificación.
El control de malezas, dado que no existe un herbicida que
actúe de manera adecuada en este cultivo, ya que muchos de
los herbicidas utilizados con este fin no son selectivos.
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Chenopodium hircinum
Chenopodium quinoa
Chenopodium album
Aguerrea (1998), concluye que los rendimientos de quínoa
disminuyen cuando compite con malezas, logrando tan solo el
9% de rendimiento, y un 50% de la producción al aplicar
herbicidas.
Cultivos resistentes a herbicidas han ayudado a solventar en
gran parte este inconveniente.
Entre los principales cultivos tenemos los Ready® y Clearfield
®.
Tabla 1 Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas
de los grupos Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la enzima
AHAS).
Dominio
Aminoácido y
posición a
(C) VFAYPGGNANSMEIHQALTRS
Ala122
(A) AITGQVPRRMIGT
Pro197
(D) AFQETP
Ala205
Zona intermedia
Asp376
(B) QWED
Trp574
Nivel de Resistencia
Sustitución
Ser653
(E) IPSGG
Gly-654
Thr
Tyr
His
Thr
Arg
Leu
Gln
Ser
Ala
Ile
Met
Lys
Trp
Val
Asp
Glu
Leu
Arg
Asp
Thr
Asn
Ile
Glu
Asp
Sulfonilureas
(SU)
S
MR
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
MR/S
R
R/MR
R
R
MR
S/MR
S/MR
MR
?
S
Imidazolinonas
(IMI)
R
R
S/MR
S/MR
S
R/MR/S
S
S
S
MR
?
?
?
R/MR
?
R
R
R
R
R
R
R
R
R
a Numeración en base a la secuencia de A. thaliana
Cultivos comerciales denominados Clearfield
FUENTE: Kogan y Pérez, 2004; Powles y Yu., (2010)
La quínoa es un miembro de la familia Amarantaceae.
Cuenta con numerosas especies silvestres emparentadas con
el número de cromosomas de 2n = 18, 36 y 54.
De acuerdo a su origen genético C. quinoa es un
alotetraploide (2n = 4x = 36) formado por hibridación
interespecífica de dos genomios de especies diploides y una
posterior duplicación.
Dado que es una especie alotetraploide, la quinua alberga por
lo menos dos loci homeólogos AHAS.
Caracterizar la familia génica que codifica la enzima AHAS en
plantas de Chenopodium quinoa.
Material vegetal: Se emplearon plantas variedad Regalona Baer.
Selección y diseño de partidores para la amplificación del gen AHAS -­‐ Partidores de otros trabajos en especies cercanas -­‐ Diseño basado en secuencias conservadas à alineamiento Esquema del anclaje de los partidores empleados para amplificar el gen AHAS en C.
quinoa. Análisis de secuencias.
La confirmación de la identidad.
Búsqueda de Polimorfismos en cromatogramas (sugiere poliploidía)
Clonación y secuenciación kit pGEMT Easy Vector (Promega)
Análisis de clonación
Traducción de secuencias
Comparación de cambios
Árboles filogenéticos
Validación de las copias de genes AHAS
Empleando enzimas de restricción (Fermentas)
Southern Blot (Biotin DecaLabel™ DNA Labeling Kit) Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la
amplificación del gen AHAS en C. quinoa.
INESPECÍFICA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL GEN AHAS EN C. quinoa
(Secuencia consenso)
Los fragmentos de PCR seleccionados para la secuenciación directa
abarcaron un tamaño cercano a las 2000 pb.
Gen AHAS en C. quinoa no está interrumpido por intrones con de 667
aa.
VARIACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN AHAS EN C. quinoa
(Posterior a la clonación)
- CQALS1
CQALS2
CQALS3
CQALS4
CQALS5
CQALS6
- 2238ALS1
2237ALS2
Secuencias obtenidas de cDNA, facilitadas
por el laboratorio de la Universidad de Chile.
- La existencia de variantes del gel AHAS en C. quinoa podrían ser
esperables, si consideramos distintos puntos:
I: fundamentando la tetraploidía de C. quinoa y que por lo tanto
puede poseer hasta cuatro variantes alélicas de un mismo gen.
II: de acuerdo a los análisis de la secuencia de CQALS3, un
segmento es homólogo a CQALS1 y otro a CQALS2 à señal de
duplicación
Esta duplicación génica podría haber ocurrido luego de un
apareamiento de cromosomas homeólogos, un posterior “crossingover” acompañado por un intercambio genético de los subgenomas.
Dado que, los genes duplicados tienen distintos destinos
Wendel, 2005) las variantes puede ser:
i) una isoforma silenciada (?).
ii) Isoforma retenida que conserva su función original.
iii) Isoforma retenida subfuncionalizada.
iv) Isoforma con una nueva función (neofuncionalización) (?).
(Adams y
VALIDACIÓN DE COPIAS
Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de los
fragmentos AHAS en C. quinoa resultantes de la digestión con las enzimas SexAI
(flecha roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha azul) y BspPI (flecha negra) en
la variedad Regalona-Baer.
Detección de tres copias del gen AHAS en C. quinoa variedad RegalonaBaer empleando endonucleasas. (ADN sin digerir, Marcador, y Digestion).
CQALS1
CQALS2
CQALS2
CQALS3
Southern Blot Membrana al finalizar la detección.
Análisis de las bandas con la ayuda del programa UN-SCAN-IT gel 6.1
-  Se lograron describir 6 copias distintas del gen AHAS en
quínoa
-  La secuencia de gen AHAS no posee intrones
- Las secuencias aisladas forman tres grupos
- Al menos una de las copias presenta el marco de lectura
modificado, siendo una copia silenciada
Se hacen necesarios más análisis para seguir profundizando y
resolver algunas inquietudes:
Organización:
- ¿3 en cada genomio diploide?
-  Número de repeticiones en tandem
Expresión:
- Dos copias con similares expresiones
- Más de dos copias expresadas
- Expresión en tejidos y etapa específica de alguna copia
Un mayor número de copias puede representar una ventaja dentro del
proceso del mejoramiento genético. Al aumentar el número de alelos
ALS-mutantes es factible lograr un efecto aditivo, mejorando los
niveles de resistencia a herbicidas.
GRACIAS