Download Caracterización genotípica del gen RHCE

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Secretaría de Investigación y Posgrado
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
Caracterización genotípica del gen RHCE
TESIS
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de
Maestría en Ciencias Químicobiológicas
Presenta
QFB. Jazmín Ivette Cruz Reyes
Directores de tesis
Dr. Héctor A. Baptista González
Dra. Elba Reyes Maldonado
México, D. F., Enero de 2010.
Este trabajo fue realizado en el servicio de Hematología Perinatal del Instituto
Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud, en el Banco de Sangre del
Hospital Médica Sur y en el laboratorio de Hematopatología de la Escuela Nacional
de Ciencias Biológicas, bajo la dirección del Dr. Héctor A. Baptista González y la
Dra. Elba Reyes Maldonado.
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgarme una beca
durante 24 meses para la realización de este proyecto con número de de becario
212358. También agradezco al Programa Integral de Fortalecimiento Institucional,
el cual también me apoyó durante 12 meses con una beca bajo el proyecto con
clave 20080640.
Mi agradecimiento especial para:
Dr. Héctor A. Baptista González
Dra. Elba Reyes Maldonado
Dra. Fany Rosenfeld Mann
QBP. Rocío Trueba Gómez
M. en C. Maribel Acosta Tejeda
Dra. Ethel A. García Latorre
Dra. Ruth Lezama Palacios
M. en C. Luisa Bermejo Martínez
M. en C. Carmen Acuña González
Biol. Georgina Coeto Barona
QFB. Carmen Santamaría Hernández
Lic. Carlos Alberto Carrero Sánchez
Por compartirme sus experiencias, enseñanzas y brindarme su apoyo para la realización de
este proyecto.
Al Instituto Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud.
Al Servicio de Medicina Transfusional y Banco de Sangre del
Hospital Médica Sur.
A la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del
Instituto Politécnico Nacional.
INDICE
Página
Abreviaturas
Índice de figuras
Índice de tablas
Resumen
Abstract
I. Introducción
Grupos sanguíneos
Marco histórico
Genes RH
Gen RHCE
Proteínas Rh
Nomenclatura
Justificación
Planteamiento del problema
Pregunta de investigación
Hipótesis
Objetivo general
Objetivos particulares
II. Material y métodos
Población de estudio. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación
Métodos
Obtención de muestras
Fenotipificación de RhCE
Extracción de DNA
Genotipificación del gen RHCE
Estrategias moleculares
Condiciones de PCR
Estandarización de las técnicas de PCR
PCR en tiempo real
Detección de los alelos RHc y RHC
Detección del alelo RHE/e
Tamaño de muestra y análisis estadístico
III. Resultados
Determinación de RHc
Determinación de RHC
Determinación de RHE/e
Concordancia
No concordancia
IV. Discusión
V. Conclusiones
VI. Perspectivas
VII. Referencias bibliográficas
ii
iv
v
vi
vii
1
1
2
3
5
6
8
10
11
11
12
12
12
13
13
13
15
15
20
21
21
22
23
23
25
27
29
32
32
33
33
34
40
42
46
47
48
i
Abreviaturas
Abreviatura
Descripción
3’-UTR
Región 3’ no traducida (del inglés 3’ untranslated region)
5’-UTR
Región 5´no traducida (del inglés 5´untranslated region)
Dia /Dib
Antígenos Diego a /b de la proteína Diego
EHRN
Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido
Fc (γR1)
Receptor 1γ de la fracción cristalizable de los anticuerpos
FcRn
Receptor neonatal Fc
FRET
Transferencia de energía de resonancia fluorescente (del inglés
Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Fya/Fyb
Antígenos Duffy a/b de la proteína Duffy
GPI
Glicosilfosfatidilinositol
ISBT
Sociedad internacional de transfusión sanguínea (del inglés Internacional
Society of Blood Transfusion)
K/k
Antígenos Kell/cellano de la proteína Kell
Kpa/Kpb
Antígenos Penny/Rautenberg de la proteína Kell
PCR-RFLP
Reacción en cadena de la polimerasa con patrón de la longitud de
enzimas de restricción
PCR-SSP
PCR alelo específica
RhAG
Proteína RhAG
RHAG, RHBG,
RHCG
Genes de las glicoproteínas asociadas al Rh, RhAG, RhBG y RhCG
RHCE
Gen RHCE
RhCE
Antígenos o proteínas C, c, E y e
RHD
Gen RHD
RhD
Antígeno o proteína D
RHDψ
Pseudogen Phi del RHD
SMP1
Proteína pequeña de membrana 1 (del inglés small membrane protein 1).
ii
SNP
Polimorfismos de un solo nucleótido (del inglés Single nucleotide
polymorphism)
THE-1B
Elemento humano tipo transposón
ADNoteca
Banco de DNA del Servicio de Hematología Perinatal del INPer
iii
Índice de figuras
No.
Figura
Descripción
No.
Página
1
Membrana eritrocitaria.
1
2
Orientación opuesta de los genes RHD y RHCE, enfrentados en su
posición 3`.
Organización cromosómica de las cajas Rhesus.
4
6
5
Proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos identificados por un
círculo y los sitios de palmitoilación.
Estrategia de trabajo.
6
Tarjeta DG gel.
16
7
17
8
Aspecto de la reacción con diferentes grados de aglutinación en la tarjeta
DG gel.
Procesador Diana Gel.
9
Impreso de la fotografía de las reacciones de aglutinación en gel.
19
10
Diagrama de operación del termociclador - fluorómetro
24
11
24
12
Capilares de borosilicato, adición de reactivos, colocación de capilares en
el carrusel, colocación del carrusel, desarrollo de la reacción.
Equipo LightCycler.
13
Principio de las sondas de hidrólisis TaqMan®
27
14
Principio de las sondas de hibridación HybProbe®
29
15
Curva de Amplificación del alelo RHc.
32
16
Curva de Amplificación del alelo RHC.
33
17
Análisis de las curvas de disociación para RHE/e.
34
3
4
4
14
18
25
iv
Índice de tablas
No.
Tabla
Descripción
No.
Página
1
Nomenclatura del sistema Rh según Fisher/Race y Wiener.
8
2
Fenotipos posibles dentro del sistema Rh.
9
3
10
4
Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión
Sanguínea (ISBT) de los antígenos del sistema Rh.
Estrategias moleculares usadas.
5
Condiciones de PCR usadas para todos los ensayos.
22
6
Total de muestras en ADNoteca ordenadas por código de fenotipo.
30
7
Distribución de la muestras por alelos y definición del tamaño de muestra.
31
8
Concordancia entre el fenotipo y el genotipo para el gen RHCE.
35
9
Concordancia por alelo C.
36
10
Concordancia por alelo E.
36
11
Concordancia por fenotipo.
37
12
Concordancia por genotipo.
38
13
Características de los casos que no concordaron.
40
14
Comparación entre la concordancia en la identificación genotípica y
fenotípica en el grupo sanguíneo RhCE por otros autores y la obtenida en
este estudio.
42
22
v
Resumen
En el campo de la medicina transfusional, es importante el estudio y la
determinación de los grupos sanguíneos ABO y Rh en los donadores y en los
pacientes que se someten a transfusiones o trasplantes, en el estudio de las anemias
hemolíticas, como la Anemia Hemolítica Autoinmune y la Enfermedad Hemolítica del
Recién Nacido. En el ámbito antropológico son considerados como marcadores de
identidad poblacional o genética. Se han realizado algunos estudios en relación al
fenotipo del sistema Rh en población mexicana, sin embargo, a la fecha no se han
caracterizado los genotipos con el fin de determinar la correlación existente entre
ambos estudios y poder usarlos como herramienta en estudios clínicos y de
poblaciones.
Objetivo: Caracterizar genotípicamente el gen RHCE por PCR en tiempo real,
comparar los resultados con el fenotipo y determinar la concordancia.
Material y métodos: Las muestras de ADN se obtuvieron de donadores del Hospital
Médica Sur y del INPer. De acuerdo a las frecuencias fenotípicas de 1638 muestras
se definió el tamaño muestral que fue de 190. Se usó PCR en tiempo real para
caracterizar los alelos C, c, E y e utilizando el LightCycler®. Se usaron sondas de
hibridación LightCycler FastStart DNA Master HybProbe para los alelos E/e; mientras
que para C y c se usaron sondas LightCycler TaqMan Master. Las 190 muestras se
clasificaron por fenotipos y también por alelos. Se estandarizaron las pruebas con
controles conocidos.
Resultados: Se realizó el análisis estadístico de acuerdo al fenotipo, se observó una
concordancia del 100% en 7 fenotipos de 15 posibles, los otros 8 mostraron una
concordancia no menor al 80%. En cuanto al análisis por alelos, se obtuvo una
concordancia para cc del 95.5%, para Cc de 96.2% y para CC de 95.7%; mientras
que para el alelo ee fue de 96.2%, para Ee de 92.1% y para EE del 100%. En cuanto
al análisis por grupo RhD, se obtuvo un 93.6% de concordancia para el grupo de
negativos y de 96.4% para los positivos. 8 muestras no concordaron, por lo que se
investigó a estos 8 casos que no concordaron entre fenotipo y genotipo para
descartar cualquier elemento externo que interfiriera con el resultado, quedando solo
187. De las 187 muestras, 179 fueron concordantes entre fenotipo y genotipo, es
decir, se obtuvo un 95.7% de concordancia; mientras que en 8 de los casos hay una
franca discordancia, esto significa el 4.3%.
