Download Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas

Diagnóstico Molecular en
Enfermedades Infecciosas:
Una Mirada desde la Clínica
Dra. Natalia Conca M
Pediatra Infectolgo
Noviembre 2016
Conflictos de Interés
Remuneraciones por parte de laboratorios
Roche y GSK
Asistencia a cursos y congresos invitada por
otros laboratorios
Objetivos:
1.
Conocer ventajas y desventajas de las técnicas de biología
molecular frente a técnicas convencionales
2.
Comprender las posibles fallas de los test moleculares en cuanto a
la realización e interpretación
3.
Conocer algunas situaciones reales donde la biología molecular
esta siendo de utilidad clínica (meningitis, virus respiratorios y
sepsis)
4.
Comprender la relevancia clínica de las nuevas plataformas de
biología molecular
Generalidades
• Dg etiológico
 decisión clínica adecuada
 uso racional antimicrobiano
• Avance tecnológico
Persistencia de infecciones
• Infecciones emergentes
• Resistencia a antimicrobianos
Métodos Clásicos de Diagnóstico
Ampliamente usados y conocidos
Diversidad de medios y condiciones
Sensibilidad a antimicrobianos
Automatización
Limitaciones Métodos Clásicos
Bacterias y virus de difícil cultivo
No crecen al usar ATB o muestra escasa
Detección Ag (sensibilidad y especificidad variable)
Serología: inmunosuprimido, latencia
Microscopía: Baja sensibilidad y especificidad, operador
dependiente
Dogma Central
Biología Molecular
DNA
RNA
Transcriptasa Reversa  cDNA
PCR
RT-PCR
Proteína
Replicación ADN
PCR
Denaturación ADN:
Enzimas
Denaturación ADN:
Altas temperaturas (94°)
RNA polimerasa sintetiza
pequeño oligonucleótido en
sitio de inicio replicación
Secuencias sintéticas (primers):
Se usan 2 primers para
delimitar amplificación
DNA polimerasa sintetiza hebra
complementaria
DNA polimerasa:
Taq polimerasa
Diagnóstico molecular vs convencional
Cultivo
IFI/IFD
ELISA
Sondas
PCR
+
+++
+++
++
++/+++
Sensibilidad
++ / +++
++
++
++
++++
Especificidad
+++
++
++
+++
++++
+
+
+++
+
++
Rapidez
Facilidad
British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114
Ventajas Diagnóstico Molecular
Resultados más rápidos
Técnicas estandarizadas, automatizadas
Microorganismos de difícil crecimiento
Mayor sensibilidad y especificidad
Investigación
Limitaciones Diagnóstico Molecular
Falsos (+): Contaminación
Falsos (-): Extracción ADN, inhibidores, partidores
Mayor costo (relativo)
Debe sospechar agente infeccioso
No informa sensibilidad antimicrobianos
¿Cuando elegir un método
molecular?
1. Necesidad rápida de identificación
2. Identificación de microorganismos fastidiosos
3. Necesidad rápida de determinación de genes de
resistencia
4. Identificación de agentes no cultivables
5. Virus en general
¿Dónde se hace una Reacción de
Polimerasa en Cadena?
¿Qué tipos de RPC existen?
Cualitativa
PCR
Cuantitativa
Caso Clínico 1
•
•
•
•
Embarazo normal , RNT, femenino, buen peso
Embarazo fisiológico,
Streptococcus agalactiae (+) en el tercer trimestre del embarazo.
25 días de vida: movimientos mioclónicos del hemicuerpo izquierdo
estando en vigilia; somnolienta y disminución de la demanda por
alimentos.
• SU: febril, en relativas buenas condiciones generales, sin movimientos
anormales, fontanela con tensión normal, ausencia de lesiones en la piel y
mucosas y su examen segmentario era normal.
• Evolución: respiración irregular, piel reticulada y movimientos mioclónicos
en el hemicuerpo derecho que no cedían a la contención.
• RNM al 10 día con lesiones cerebrales compatibles con encefalitis
Manejo: tratamiento antimicrobiano empírico
Primera RPC para herpes simplex 1 y 2(-)
Persiste sintomática
Se adiciona aciclovir
2 muestra RPC para herpes simplex 1 y 2 (-)
Se toma 3era muestra LCR
Que salió mal?
• Mala muestra?
– 1 causa
– Tipo de muestra
•
•
•
•
Presencia de inhibidores?
Inadecuado almacenamiento y refrigeración ?
Proceso de la muestra tardío ?
Bajo numero de copias bajo umbral de
detección?
– Sensibilidad RPC en LCR para herpes 1 y 2 100%
– Especificidad 97%
Métodos de laboratorios usados en
infección SNC
Que busca el clínico en examen de biología
molecular
• Definir infecciones que
amenacen la vida (MBAHSV)
• Confirmar o excluir
infecciones tratables
• Iniciar tratameinto atb
adecuado
Conca y cols al, Rev Chil Pediatr. 2016; 87(1): 24-30
Sensibilidad de PCR pacientes diagnosticados clínicamente 93% vs 55% de
cultivo
Con uso de ATB: s pcr 89,4% vs 10,5%
Aporte:
Mejor diagnostico
Terapia adecuada
Duración de tratamiento adecuada
Ramers y cols, JAMA may 24/31,2000 vol 283,N°20
Clinical Infectious Diseases 2013;57(8):1114–28
Bacterias
Escherichia coli K1
Haemophilus influenzae
Listeria monocytogenes
Neisseria meningitidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Virus
Cytomegalovirus (CMV)
Enterovirus
Herpes virus simplex 1
(HSV-1)
Herpes virus simplex 2
(HSV-2)
Herpes virus simplex 3
(HSV-3)
Parechovirus Humano
VirusVaricella zóster (VZV)
Levaduras
Cryptococcus
neoformans/gattii
Aprobado por FDA 2012
Caso clínico
• Niño de 1 año 4 meses con cuadro de 2 días de tos,
luego fiebre y evoluciona con dificultad respiratoria
leve a moderada, polipnea y signología obstructiva.
Saturación de O2 de 89%.
Rev Chil Infect 2003; 20 (Supl 1): S59 - S62
Infecciones Respiratorias en niños
SÍNDROME
AGENTE ETIOLÓGICO
Bronquiolitis
VRS, MPVh, VPI, ADV, Influenza, Rinovirus
Asma / Wheezing
VRS, Rinovirus, MPVh
Croup
Parainfluenza, Influenza
Neumonia
Influenza, S pneumoniae, VRS, VPI, ADV, S
pyogenes, Rinovirus
Clinical Infectious Diseases 2011; 52:S284-S289
IDSA recomienda fuertemente el desarrollo e
implementación de técnicas de diagnostico molecular
para detección de virus respiratorios”
Inmunofluorescencia
Ventajas
Desventajas
Bajo costo
Operador
entrenado
Procesa varias
muestras a la vez
Controles
adecuados
Simple de realizar
Microscopia de
fluorescencia
Técnicas por BM
• Examen ideal :
• Disponible 24/7, en pocas
horas
• Idealmente realizado en el
lugar de atención
• Precio razonable
• Que reduzca el riesgo de
bacterias resistentes
• Que sea capaz de diferenciar
entre colonización e infección
(cuantitativo o
semicuantitativo
CID 2011:53 (supl 4)
PACIENTE ONCOLOGICO CON
NEUTROPENIA FEBRIL, SINTOMAS
RESPIRATORIOS
CATEGORIZADO EN ALTO RIESGO
PACIENTE A
ESQUEMA TRIASOCIADO Y
HEMOCULTIVOS + PVR
BUENA EVOLUCION
CLINICA
SIGUE CON ATB HASTA
AUMENTO DE RAN
CON HEMOCULTIVOS (-)
SIN EVIDENCIA DE OTRO
AGENTE CAUSAL
PACIENTE B
ESQUEMA TRIASOCIADO
HEMOCULTIVOS Y BM PARA VIRUS
RESPIRATORIOS
BUENA EVOLUCION
CLINICA
INFLUENZA A (+) HC (-)
SIN EVIDENCIA DE OTROS
PATOGENOS RESPIRATORIOS
SE DEJA OSELTAMIVIR ORAL
SUSPENDE ATB
ALTA
Torres JP. Pediatr Infect Dis J 2012
Film Array RVP
(*): Aprobado por FDA 2012
Comparación de film array con tecnicas de
IF+PCR para HRV
Comparación de las técnicas de Pneumovir/PCR en tiempo real y Biofire
FilmArray para la detección de patógenos respiratorios virales y bacterianos
Torres JP, Farfán M y cols. Sochinf 2014
Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes. Gentileza Dr. M. Farfán
Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes
Antimicrobial prescription after multiplex PCR (+)
Children study (n=1707; retrospective, inpatients with ARI)
• 50% received ATB
• 47% RVP was performed  87% (+)
• Children tested received more often ATB (54 vs 46%)
Variable
RVP (+) n=703
RVP (-) n=106
Received ATB *
51 %
67 %
Stopped ATB
6%
0
Started ATB after
result *
11 %
100 %