Conclusiones: Una concordancia similar a la hallada en este estudio se ha
encontrado en otras poblaciones del mundo como orientales, caucásicos o negroafricanos. Las no concordancias pueden tener diversas causas como la presencia de
alelos aberrantes que podrían causar falsos positivos o negativos.
vi
Abstract
In transfusion medicine, it is important the study and determination of ABO and
Rh blood groups in donors and patients who undergo transfusions or transplants, the
study of hemolytic anemias, such as autoimmune hemolytic anemia and Hemolytic
Disease of the Newborn. In the anthropological ambit are considered as markers of
identity or population genetics. Some studies have been developed regarding to the
phenotype of the Rh system in the Mexican population, however, until now genotypes
have not been characterized in order to determine the correlation between these two
studies and use them as a tool in clinical and population studies.
Objective: To characterize phenotypically the RHCE gene by real time PCR,
comparing the results with the phenotype and determine the correlation.
Methods: DNA samples were obtained from donors at Medica Sur Hospital and
INPer. According to the phenotypic frequency of 1638 samples, was defined the
sample size of 190. We used real-time PCR for characterizing the alleles C, c, E and
e, using the LightCycler® equipment. Hybridization probes LightCycler FastStart DNA
Master HybProbe were used for alleles E / e, while for C c were used LightCycler
TaqMan Master probes. The 190 samples were classified by phenotypes and also by
alleles. We standardized the tests using known controls.
Results: Statistical analysis was performed according to the phenotype, we observed
a concordance of 100% in 7 of 15 potential phenotypes, the other 8 showed a
concordance not less than 80%. Concerning the analysis by alleles, we obtained a
concordance of 95.5% for cc, for CC of 96.2% and 95.7% for CC, while for allele ee
was of 96.2%, 92.1% for Ee and 100% for EE. Regarding the RhD group analysis, we
obtained a 93.6% concordance for the negative group and 96.4% for the positive. 8
samples did not agree, so we investigated these 8 cases not agreed between
phenotype and genotype to rule out any external element that interfered with the
result, leaving only 187. Of the 187 samples, 179 were concordant between
phenotype and genotype, ie, we obtained a concordance of 95.7%, while in 8 cases
there is a clear mismatch, this means 4.3%.
Conclusions: A correlation similar has been found in other populations of the world
like Eastern, Caucasian or black African. The non-concordance may have different
causes such as the presence of aberrant alleles that could cause false positives or
negatives.
vii
I. Introducción
Grupos sanguíneos
La membrana eritrocitaria (Figura 1) es una estructura dinámica y fluida de
proteínas-lípidos-carbohidratos, consta de una bicapa fosfolipídica donde las colas
de ácidos grasos forman el interior hidrofóbico de la bicapa y las cabezas hidrofílicas
revisten ambas superficies externa o exofacial e interna o citoplásmica, en ella se
distribuyen las diferentes proteínas que componen la membrana (Radillo, 2006).
Los antígenos de los grupos sanguíneos están expuestos en la superficie de
la membrana eritrocitaria, pero además están presentes en otros sitios del organismo
como tejidos o líquidos, algunos antígenos tienen distribución exclusivamente
eritrocitaria, como es el caso del Rh, mientras que otros tienen una distribución
universal como el sistema ABO(Reid y Mohadas, 2004; Daniels y cols., 2009).
Figura 1. Membrana eritrocitaria. Se observa el complejo molecular Rh.
Interacción de las proteínas integrales (Rh, banda 3, CD47, RhAG, GPC) con
las proteínas del citoesqueleto (anquirina, espectrina, banda 4.2, 4.1, actina).
(Delaunay, 2007)
1
Los grupos sanguíneos se clasifican en Sistemas, Series y Colecciones. Un
Sistema consiste en uno o más antígenos que comparten características en común
como su estructura química, la localización en la membrana, controlados por un gen
o genes estrechamente relacionados con escasa o nula recombinación entre ellos.
Las Colecciones contienen a los antígenos que tienen alguna relación bioquímica,
serológica o genética pero sin cumplir cabalmente las condiciones de un sistema.
Las Series corresponden a los antígenos que no reúnen los requisitos anteriores, se
clasifican en series de baja incidencia con <1% (serie 700) y de alta incidencia con
>99% (serie 900). (Escamilla, 2006)
Se han identificado alrededor de 300 determinantes antigénicos de grupos
sanguíneos, la gran mayoría pertenecen a alguno de los 30 sistemas reconocidos y
los restantes (aproximadamente 40 antígenos), forman parte de las series y las
colecciones (Reid y Mohadas, 2004; Daniels y cols, 2009).
Las técnicas de laboratorio utilizadas para la identificación del fenotipo Rh han
sido la hemaglutinación en tubo, que es la prueba más difundida y evaluada, seguida
por otras técnicas aplicables solamente a nivel experimental, como son la
determinación de la densidad del antígeno D mediante citometría de flujo o pruebas
de electroforesis de proteínas (Western Blot). Actualmente también se usa la técnica
de fotoaglutinación en placas de gel. (Vengelen-Tyler V, 2005)
Marco histórico.
El sistema Rh es un sistema sanguíneo muy complejo que se encuentra
constituido por un conjunto de proteínas con afinidad bioquímica y genética, y se le
considera el segundo sistema más polimórfico e inmunogénico en el hombre,
después del sistema ABO (Le Van Kim et al, 2005).
2
El primer sistema sanguíneo descrito por Landsteiner en 1901, fue el ABO
como resultado de la mezcla de eritrocitos y sueros de diferentes sujetos sanos, los
grupos sanguíneos restantes se han identificado a partir de entidades clínicas como
la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), las reacciones hemolíticas a la
transfusión, así como mediante el uso de anticuerpos monoclonales y por las
técnicas de biología molecular, que han permitido la identificación de los
polimorfismos, la caracterización de su expresión en tejidos específicos y la relación
entre la estructura y la función (Denomme, 2004).
En 1940 Landsteiner y Wiener descubrieron el sistema Rh al inyectar
eritrocitos del mono Macacus rhesus en conejos. El suero de conejo aglutinaba a los
hematíes del mono y al 85% de los glóbulos rojos humanos en que fue probado. Por
esta razón se le denominó al nuevo sistema Rh, de Rhesus. Después se
descubrieron los otros 4 antígenos principales: C, c, E y e. (Race y Sanger, 1975)
Genes RH
En 1986, Patricia Tippet propuso la teoría de la existencia de dos genes (RHD
y RHCE) que son responsables de la presencia de los antígenos del sistema Rh,
misma que fue confirmada por la clonación de ambos genes en 1990 por Colin y
cols., y mediante estudios moleculares, se reveló la presencia de ambos genes en
individuos RhD positivo, mientras que en individuos RhD negativo, sólo se observó la
presencia del gen RHCE (Scott, 2004).
El locus para el RH está ubicado en el brazo corto del cromosoma 1, región 3,
banda 4, sub-banda 11 (1p34.11). Estos genes se encuentran constituidos por 10
exones cada uno, con una secuencia genómica de 60,000 y 69,000 pb,
respectivamente, con orientación opuesta; se encuentran enfrentados en su posición
3´ y separados por el gen SMP1 (30,000 pb, sin relación funcional con ambos genes
del sistema). El gen RHCE se considera un gen ancestral, mientras que el RHD es
un duplicado que se encuentra flanqueado en ambos lados por dos segmentos de
3
9,000 pb denominados Cajas Rhesus de alta homología
2000; Wagner y Flegel 2002, Wiener, 2004,)
(Le Van Kim et al, 2005; Wagner y Flegel,
(Figura 2).
Figura 2.
Orientación opuesta de los genes RHD y RHCE,
enfrentados en su posición 3`. El gen RHD está flanqueado a la
derecha y a la izquierda por unas secuencias de nucleótidos
llamados cajas Rhesus (b).
Hay otros tres genes relacionados RHAG, RHBG y RHCG, localizados en el
brazo corto del cromosoma 6 en la región 2, banda 1, sub-banda 1 (6p21.1); el gen
RHAG codifica para la proteína RhAg (Rh50), cuyo papel es esencial en la expresión
de las proteínas RhD y RhCE. Las proteínas RhBg y RhCg no son de distribución
eritroide.
Las cajas RH o Rhesus abrazan exactamente la parte del RHD con homología
a RHCE. La porción central de ambas cajas Rhesus contienen casi completo un
elemento humano tipo transposón (THE-1B). Sin embargo, el marco de lectura
abierto usualmente se encuentra en el elemento THE-1B el cual es eliminado debido
a varios cambios de nucleótidos que ocurren en paralelo en las cajas Rhesus,
incluyendo una mutación sin sentido en el codón 4 (Figura 3). (Wagner y Flegel, 2000)
5´
3´
Figura 3. Organización cromosómica de las cajas Rhesus. La extensión física de la caja Rhesus
inicial (5´RHD) es de 9145pb (barra negra). Cerca del 63% de la secuencia de nucleótidos de las
cajas son de DNA repetitivo, los tipos de familias de repetición se indican con el resto de colores. La
homología entre las cajas Rhesus inicial y final es del 98.6%, con una región de identidad de 1463 pb
(flechas horizontales), hay solo una inserción de 4 pb (al inicio de la región tigger3). Una isla CpG
(en L1MC3 MER20) está localizada en la posición 3´ de la caja Rhesus final (3´RHD) adyacente a la
(Wagner y Flegel, 2000)
región del promotor del SMP1.
4
Gen RHCE
El gen RHCE codifica principalmente para las proteínas o antígenos C, c, E, e
(Le Van Kim et al, 2005)
. La condición fenotípica está en parte determinada por la presencia
de los diferentes antígenos codificados en este gen, la cual se detecta, al igual que
en los casos anteriores, por reacciones de aglutinación que se manifiestan al poner
en contacto suspensiones de eritrocitos al 5% en solución salina fisiológica, contra
antisueros específicos (anti-C, anti-c, anti-E, anti-e) que los reconocen. La evidencia
de reactividad identifica al antígeno presente, y la ausencia de la misma, la carencia
de éste.
Las proteínas asociadas al gen pueden expresarse de forma homocigota o
heterocigota para cada una de ellas. Es decir, puede presentarse como Rh CC, Cc y
cc, y EE, Ee y ee.
Los principales polimorfismos para C/c y E/e se asocian a sustituciones de
aminoácidos en la segunda y cuarta asa extracelulares de la proteína RhCE,
respectivamente; el antígeno “C” está determinado por la presencia del aminoácido
serina en posición 103 de la proteína, mientras que el antígeno “c” está determinado
por la presencia de prolina en la posición 103. El antígeno “E” está determinado
también por prolina en la posición 226, mientras que el antígeno “e” está determinado
por la presencia de alanina en la misma posición de la proteína
(Le Van Kim et al, 2005; Lomas-
Francis et al., 2000; Wagner et al, 2004)
.
Las bases moleculares para la expresión de los antígenos “C” y “e” son un
poco más complicadas que la de los otros dos antígenos, ya que los aminoácidos
que determinan la presencia de éstos alelos también están presentes en la proteína
RhD, además de que existen mecanismos determinantes para la expresión de estos
(Le Van Kim et al, 2005)
.
5
Proteínas Rh
El sistema sanguíneo Rh es el más complejo, a la fecha hay 50 antígenos
reportados, algunos de ellos de muy alta frecuencia hasta otros con presencia en
muy pocos individuos. (Daniels y cols, 2004 y 2009).
Las proteínas en los diferentes grupos sanguíneos se organizan con base a su
integración en la bicapa fosfolipídica del eritrocito. Las proteínas del sistema Rh: RhD
y RhCE, son proteínas de tipo III no glicosiladas y no fosforiladas, que se expresan
exclusivamente en la superficie de los eritrocitos de vertebrados superiores y están
conformadas por 417 aminoácidos, distribuidos en 6 asas extracelulares, 12
transmembranales y 7 segmentos intracelulares. Los sitios carboxilo y amino
terminales se encuentran en el citoplasma
(Le Van Kim et al, 2005; Lomas-Francis et al, 2000; Wagner et
al, 2004)
. Según el alelo considerado, las proteínas Rh (RhD y RhCE) difieren en 34-37
aminoácidos dispersos a lo largo de la secuencia de aminoácidos en ellas
(Le Van Kim et
al, 2005; Wagner et al, 2004)
. Los sitios con actividad antigénica de mayor intensidad son los
seis dominios extracelulares (Lomas-Francis et al, 2000).
La hipótesis más aceptada es que las proteínas de este sistema se
encuentran en la membrana eritrocitaria formando complejos no covalentes con otras
proteínas (RhAG, CD47, LW, GPB), y se estabilizan por palmitoilación
Van Kim et al, 2005; Wagner et al, 2004)
(Cartron, 1999; Le
en donde los residuos de ácido palmítico acetilado se
unen a cadenas laterales de la cisteína (Figura 4).
Figura 4. Se observan las proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos que están
identificados por un círculo y los sitios de palmitoilación. La proteína RhCcEe tiene una
cisteína en la posición 330 en vez de tirosina que da lugar al tercer sitio de palmitoilación
de la proteína RhCcEe. En la parte derecha se señalan los cambios de aminoácidos en la
(Le Van Kim et al, 2005).
proteína C/c y E/e.
6
La expresión de los antígenos del sistema Rh depende de la funcionalidad de
una glicoproteína asociada denominada RhAG (Rh50). La presencia de mutaciones
en esta glicoproteína puede condicionar el fenotipo Rh-nulo, caracterizado por la
ausencia total de los antígenos del sistema Rh (Wagner et al, 2004).
La proteína RhAG está codificada por el gen RHAG, cuya organización es muy
similar a la de los genes RHD y RHCE, se ubica en el brazo corto del cromosoma 6,
región 1 y 2, banda 1 (6p11-p21.1)
(Cartron, 1999)
y corresponde al sistema sanguíneo
número 30 (Daniels y cols, 2009).
Los genes RHD y RHCE poseen una homología de 40% con el gen RHAG, lo
que sugiere que éstos pertenecen a la misma familia. La diferencia más importante
entre las proteínas codificadas por estos genes, es la presencia de una molécula de
N-glicano en la primera asa extracelular de la proteína RhAG, que acarrea a los
antígenos ABH (Cartron, 1999; Le Van Kim et al, 2005, Daniels y cols, 2009).
Cuando menos existen dos mecanismos moleculares para explicar la
condición de RhD negativo. Uno es la deleción parcial o total de gen RHD. La
deleción del RHD, es el mecanismo dominante en sujetos de origen étnico
caucásico. Es una condición homocigota con la ausencia del gen RHD. El punto de
ruptura se localiza en la región de las cajas del Rh (1463 pb) y se explica por un
entrecruzamiento desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2
repetitivo) (Wagner y Flegel 2000).
El otro mecanismo es la pérdida de expresión del gen RHD. En este segundo
grupo, el gen RHD, al menos en parte, está presente, pero su expresión fenotípica no
ocurre. Un caso ejemplar, es el mecanismo del pseudogen RhDψ mediante el cual
los sujetos de origen negro-africano son RhD negativo como mecanismo principal,
que es una inserción de 37 pb de una secuencia repetida entre el intrón 3 y el exón 4
del gen RHD que recorre el marco de lectura (Singleton et al 2000) y finalmente la formación
de un gen híbrido RHD-CE-D asociado al haplotipo Cde. En otro grupo de sujetos
7
fenotípicamente RhD negativo con la formación del gen híbrido, se tienen diversas
opciones, una de ellas es el gen híbrido RHD-CE-Ds.
Nomenclatura
Después del descubrimiento del grupo sanguíneo Rh se propusieron diversas
nomenclaturas para describirlo, algunas con base en la propuesta genética; el
sistema CDE propuesto por Fisher y Race con tres pares de genes ligados
estrechamente en el mismo cromosoma y, el sistema Rh-Hr de Wiener que proponía
múltiples alelos en un mismo locus genético (Race y Sanger, 1975).
Posteriormente se unificaron estas nomenclaturas y se hicieron equivalencias
(Tabla 1), de esta manera, el haplotipo conocido como “CDe” en el sistema de Fisher
y Race equivale a “R1” en el sistema de Wiener, “cDE” a “R2”, etc., como se muestra
en la tabla 2. La letra mayúscula “R” se utiliza cuando se expresa el antígeno D, y la
letra minúscula “r” cuando el antígeno no se expresa.
Tabla 1. Nomenclatura del sistema Rh según Fisher/Race y Wiener.
Fisher/Race
Wiener
CDe
R1
cDE
R2
CDE
RZ
cDe
R0
cde
r
Cde
r´
cdE
r´´
CdE
ry
8
A partir de los ocho haplotipos se pueden obtener 64 posibles combinaciones,
de las cuales derivan los 18 fenotipos posibles (Tabla 2). En medicina transfusional,
éstas nomenclaturas son muy útiles para comunicar el fenotipo Rh de los pacientes y
donadores.
Tabla 2. Fenotipos posibles dentro del sistema Rh.
RHD(+)
RHD(-)
CcDEe
CcdEe
CcDee
Ccdee
ccDEe
ccdEe
ccDee
ccdee
CCDee
CCdee
CCDEE
CCdEE
CcDEE
CcdEE
ccDEE
ccdEE
CCDEe
CCdEe
Rosenfield en 1962 propuso una nomenclatura numérica basada en la
serología, que es la de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT)
y se muestra en la Tabla 3 (Vengelen-Tyler V, 2005).
Durante el desarrollo de este trabajo para fines prácticos en la escritura se
usaron letras minúsculas para señalar la falta del antígeno RhD, y letras mayúsculas
para denotar la presencia de éste. En el caso de los antígenos RhCE las letras ya
sean mayúsculas o minúsculas representan la presencia del alelo correspondiente.