* p < 0.05
• RVP (+): OR 0.53 (CI 0.34-0.81)
• RVP (+) for influenza : oseltamivir use OR 27.38 (CI 14-42)
McCulloh et al. J Ped Infect Dis Soc 2014;3:146-53
Cobas Liat PCR
PCR
sens
esp
SGA
98,3%
94,2%
Influenza A
100%
96.8%
Influenza B
100%
94,1%
VRS
Point of care
Rápido (20 min)
No requiere operador experto
No requiere extraccion de DNA
Fácil de usar
Seguro para el operador
“Aumento del diagnóstico etiológico en lactantes
< 3 meses que se hospitalizan por síndrome
febril sin foco al incorporar detección molecular
para enterovirus y virus respiratorios”
Cecilia Piñera , Alejandra Vergara, Romina Valenzuela, Bernardita Coublé,
Macarena Moya, Thelma Suau, Anita Fritis, Carolina Roa,
Maria Elena Santolaya, Juan Pablo Torres
Fondo de investigación Saval- Facultad de Medicina de Universidad de Chile
• Síndrome febril sin foco (SFSF):
Fiebre en ausencia de un foco aparente luego de una anamnesis y examen
físico completo
– 19 a 30% consultas ambulatorias
• Causas en < 3 meses:
– Infecciones bacterianas: 10-27%
– Infecciones virales: %??
– Otros
Rol de la biología molecular en diagnóstico infecciones virales
Baraff LJ, Pediatr Ann. 2008 Oct;37(10):673-9.
Objetivos del estudio
Aumentar el diagnóstico etiológico de SFSF en niños
< 3 meses al incorporar técnicas de detección
molecular para
• enterovirus (EV) en sangre y LCR
• virus respiratorios en hisopado nasofríngeo (HNF)
por sobre el diagnóstico microbiológico
convencional
Confirmación etiológica de los diagnósticos de egreso
con microbiología convencional
Diagnóstico clínico infecciones
bacterianas: 38/101 niños
Confirmado microbiología
convencional: 31/38  82%
– Hemocultivos (+) 7
• E coli: 3
• SBHGA: 2
• SBHGB: 2
– Urocultivo (+) 23
• E coli: 20 / Klebsiella: 1 /
Enterococcus: 1/ Enterobacter
cloacae: 1
Diagnóstico clínico infección
viral: 25/101 niños
Confirmado microbiología
convencional: 3/25  12%
– Rotavirus: 3
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
Infecciones virales
Coinfección VirusBacteria
Etiología (-)
Diagnóstico Microbiológico Convencional
30%
3%
1%
66%
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
21%
32%
11%
36%
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico
de un 34 a 63% (p 0,0001)
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
Infecciones virales
Coinfección VirusBacteria
Etiología (-)
Diagnóstico Microbiológico Convencional
31%
2%
1%
66%
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
21%
32%
11%
36%
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico
de un 34 a 63% (p 0,0001)
HOSPEDERO
Genómica y
Proteómica
HUMANA
Efecto DROGAS
Genómica y
Proteómica
HUMANA
MICROORGANISMO
I
N
F
E
C
T
O
M
A
F
A
R
M
A
C
O
M
A
Genómica y
Proteómica
PATÓGENO
Efecto DROGAS
Genómica y
Proteómica
PATÓGENO
Microarrays
• Pequeño vidrio o chip de 1-2 cm2
• Muestras de DNA ordenadas en el vidrio
• Detectan miles de secuencias de DNA o RNA
BIOFIRMA de niños con y sin infección bacteriana
No supervisado
3357 transcritos diferentes entre los niños
con infección bacteriana vs los controles
97%
2486 genes
Agrupo correctamente 76% (72/95)
Conclusiones
• Nuevas técnicas diagnósticas acortan tiempo de
respuesta, disminuyen complejidad, realizan test
múltiples y optimizarían variables clínicas
• Incorporación en pacientes hospitalizados /
inmunocomprometidos
• Datos apoyan la costo-efectividad del diagnóstico
molecular de virus respiratorios en meningitis y en sepsis
• Importante considerar realidad nacional/local
• Falta conocer aún más el impacto en variables clínicas
Lo mas importante !!!!!