Además se usó con mayúsculas RH para referirnos al gen y Rh para hacer mención
de la proteína.
9
Tabla 3. Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT) de
los antígenos del sistema Rh.
001
D
002
C
003
E
004
c
005
e
006
f (ce)
007
Ce
008
w
C
009
x
C
010
V
011
w
E
012
G
013
014
015
016
017
Hro
018
Hr
019
s
hr
020
VS
021
G
C
022
CE
023
W
D
024
025
026
C like
027
cE
028
H
hr
029
Rh29
030
a
Go
031
B
hr
032
Rh32
033
Rh33
034
B
Hr
035
Rh35
036
a
Be
037
Evans
038
039
Rh39
040
Tar
041
Rh41
042
Rh42
043
Crawford
044
Nou
045
Riv
046
Sec
047
Dav
048
JAL
049
STEM
050
FPTT
051
MAR
052
BARC
053
JAHK
054
DAK
055
LOCR
056
CENR
057
CEST
Las casillas vacías corresponden a antígenos obsoletos.
Justificación
En los últimos 10 años, el estudio molecular de los grupos sanguíneos y en
particular del Rh, avanzó vertiginosamente, permitiendo incorporarlos como
herramienta para el estudio clínico en medicina transfusional. También se ha
aplicado en otros terrenos como pruebas de paternidad, migración de poblaciones,
medicina forense o estudios antropológicos (Reid 2003).
En términos generales, se han identificado los diversos eventos moleculares
que dan lugar a la expresión de los diferentes antígenos eritrocitarios, como son:
Conversión o recombinación de genes: MNS, Rh, Chido/Rodgers.
Duplicación de un exón: Gerbich.
Deleción de un gen, exón o nucleótido: ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock,
Gerbich.
10
Inserción de uno o más nucleótidos: Rh, Colton.
Substitución de un nucleótido (SNP): La mayoría de los grupos sanguíneos:
RhC/c, RhEe, Kell/cellano (K/k), Penny/Rautenberg (Kpa/Kpb), Duffya/Duffyb
(Fya/Fyb), Diegoa/Diegob (Dia/Dib) (Reid 2003).
En el año 2002, Legler y cols. pudieron utilizar el plasma materno como
método no invasivo para determinar el genotipo Rh fetal a partir de DNA libre, por
PCR en tiempo real, mismo que ha sido de gran utilidad para diagnosticar de la
enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido.
Planteamiento del problema
El análisis genotípico del sistema Rh, es parte de un conocimiento necesario
que puede ser incorporado como herramienta en el estudio de diferentes condiciones
como es el caso del diagnóstico prenatal del grupo sanguíneo, en la determinación
del grupo sanguíneo propio en pacientes politransfundidos o isoinmunizados, o la
identificación molecular de donadores.
El empleo de la tecnología molecular aplicada a la clínica, como es el caso del
PCR en tiempo real, permite la generación de conocimiento, como es, el establecer
la concordancia entre el fenotipo y el genotipo del grupo sanguíneo en nuestra
población. Esto permitirá mejorar la eficiencia de las herramientas de diagnóstico en
beneficio de los pacientes.
Pregunta de investigación
¿Cuál es la concordancia entre el genotipo y el fenotipo para el gen RHCE en
una muestra de población mexicana?
11
Hipótesis.
La concordancia entre la genotipificación RHCE y el fenotipo RhCE es igual o
mayor a 0.950.
Objetivo general
Establecer la concordancia entre el estudio genotípico del gen RHCE en
relación al fenotipo de las proteínas RhCE.
Objetivos particulares
Determinar el fenotipo del sistema Rh y el genotipo del gen RHCE.
Comparar los resultados del fenotipo y genotipo y establecer la concordancia
entre ambos resultados.
Identificar las diferencias en la concordancia genotipo y fenotipo de acuerdo al
alelo del sujeto.
12
II. Material y métodos
Población de estudio. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación.
La población estudiada fueron donadores de sangre del Hospital Médica Sur y
del Instituto Nacional de Perinatología de la ciudad de México, bajo los siguientes
criterios de selección:
Criterios de Inclusión: Donadores del Hospital Médica Sur y del INPer que
cumplieron con los criterios establecidos para la donación de sangre y que aceptaron
participar en el estudio, a cuyas muestras se les realizó la determinación del fenotipo
Rh y la extracción de DNA.
Criterios de Exclusión: Todas las muestras de los donadores que no
desearon participar en el estudio.
Criterios de Eliminación: Todas aquellas muestras que no estaban en
buenas condiciones, no estaban correctamente identificadas o no eran rastreables.
Métodos
Se desarrolló una estrategia de trabajo, para sistematizar el estudio de los
sujetos. Se recolectaron muestras sanguíneas de los donadores por punción venosa
en tubos de recolección utilizando EDTA como anticoagulante. Se determinó el
fenotipo por el método de fotoaglutinación en placas de gel. Se extrajo DNA de las
muestras a partir de sangre completa. Se determinó el genotipo por PCR en tiempo
real y por último se correlacionaron los resultados para obtener la concordancia.
Dicha estrategia se muestra a continuación en la Figura 5.
13
Figura 5. Estrategia de trabajo. La población estuvo constituida por donadores de sangre del
Hospital Médica Sur y del INPer. Se obtuvieron muestras sanguíneas de los donadores. Se
determinó el fenotipo por el método de fotoaglutinación en placas de gel. Se extrajo DNA de las
muestras a partir de sangre completa. Se realizó el genotipo por PCR en tiempo real y por
último, se correlacionaron los resultados para obtener la concordancia.
14
Obtención de muestras
La obtención de las muestras se realizó por punción venosa; se obtuvieron 2
tubos por donador con EDTA como anticoagulante.
Un tubo fue usado para determinar el fenotipo, el resultado se incluyó en la
base de datos de fenotipos del Instituto Nacional de Perinatología; del segundo tubo
se realizó la extracción de DNA utilizando un kit comercial, este DNA fue almacenado
e incluido en el banco de DNA (ADNoteca) del Instituto Nacional de Perinatología
para posteriormente realizar el análisis molecular del gen RHCE.
Fenotipificación de RhCE
Mediante el empleo de la técnica de hemaglutinación en tubo para identificar
el fenotipo de los antígenos más comunes del sistema Rh (D, C, c, E y e), podemos
inferir el genotipo más probable del individuo, pero no establecer con certeza su
condición de heterocigoto u homocigoto de los genes RHCE y RHD. El origen étnico
es importante dado que modifica sustancialmente la probabilidad de la condición de
cigocidad.
La importancia clínica del grupo sanguíneo Rh reside en el hecho de que el
antígeno D es altamente inmunogénico. Los antígenos D, C, c, E y e son los más
importantes del grupo de antígenos que forman este sistema.
La determinación de los fenotipos Rh se define por la presencia o ausencia de
los antígenos D, C, c, E y e en los eritrocitos. Los reactivos anti-C, anti-c, anti-E y
anti-e se utilizan para realizar el tipaje del grupo Rh.
El principio del método se basa en la técnica de aglutinación en gel descrita
por La Pierre para la detección de las reacciones de aglutinación de los eritrocitos. La
15
aglutinación se produce al entrar en contacto los antígenos eritrocitarios con los
anticuerpos correspondientes, presentes en el reactivo o en la muestra de suero o
plasma.
La tarjeta DG gel es un soporte de plástico constituido por 8 microtubos
(Figura 6). Cada microtubo está formado por una columna y una cámara de
dispensación/incubación. Cada placa de gel es suficiente para dos pruebas.
Figura 6. Tarjeta DG gel. Se observan las 8
microtubos conteniendo los antisueros
específicos para la fenotipificación del Rh.
Cada columna contiene microesferas de dextranos polimerizados en medio
amortiguado que actúan como filtro. Los dextranos se encuentran mezclados en un
reactivo que contiene anticuerpos específicos en un amortiguador.
Los microtubos que contienen los anticuerpos específicos incorporados a la
solución de gel actúan como medio de reacción y los eritrocitos aglutinan al contacto
con los anticuerpos.
Durante la centrifugación, los aglutinados de hematíes son atrapados según
su tamaño, en la superficie o a lo largo de la columna de gel (Figura 7). Los hematíes
no aglutinados descienden hasta el fondo del microtubo.
16
Figura 7. Aspecto de la reacción con diferentes
grados de aglutinación en la tarjeta DG gel.
Cada microtubo de la tarjeta DG Gel Rh contiene dextranos polimerizados en
medio amortiguado, con conservadores y mezclados con distintos reactivos. Los
diferentes microtubos se identifican mediante la etiqueta frontal de la tarjeta.
Microtubos C: anti-C monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon
P3x25513 G8)
Microtubos c: anti-c monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon MS 33)
Microtubos E: anti-E monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon 906)
Microtubos e: anti-e monoclonal (mezcla de anticuerpos IgM de origen humano,
clones MS 16 y MS 63)
Las muestras de sangre a analizar deben ser de extracción reciente. No se
deben utilizar muestras hemolizadas, turbias, contaminadas o con presencia de
coágulos. Si es necesario, pueden usarse muestras conservadas entre 2-8°C hasta
por 48 horas después de su extracción.
La determinación del fenotipo del grupo sanguíneo Rh en gel se puede realizar
manualmente en tubos de ensayo, sin embargo, en este estudio se usó el método
semiautomático con el procesador Diana Gel (Figura 8).
17
Figura 8. Procesador Diana Gel. Equipo semiautomático para
el procesamiento y lectura de las tarjetas de gel.
Inicialmente se dejan atemperar las muestras, el reactivo DG Sol® a 18-25°C.
Se identifican las muestras y tarjetas a utilizar con el lector de código de barras que
incluye el equipo, éstas se van mostrando gráficamente en la pantalla de la
computadora conforme se introduce el código de barras. Las muestras y las tarjetas
ya identificadas se colocan en los pozos y se enciende el equipo. Se elige en la
computadora el análisis de antígenos C, c, E y e y se da inicio al procesamiento de
las muestras, el equipo trabaja de forma automática. Una vez terminado el
procesamiento de las muestras, éstas se centrifugan en la centrífuga para tarjetas
DG Gel, la cual ya está configurada especialmente para este tipo de tarjetas en
tiempo y rpm, solo se activa el botón de inicio.
El lector de placas de gel incluye una cámara que captura las imágenes de la
aglutinación ocurrida durante la reacción antígeno-anticuerpo. Se coloca cada tarjeta
en el lector y se toma la fotografía, está automáticamente se guarda, así se realiza
una fotografía a cada placa de gel. Una vez que se tienen todos los resultados
fotografiados, estos se imprimen y se archivan. Se retiran los tubos de las muestras
del equipo y se conservan hasta que se hayan analizado los resultados, después
18
pueden desecharse. Se realiza un último lavado al equipo desde el programa en
pantalla y se apaga.
Una ventaja importante del procesador semiautomático DIANA, es que se
puede conservar la evidencia de cada fenotipo y consultar en cualquier momento el
resultado (Figura 9). Un resultado positivo en los microtubos indica la presencia de
los antígenos C, c, E y e del sistema Rh; un resultado negativo en los microtubos,
indica la ausencia de éstos.
Figura 9. Impreso de la fotografía de las reacciones de aglutinación en gel. Las reacciones
positivas se observan con una banda en la parte superior mientras que las negativas la
tienen en la parte inferior.
Se recomienda realizar la lectura los resultados inmediatamente después de la
centrifugación de las tarjetas. No se deben dejar las tarjetas procesadas en posición
horizontal, ya que si fuera necesario, puede realizarse una lectura retardada hasta 24
horas después de procesadas si se conservan refrigeradas (2-8°C) y selladas con
parafilm o un material similar, para evitar la evaporación del sobrenadante.
19
Los procedimientos técnicos usados para la fenotipificación se llevaron a cabo
bajo la acreditación de la normativa ISO15189 que está implementada en el Banco
de Sangre del Hospital Médica Sur.
Extracción de DNA
La extracción de DNA se realizó a partir de sangre completa, con el kit de
preparación High Pure PCR Template de Roche Applied Science®.
A 200µL de sangre completa se le agregaron 200µL del regulador de unión y
40µL de Proteinasa K, se mezcló inmediatamente y se incubó la mezcla a 70°C por
10 minutos. Después se adicionaron 100µL de isopropanol, se mezcló bien y se
trasvasó la mezcla a un tubo con columna de alta pureza, se centrifugó por 1 minuto
a 8,000 x g, se desechó el líquido resultante y el tubo de recolección. Posteriormente,
se adicionaron 500 µL del regulador inhibidor de eliminación, se centrifugó por 1
minuto a 8,000 x g, se desechó el líquido resultante y el tubo de recolección.
Después se adicionaron 500 µL del regulador de lavado, se centrifugó por 1 minuto a
8,000 x g y se desechó el líquido resultante así como el tubo de recolección
nuevamente. Luego se adicionaron 500 µL del regulador de lavado, se centrifugó por
1 minuto a 8,000 x g y se desechó el líquido resultante. Se centrifugó por 10
segundos a 13, 000 x g y esta vez se desechó el tubo de recolección. Por último, se
adicionó un tubo con tapa nuevo y 200 µL del regulador de elución (70°C) y se
centrifugó por 1 minuto a 8,000 x g, después de todo este proceso se logró obtener el
DNA purificado.
A lo largo de este procedimiento las células fueron lisadas durante la
incubación con Proteinasa K en presencia de una sal caotrópica (guanidina-HCl), la
cual inactiva todas las nucleasas inmediatamente. Los ácidos nucléicos celulares se
unen selectivamente a fibras de vidrio especiales pre-empacadas en el tubo de
purificación con columnas de alta pureza. Los ácidos nucléicos unidos son
20
purificados en una serie de pasos rápidos “lavado-enjuague” para remover
componentes celulares contaminantes. Se incluye un amortiguador especial inhibidor
de eliminación, el cual permite la utilización de muestras heparinizadas hasta con
10U/mL de heparina. Finalmente, la elución baja en sales libera los ácidos nucléicos
de la fibra de vidrio. Este sencillo procedimiento, elimina la necesidad de realizar
extracciones con solventes orgánicos y la precipitación del DNA, permitiendo una
purificación rápida de muchas muestras simultáneamente.
La calidad del DNA extraído se verificó mediante visualización de los ácidos
nucléicos por electroforesis en gel de agarosa al 1%, mientras que la pureza y la
concentración fueron valoradas usando un espectrofotómetro ACTgene, tomando 2
µL de la muestra de DNA y colocándola en la placa de lectura nos da el resultado de
la concentración de DNA en ng/µL, este método es según Sambrook y cols en 1989.
El intervalo de concentración del DNA osciló entre 20-50ng/µL.
Genotipificación del gen RHCE
Estrategias moleculares.
Dada la alta homología que el gen RHCE tiene con el gen RHD, las
estrategias moleculares a usar tienen que ser cuidadosamente definidas.
Legler y cols., 2002, definieron las secuencias para RHc y RHC que se están
utilizando actualmente por PCR en tiempo real. El diseño para RHc se basó en el
cambio T307C en el exón 2 del gen RHCE que es específico para este alelo y que es
diferente en el alelo RHC y en el gen RHD; en el caso del alelo RHC el cambio es
una inserción de 109 pb en el intrón 2 que normalmente solo se encuentra en este
alelo y que tampoco está en el gen RHD.
La estrategia usada para distinguir los alelos RHE/e se basó en la presencia
del polimorfismo C676G en el exón 5 del gen RHCE, éste fue diseñado para PCR en
tiempo real por Araujo y cols en el 2002.
21
En la tabla 4 se resumen las estrategias moleculares que se usaron para la
determinación de los diferentes alelos:
Tabla 4. Estrategias moleculares usadas.
PCR Tiempo real
Amplicón
Diseño
RHc (T307C, exón 2, gen RHCE)
Primer sentido 5´ TCGGCCAAGATCTGACCG 3´
Primer antisentido 5´ ATGACCACCTTCCCAGG 3´
Sonda 5´ FAM-CTTCCTGACCTCAAATTTCCGGAGA-TAMRA 3´
175 pb
Legler
et
al.
Transfusion
and
Apheresis Science
7
2002;27:217-23.
105 pb
Legler
et
al.
Transfusion
and
Apheresis Science
7
2002;27:217-23.
392 pb
Araujo F, et al.
Immunohematology
2002:
18(3):5926
64.
RHC (Inserción de 109 pb, intrón 2, gen RHCE)
Primer sentido 5´ CATTGCTATAGCTTAAGGACTCA 3´
Primer antisentido 5´ ATGATTGTACCACTGGGAAG 3´
Sonda 5´ FAM-CAACACCAAACCAGGGCCACC-TAMRA 3´
RHE/e (C676G, exón 5, gen RHCE)
Primer sentido 5´ GCAACAGAGCAAGAGTCCATC 3´
Primer antisentido 5´ GAACATGGCATTCTTCCTTTG 3´
Sonda ancla CGCCCTCTTCTTGTGGATGTTCTG
Sonda sensor CCAAGTGTCAACTCTGCTCTGCT
Condiciones de la PCR.
Las condiciones de reacción usadas en los experimentos fueron definidas con
base en las estrategias moleculares con algunas modificaciones menores en la fase
de estandarización, en la tabla No. 5 se muestran las condiciones finales utilizadas:
Tabla 5. Condiciones de PCR usadas para los ensayos.
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
Ciclos
Curvas de fusión
(1 ciclo)
RHc
95°C 10 min
95°C 10 s
61°C 10 s
65°C 20 s
35
No
RHC
95°C 10 min
95°C 10 s
64°C 10 s
60°C 20 s
35
No
RHE/e
95°C 10 min
95°C 0 s
58°C 30 s
56°C 1 min
40
95ºC/0 s, 58 ºC/30 s
y 90 ºC/0 s
22
A partir de estas condiciones de reacción se hicieron las plantillas en el
programa LightCycler® Software versión 4.0.
Estandarización de las técnicas de PCR
Para todos los ensayos se hicieron algunas modificaciones de las condiciones
de reacción a partir de las informadas en los artículos originales, esto permitió
estandarizar las técnicas utilizadas y obtener una mejor visualización de la
amplificación.
Para estandarizar las técnicas se eligieron controles con fenotipo conocido
para RHc, RHC y RHE/e. En los 3 casos se usó un control positivo (homocigoto y
heterocigoto), y uno negativo. El ensayo se repitió 10 veces intraensayo y 10 veces
interensayo en los 3 casos. En todos los sesenta ensayos los controles positivos
amplificaron y los controles negativos y el blanco no amplificaron.
PCR en tiempo real
El PCR en tiempo real se utilizó en los ensayos moleculares para la
determinación de los alelos. El LightCycler® TM (Roche Molecular Systems), es un
sistema que consiste en la integración de un fluorómetro y un termociclador (Figura
10) que combina ciclos rápidos de PCR, con una detección de la fluorescencia en
tiempo real que va aumentando conforme aumenta el número de copias de la
secuencia de DNA amplificado, valorándose gráficamente el producto de
amplificación.
23
Figura 10. Diagrama de operación del termocicladorfluorómetro. Se muestran los componentes del sistema.
La reacción se lleva a cabo en capilares de borosilicato, es calentado por aire,
y distribuido por un ventilador, permitiendo una alta velocidad de reacción y con ello,
la especificidad (Figura 11).
Figura 11. Capilares de borosilicato, adición de reactivos, colocación de capilares en el carrusel,
colocación del carrusel, desarrollo de la reacción.
El gráfico (eje x = ciclos; eje y = fluorescencia) que se obtiene, es de tipo
sigmoidal. La fluorescencia (Figura 12) se detecta en diferentes canales ópticos (530,
560, 610, 640, 670 y 705 nm). Los formatos de detección de los fluorocromos son: a)
SyberGreen®, b) Sondas de hibridación (HybProbe®), c) Sondas de hidrólisis
(TaqMan®) y d) sondas sencillas de hibridación en fase de alineación.
24
Figura 12. Equipo LightCycler® donde se observa la
fluorescencia en un sistema computarizado.
Detección de los alelos RHc y RHC.
Para la detección de RHc se procesaron 28 muestras por ensayo, en cada uno
se incluyó un Blanco y un control homocigoto positivo con fenotipo ccdee, un control
heterocigoto positivo con fenotipo CcDEe y un control negativo CCDee. El volumen
total por capilar fue de 10 µL, de los cuales 5.7 µL fueron agua grado PCR, cebador
sentido 0.1 µL, cebador antisentido 0.1 µL, sonda Taqman® 0.1 µL, Master Mix® 2.0
µL y 2 µL de DNA. Primero se realizó un cálculo para hacer la mezcla total para las
32 muestras, se adicionan todos los reactivos y se mezclaron con una pipeta durante
30 seg. Una vez mezclados se transfirieron 8 µL de la mezcla a cada uno de los 32
capilares, posteriormente a cada uno se le adicionaron los 2 µL de DNA. Una vez
llenos y tapados todos los capilares, se centrifugaron durante 30 seg a 900 rpm. Se
colocaron los capilares en el equipo LigthCycler® y se dio inicio al ensayo. Después
de aproximadamente 40 minutos, el ensayo concluyó y se pudieron observar las
curvas en la pantalla, en ese momento se guardó el archivo, se retiraron los capilares
del equipo y se desecharon. Este mismo procedimiento se repitió para las 190
muestras.
25
En el caso del alelo RHC se siguieron los mismos pasos que para el alelo RHc,
ya que se utilizaron las mismas cantidades de controles y muestras. La diferencia en
el caso de RHC consistió en que los controles utilizados fueron un homocigoto
positivo con fenotipo CCDee, un control heterocigoto positivo CcDEe y uno negativo
ccdee.
El formato de detección que se usó para identificar molecularmente RHc y
RHC fue el de las sondas de hidrólisis TaqMan®.
Los ensayos de sondas de hidrólisis (Figura 13), también llamados ensayos
TaqMan®, usan una sola sonda que contiene dos marcadores, un reportero
fluorescente y un apagador fluorescente. Mientras la sonda está intacta, el apagador
está próximo al fluorocromo del reportero y suprime la fluorescencia de éste por
FRET. Cuando la sonda hibrida a la secuencia blanco, la polimerasa puede romper la
sonda de hidrólisis, separando al reportero del apagador. Con el aumento de la
cantidad de la secuencia blanco durante el PCR, más sonda puede romperse, lo que
provoca que la señal de la fluorescencia del reportero, que ya se ha liberado del
apagador, incremente. Como el principio de este ensayo es el rompimiento de la
sonda durante el PCR, esta sonda no puede ser usada para llevar a cabo un análisis
de curvas de disociación, también llamadas comúnmente curvas “melting”.
26
Apagador
Reportero
Fluorescencia
Figura 13. Principio de las sondas de hidrólisis TaqMan®. Primero se observa la sonda intacta, el
apagador (rojo) está próximo al fluorocromo (verde) del reportero y suprime su fluorescencia.
Cuando la sonda hibrida a la secuencia blanco, la polimerasa rompe la sonda de hidrólisis,
separando al reportero del apagador, lo que provoca que se libere la señal de la fluorescencia del
Instructivo LighCycler® Taqman® Master, Versión Abril 2009, Roche Applied Science.
reportero.
Detección del alelo RHE/e.
Para la detección del alelo RHE/e se procesaron 28 muestras por ensayo, en
cada ensayo se incluyó un blanco y un control homocigoto positivo para RHE con
fenotipo ccDEE, un control heterocigoto positivo con fenotipo CcDEe y un control
homocigoto positivo para RHe con fenotipo ccdee. El volumen total por capilar fue de
10 µL, de los cuales 5.4 µL fueron agua grado PCR, Cloruro de Magnesio (MgCl2,
2mM) 0.4 µL, cebador sentido 0.4 µL, cebador antisentido 0.4 µL, sonda ancla 0.2
µL, sonda sensor 0.2 µL, Master Mix®1.0 µL y 2 µL de DNA. Primero se realizó el
cálculo para hacer la mezcla total para 32 muestras, se adicionaron todos los
27
reactivos y se mezclaron con una pipeta durante 30 seg. Una vez mezclados se
transfirieron 8 µL de esta mezcla a cada uno de los 32 capilares, posteriormente a
cada capilar se le adicionaron los 2 µL de DNA. Una vez llenos todos los capilares se
taparon y centrifugaron durante 30 seg a 900 rpm. Se colocaron los capilares en el
equipo LigthCycler® y se dio inicio al ensayo. Después de aproximadamente 40
minutos se concluyó el ensayo y se pudieron observar las curvas en la pantalla, en
ese momento se guardó el archivo, se retiraron los capilares del equipo y se
desecharon. Este mismo procedimiento se repitió para las 190 muestras.
El formato de detección que se usó para identificar molecularmente RHE/e fue
el de las sondas de hibridación (HybProbe®).
Las sondas HybProbe® (Figura 14) consisten en dos oligonucleótidos
pequeños y diferentes, marcados, que se unen a una secuencia interna del
fragmento amplificado durante la fase de alineación del ciclo de amplificación. Los
pasos básicos de la detección de DNA por sondas de hibridación durante el PCR en
tiempo real en el sistema LightCycler® son: A) La sonda donadora tiene un fluoróforo
en su extremo 3´, la sonda aceptora tiene un marcador rojo (LightCycler® Red 610 #,
640, 670#, o 705) en su extremo terminal 5´(ésta también está fosforilada en su
extremo 3´, así que no puede extenderse). No ocurre hibridación durante la fase de
desnaturalización de PCR. Debido a la distancia entre las sondas se previene la
transferencia de energía. No será detectada ninguna fluorescencia del aceptor rojo
durante esta fase. B) Las sondas hibridan el fragmento de DNA amplificado en un
arreglo cabeza-cola, quedando muy próximas las dos sondas fluorescentes. La
fluoresceína se excita por el haz de luz del equipo, lo cual produce la emisión de luz
verde fluorescente. La energía emitida excita al marcador LightCycler® Red por
FRET. La fluorescencia roja emitida por la segunda sonda, se mide al final de cada
alineación, cuando la intensidad de la fluorescencia es mayor. C) Después de la
alineación, un incremento de temperatura permite la elongación y a su vez el
desplazamiento de las sondas. D) Al final de este paso, el producto de PCR es de
28
doble cadena, las sondas HybProbe® que fueron desplazadas están de nuevo en la
solución y suficientemente separadas para evitar que ocurra FRET.
Figura 14. Principio de las sondas de hibridación HybProbe®.: A) La sonda donadora tiene un fluoróforo en
su extremo 3´, la sonda aceptora tiene un marcador rojo en su extremo 5. No ocurre hibridación durante la
fase de desnaturalización de PCR. Debido a la distancia entre las sondas se previene la transferencia de
energía. B) Las sondas hibridan el fragmento de DNA amplificado quedando muy próximas las dos sondas
fluorescentes. La fluoresceína se excita por el haz de luz del equipo, lo cual produce la emisión de luz verde
fluorescente. La energía emitida excita al marcador por FRET. La fluorescencia roja emitida por la segunda
sonda, se mide al final de cada alineación. C) Después de la alineación, un incremento de temperatura
permite la elongación y a su vez el desplazamiento de las sondas. D) Al final de este paso, el producto de
PCR es de doble cadena, las sondas HybProbe® que fueron desplazadas están de nuevo en la solución y
Instructivo LighCycler® FastStart DNA Master
suficientemente separadas para evitar que ocurra transferencia de energía.
HybProbe®, Versión Abril 2009, Roche Applied Science.
Tamaño de muestra y análisis estadístico
El tamaño de muestra se definió con base en un total de 1638 muestras (Tabla
6) existentes en la ADNoteca. Para esto se consideró realizar la selección por la
frecuencia alélica, por pares y la frecuencia fenotípica, sin embargo, fue la frecuencia
alélica la que se usó al final para determinar el tamaño de muestra adecuado.
29
Tabla 6. Total de muestras en ADNoteca
ordenadas por código de fenotipo.
Código
Fenotipo
No. de
muestras
1
ccdee
545
2
ccDee
105
3
ccdEe
9
4
ccDEe
106
115
5
ccDEE
262
262
6
Ccdee
27
155
7
CcDee
128
8
CcdEe
5
9
CcDEe
128
10
CcDEE
70
11
CCdEE
1
12
CCDEE
7
8
13
CCDee
128
128
14
CCDEe
117
117
Total
TOTAL
650
133
70
1638
En la tabla 6 se muestran los diferentes fenotipos, a cada uno se le asignó un
código que se muestra en la primera columna; cada fenotipo se separó además por
el antígeno RhD, que aunque no fue el objetivo de estudio en este trabajo, fue útil
para realizar el análisis estadístico. En la tercera columna se desglosan las
cantidades por fenotipo con y sin el antígeno RhD, en la columna TOTAL, solo se
muestran las cantidades totales por fenotipo sin considerar el antígeno RhD.
Como se muestra en la tabla 7, para la selección de las muestras se
separaron las cantidades por alelos, se definió primero un tamaño de muestra del
10% por cada uno y luego se pareó el número de acuerdo al que tenía menor
cantidad, esto para que la muestra final fuera homogénea, sumando el tamaño
30
pareado de las muestras dio un total de 177. La selección de dicha cantidad de
muestras se hizo aleatoriamente utilizando una tabla de números aleatorios en hoja
de cálculo de Excel.
Después de la selección aleatoria, los fenotipos de baja frecuencia (<5) se
seleccionaron por cuotas, que es un procedimiento de ajuste, lo que sumó 13
muestras más a las 177 ya elegidas. El total fue de 190.
Tabla 7. Distribución de la muestras por alelos y definición
del tamaño de muestra.
Alelos
No. total
de
muestras
Tamaño de
muestra
(10%)
Tamaño
pareado de
muestra
cc
1027
103
25
Cc
358
36
25
CC
253
25
25
Total
1638
164
75
ee
933
93
34
Ee
365
37
34
EE
340
34
34
Total
1638
164
102
n
177
31
III. Resultados
Se realizó la PCR en tiempo real a las 190 muestras elegidas, en total fueron 3
tipos de ensayos, RHc (TaqMan®), RHC (TaqMan®) y RHE/e (HybProbe®) en el
equipo LightCycler®. En cada ensayo se usaron controles conocidos positivos
(homocigoto y heterocigoto) y negativos. En las figuras 15, 16 y 17 se muestra un
ejemplo de cada una de las gráficas obtenidas para cada uno de los diferentes
ensayos realizados.
Determinación de RHc
En la figura 15 se observa la curva de amplificación de las muestras y los
controles positivos Cc y cc que contienen el alelo RHc, mientras que el blanco, el
control negativo CC y las muestras que no contienen el alelo RHc no muestran
amplificación y se observan con fluorescencia de 0.
Amplificación
Figura 15. Curva de amplificación del alelo RHc. Gráfica obtenida después del análisis cualitativo
de las muestras para la determinación de RHc. Las muestras que contienen el alelo c amplifican en
una curva, mientras que las que no contienen c no amplifican y quedan en estado basal con
fluorescencia 0.
32
Determinación de RHC
En la figura 16 se observa claramente las curvas de amplificación de las
muestras con el alelo RHC, entre ellas los controles positivos CC y Cc que también
contienen el alelo C, mientras que las muestras que no contienen este alelo, el
Blanco y el control negativo cc, no amplifican mostrándose en una línea basal con
fluorescencia de 0.
Amplificación
Figura 16. Curva de amplificación del alelo RHC. Gráfica obtenida después del análisis cualitativo de
las muestras para la determinación de RHC. Las muestras que contienen el alelo C amplifican en una
curva, mientras que las que no contienen C no amplifican y quedan en estado basal con fluorescencia
0.
Determinación de RHE/e
En la figura 17, en la parte superior se muestran las curvas de disociación
obtenidas del análisis de los alelos RHE/e. En la parte inferior se observan los picos,
el que se ve del lado izquierdo corresponde a la amplificación de muestras que
contienen solamente el alelo RHe, mientras que los picos tendidos hacia la derecha
indican que las muestras contienen solo el alelo RHE. La curva que muestra dos
33
picos indica que se trata de muestras con RHE/e, es decir, heterocigotos. En la parte
basal se observa el Blanco.
RHe
RHE
RHE/e
Figura 17. Análisis de las curvas de disociación para RHE/e. Gráfica obtenida después del análisis de
curvas de disociación de las muestras para la determinación de RHE/e. Del lado derecho se observan
las muestras con el alelo RHE mientras que del lado izquierdo, las que tienen el alelo RHe.
Concordancia
De las 190 muestras elegidas y analizadas, 3 se eliminaron después de hacer
el análisis de concordancia, ya que no tuvieron rastreabilidad.
Las 187 muestras restantes se analizaron estadísticamente por el coeficiente
de ψ con el programa SPSS versión 11.0 para determinar la concordancia, de éstas,
179 concordaron y 8 no concordaron. En las tablas 8, 9, 10, 11 y 12 se muestran los
diferentes análisis realizados.
34
Tabla 8. Concordancia entre el fenotipo y el genotipo para el gen RHCE.
35
En la tabla 8 se hace una relación de concordancia entre el fenotipo y
genotipo, se muestra cuál es el porcentaje y la cantidad de casos que concuerdan
entre sí y los que no concuerdan, en la última columna y fila se muestran los totales
en cada caso. Esta tabla es ilustrativa pues se observan claramente los valores
concordantes formando una línea diagonal, mientras que los valores no
concordantes saltan a la vista al quedar fuera de este arreglo.
Tabla 9. Concordancia por alelo C.
Alelo
cc
Cc
CC
Concordancia
Total
SI
NO
84
4
88
95.5%
4.5%
100.0%
51
2
53
96.2%
3.8%
100.0%
44
2
46
95.7%
4.3%
100.0%
179
8
187
95.7%
4.3%
100.0%
En la tabla 9 se desglosan los resultados de concordancia por alelos cc, Cc y
CC. En la parte inferior se pueden observar los valores totales de 179 concordancias
y 8 casos que no concuerdan, así como los porcentajes correspondientes por alelo y
concordancia.
36
Tabla 10. Concordancia por alelo E.
Alelo Concordancia
ee
Ee
EE
Total
SI
NO
75
3
78
96.2%
3.8%
100.0%
58
5
63
92.1%
7.9%
100.0%
46
46
100.0%
100.0%
179
8
187
95.7%
4.3%
100.0%
En la tabla 10 al igual que en la tabla 9 se muestran concordancias y no
concordancias para los alelos ee, Ee y EE, en éste último caso se observa la
peculiaridad de un 100% de casos concordantes de un total de 46 muestras
comparadas.
37
Tabla 11. Concordancia por fenotipo
Fenotipo
Concordancia
SI
ccdee
ccDee
ccdEe
ccDEe
ccDEE
Ccdee
CcDee
CcDEe
CcDEE
CCDEE
CCDee
CCDEe
Total
NO
31
31
100.0%
100.0%
9
1
10
90.0%
10.0%
100.0%
5
1
6
83.3%
16.7%
100.0%
10
2
12
83.3%
16.7%
100.0%
29
29
100.0%
100.0%
8
2
10
80.0%
20.0%
100.0%
11
11
100.0%
100.0%
19
19
100.0%
100.0%
14
14
100.0%
100.0%
3
3
100.0%
100.0%
16
16
100.0%
100.0%
24
2
26
92.3%
7.7%
100.0%
179
8
187
95.7%
4.3%
100.0%
38
Tabla 12. Concordancia por genotipo.
Genotipo
ccdee
ccDee
ccdEe
ccDEe
ccDEE
Ccdee
CcDee
CcDEe
CcDEE
CCDEE
CCDee
CCDEe
Concordancia
Total
SI
NO
31
2
33
93.9%
6.1%
100.0%
9
2
11
81.8%
18.2%
100.0%
5
5
100.0%
100.0%
10
1
11
90.9%
9.1%
100.0%
29
29
100.0%
100.0%
8
8
100.0%
100.0%
11
11
100.0%
100.0%
19
1
20
95.0%
5.0%
100.0%
14
1
15
93.3%
6.7%
100.0%
3
3
100.0%
100.0%
16
16
100.0%
100.0%
24
24
100.0%
100.0%
ccdEE
1
1
100.0%
100.0%
179
8
187
95.7%
4.3%
100.0%
39
En las tablas 11 y 12 se muestran las concordancias por separado del fenotipo
y genotipo, respectivamente.
Con estas tablas podemos observar de forma individual el comportamiento de
cada fenotipo, genotipo o por separado las combinaciones de los alelos C, c, E y e.
No concordancia
Después de realizar todos los ensayos y encontrar las no concordancias, se
repitieron por triplicado las 8 muestras no concordantes para descartar algún error en
el estudio molecular o fenotípico, además de verificar los datos en los registros del
laboratorio de hematología perinatal del INPer, posteriormente se revisaron las
fotografías y datos del equipo de fotoaglutinación que se encuentran almacenados en
el Banco de datos del Hospital Médica Sur y se descartaron posibles errores de
transcripción en los fenotipos.
Al final de la investigación se definieron los hallazgos que se muestran en la
tabla 13.
40
Tabla 13. Características de los casos que no concordaron.
Caso
No.
1
2
Fenotipo
ccDEE
CCDEe
Observación
Placa de Gel
No se observa RhC
-No se observa Rhc
-Se observa RhC
Genotipo
CcDEE
Observación
PCR
Amplifica para RHC.
- Amplifica para RHc
ccDEe
- No amplifica para RHC
- RHE/e diferente T° fusión
3
ccDEe
Se observa RhE
ccDee
No amplifica para RHE
4
ccDEe
Se observa RhE
ccDee
No amplifica para RHE
5
Ccdee
Se observa RhC
ccdee
No amplifica para RHC
6
CCDEe
No se observa Rhc
CcDEe
Amplifica para RHc
7
ccdEe
Se observa Rhe
ccdEE
No amplifica para RHe
8
Ccdee
Se observa RhC
ccdee
No amplifica para RHC
En 7 de los 8 casos se observa una no concordancia para un solo ensayo,
excepto, en el caso No. 2, en el cual no hubo concordancia en ninguno de los
ensayos, además en el estudio para RHE/e de este mismo caso, se observó una
curva con temperaturas de fusión muy diferentes a las esperadas.
41
IV. Discusión
El estudio de los grupos sanguíneos ABO y Rh es de suma importancia en la
medicina transfusional, ya que los antígenos de estos sistemas son altamente
inmunogénicos, por lo que son de considerar en todas las actividades relacionadas
con el empleo terapéutico de la sangre y de sus componentes, por ejemplo, en los
pacientes a ser sometidos a transfusiones y trasplantes, y en particular, en el estudio
de las anemias hemolíticas, como la anemia hemolítica autoinmune y la enfermedad
hemolítica del recién nacido, también en el ámbito antropológico, pues son
considerados como marcadores de identidad poblacional o genética.
La aportación que hace la genotipificación del sistema Rh es muy importante,
dado que forma parte del avance en la medicina transfusional. La precisión de esta
técnica de genotipificación, que evalúa los principales antígenos del sistema Rh,
tiene una estimación muy alta comparándola con la serología como método de
referencia. La imprecisión en términos de falsos positivos y falsos negativos en su
mayor parte tiene como causa la presencia de mutaciones en los genes RHCE y
RHD.
En México, la experiencia reportada se limita a la señalada por el grupo de
estudio de Baptista y Cols. Además no hay informes que incluyan el estudio del gen
RHCE en su concordancia con el fenotipo RhCE, como paso indispensable para la
evaluación y verificación previo a la aplicación en el terreno clínico.
En este estudio, del cual no se ha realizado ninguno en población mexicana,
obtuvimos una concordancia global de 0.957, la cual se asemeja a las concordancias
obtenidas en otros estudios similares en los que se han genotipificado otros tipos de
poblaciones como orientales, caucásicos o negro-africanos como se muestra en la
Tabla 14, donde se observa que la concordancia menor encontrada es de 0.960
hasta la total de 1.0.
42
Las diferencias observadas en los reportes (Tabla 14) dependen de diversas
variables, donde se
incluye la metodología empleada, la estrategia molecular
adoptada (región del fragmento para amplificar), la experiencia del grupo de
investigación,
las
características
de
los
sujetos
de
estudio
evaluados
(politransfundidos, embarazadas, donadores, etc). Sin embargo, una diferencia
sustancial a ser considerada en la verificación de los métodos para ser empleados en
la práctica clínica, son las características étnicas de la población estudiada.
Entre los estudios realizados, destaca el trabajo de Perreault y cols, 2009,
quien en este año genotipificó a 10,555 donadores y encontró una concordancia del
99.6% con el fenotipo, específicamente para el alelo RHC hay 99.9%, RHc 99.9%,
RHE 98.4% y finalmente para el alelo RHe 99.8%.
Tabla 14. Comparación entre la concordancia en la determinación genotípica y fenotípica en el
grupo sanguíneo RhCE por otros autores y la obtenida en este estudio.
Autor
Alelos
estudiados
Concordancia
Faas BHW et al. Netherlands.Blood, 1995.
E/e
1.0
Finning K y cols. UK. Transfusion, 2007.
C
c
E
1.0
Zhou HY y cols. Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi.
China, 2008.
E/e;
Cyc
1.0
0.959
Geifman-Holtzman O. y Cols. USA. BJOG,2009.
E/e.
C/c
0.982
0.963
Perreault J. et al. Vox Sanguinis Canada 2009.
C
c
E
e
0.999
0.999
0.984
0.998
Orzinska A et al.Poland, Prenat Diagnos 2008.
C
1.0
Riveiro KR, Brazil, 2009.
Presente estudio
C
c
E
e
C
c
E
e
1.0
0.980
0.960
0.980
0.970
43
Las no concordancias pueden tener diversas causas, sin embargo, éstas aún
no han sido completamente exploradas. Zhou y cols, 2008, mencionan que el hecho
de que el alelo RHC no amplifique, puede deberse a que la inserción de los 109 pb
esté ausente en el gen en estos sujetos de estudio, por tal motivo sería necesario
utilizar otra estrategia para la detección de este alelo y así evitar los falsos negativos
por genotipo. Por otro lado, Hunhousen en el 2002, demuestra la presencia de un
gen híbrido, RHCE-D-CE, el cual podría ser la causa de que el alelo RHe no
amplifique. Esta configuración genética permite el reemplazo unidireccional de
fragmentos entre los genes RHD y RHCE que da paso a la formación de alelos
aberrantes, dada la alta homología entre ambos genes. El principal impacto de la
genotipificación de alelos aberrantes es que pudiera dar resultados falsos positivos o
falsos negativos, sobre todo tomando en cuenta algunas poblaciones específicas
como orientales y negroa-africanos.
Lo que se busca en la actualidad es que la transfusión sea lo más compatible
posible, es decir, que la mayoría de los grupos sanguíneos (entre ellos el sistema
Rh) del donador coincidan con los del receptor, para evitar con ello, la
isoinmunización por un lado, mientras que por otro lado, se pueden resolver
entidades clínicas ya existentes. Esto es posible ahora a través del estudio molecular
de los grupos sanguíneos, que en un futuro podría reemplazar al estudio fenotípico.
Con el adelanto tecnológico se ha podido avanzar en la evaluación de la
genotipificación de diversos grupos sanguíneos, en su concordancia con el fenotipo
en diversas poblaciones. En términos generales la concordancia genotipo-fenotipo
varía desde 0.957 a 1.0, dentro de la cual está comprendida el presente estudio.
La genotipificación podría agregarse al diagnóstico en medicina transfusional
en un futuro, por ejemplo para realizar genotipos de Rh en pacientes
politransfundidos o, los que requieren transfusiones recurrentes, así como en las
discrepancias para la identificación de anticuerpos, o en el estudio del Rh fetal, sin
44
embargo, todavía es necesario mejorar las estrategias moleculares con el fin de
evitar los resultados falsos positivos o negativos.
45
V. Conclusiones
Se encontró una concordancia global de 0.957 (95.7%) entre el fenotipo y
genotipo para el gen RHCE en la población estudiada.
Para el alelo RHC la concordancia entre fenotipo y genotipo fue de 0.96
(96.0%) y para el alelo RHc fue de 0.98 (98.0%)
Para el alelo RHE la concordancia entre fenotipo y genotipo fue de 0.98
(98.0%) y para RHe de 0.97 (97.0%).
Se encontraron 8 muestras no concordantes, de las cuales, para una no hubo
concordancia en ninguno de los alelos, estas representan el 4.2% del total de
187 muestras.
46
VI. Perspectivas
Caracterizar las no concordancias por medio de secuenciación para identificar
la posible existencia de alelos nuevos o ya reportados, que no son reconocidos por
esta estrategia.
47
VII. Referencias bibliográficas
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