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Concentración Inhibitoria Mínima de tres
extractos de plantas medicinales sobre
bacterias del género Aeromonas, causantes
de enfermedades en peces
Madelin Núñez, Maylée Pozo y Josefa Valladares
Centro de Investigaciones Pesqueras
5ta Ave.y 248, Barlovento, Santa Fé, Ciudad de La Habana (Cuba)
Tel: (537) 29-7107 - Fax: (537) 24 9827
Resumen
Se determinó la concentración inhibitoria mínima de extractos de Eucalyptus sp., Schinus
terebintifolius y Cassia alata frente a tres especies bacterianas del género Aeromonas, patógenas
de peces. Se empleó el método de diluciones seriadas dobles en medio líquido con una concentración bacteriana de 108UFC/mL. Los resultados demostraron que Aeromonas salmonicida atípica tuvo la mayor sensibilidad al actuar con los tres extractos con valores de CIM
entre 0.19 mg/mL y 0.32 mg/mL. Todos los extractos evaluados tuvieron actividad bactericida
sobre al menos una de las especies ensayadas. El extracto de Eucalyptus sp. mostró esta actividad
sobre el 100 % de las cepas probadas.
Palabras claves: peces, plantas medicinales, antibacterianos.
Abstract
The minimal inhibitory concentration of Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius and Cassia alata
extracts was determined in three bacterial species of Aeromonas genus, of pathogenic-fish. Doble
serial dilutions method in liquid medium were used with a bacterial concentration of 108UFC/mL.
The results showed that Aeromonas salmomicida atipica had the highest sensibility when acting
upon the extracts previously mentioned whose values of minimal inhibitory concentration ranged
between 0.10 mg/mL and 0.32 mg/mL . All the extracts assessed had a bactericide activity related
to at least one of the species tested. The Eucalyptus sp. extracts showed a bactericide activity
above 100% of the strains tested.
Key words: fishes, medicinal herbs, antibacterial.
Introducción
La intensificación en los sistemas de cultivo provoca situaciones de estrés que
conllevan a la aparición de enfermedades en los organismos acuáticos, entre las
más comunes se encuentran las causadas por la proliferación de bacterias Gram
negativas como Aeromonas salmonicida típica, Aeromonas salmonicida atípica
y Aeromonas hydrophila. Una de las formas de control de estas enfermedades
se realiza a través de la terapia con antibióticos.
El empleo indiscriminado de antibióticos en la acuicultura ha provocado
marcadas resistencias bacterianas, destrucción de los ecosistemas y elevado
costo de producción, por lo que los medicamentos naturales constituyen una
alternativa viable para mitigar estos daños.
Silveira et al., (1999) comprobaron el efecto antimicrobiano de extractos vegetales sobre patógenos de organismos acuáticos cultivados en Cuba. En
estos casos, los autores demostraron la efectividad y toxicidad de los
medicamentos; pero no se determinó la concentración inhibitoria mínima, que
permitiría establecer la dosis terapéutica adecuada.
El objetivo de la presente investigación fue, determinar la concentración
inhibitoria mínima "in vitro" de tres medicamentos herbarios; Eucalyptus sp.,
Schinus terebintifolius y Cassia alata frente a tres cepas bacterianas del género
Aeromonas, patógenas a peces.
Materiales y Métodos
Se evaluaron extractos fluidos al 70 % de Eucalyptus sp., Schinus
terebintifolius y tintura al 20 % de Cassia alata elaborados según las normas
ramales de calidad (NRSP 300/91, NRSP 311/91, NRSP 312/91, NRSP
314/91), por el Laboratorio de Control de la Calidad de Plantas Medicinales
ubicado en Playa, Ciudad Habana, Cuba.
El contenido de sólidos totales de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y
Cassia alata fue de 14,5%, 11,2% y 4,6% respectivamente.
Se emplearon cepas de Aeromonas salmonicida típica, Aeromonas salmonicida
atípica y Aeromonas hydrophila, aisladas de procesos patológicos ocurridos en
peces de agua dulce. Las cepas bacterianas se conservaban en medio de larga
duración a 20º C en el cepario de referencia del Laboratorio de Microbiología
del Centro de Investigaciones Pesqueras. Las mismas para su rejuvenecimiento
fueron resembradas en tubos de ensayo con caldo triptona soya (OXOID) e
incubados a 30ºC por 24 horas.
Una vez obtenido el crecimiento se prepararon las suspensiones bacterianas; las
cepas bacterianas se sembraron en caldo triptona soya (OXOID) y se incubaron
a 30º C, se observó el crecimiento microbiano en el tiempo hasta obtener una
concentración de trabajo de 108UFC/mL por comparación visual con la escala
de Mc. Farland.
Para la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) se empleó
el método de las diluciones seriadas dobles (1:2) en medio líquido, descrita por
Vanden and Vlietinck (1991).
A partir del porciento de sólidos totales se determinó la concentración a la cual
se encontraba cada extracto medicinal, que sirvió con posterioridad para
evaluar un rango de concentración para el Eucalyptus sp. de 0.25-130.5 mg/mL,
para el Schinus terebintifolius de 0,19- 110.8 mg/mL y para la Cassia alata de
0.08- 41.4 mg/mL.
Los tubos que contenían las diluciones de los extractos, después de inoculados
con las bacterias, fueron incubados a 30º C durante 24 horas; se determinó
posteriormente la CIM de cada extracto para cada microorganismo a través de
la inhibición del crecimiento bacteriano, lograda con una concentración del
agente antimicrobiano. La ausencia de crecimiento en los tubos le confiere al
extracto actividad bacteriostática.
Para la determinación de la concentración bactericida mínima (CBM), se
tomaron alícuotas de aquellos tubos donde se observó inhibición del
crecimiento y se sembraron en placas con agar triptona soya. Después de
incubados a 30º C durante 24 horas, se definió la CBM como la menor
concentración de la sustancia capaz de inhibir totalmente el crecimiento
microbiano.
El control positivo empleado fue el cloranfenicol y el control negativo etanol a
70%.
Resultados y Discusión
Los valores de CIM del extracto fluido al 70% de Eucalyptus sp. se muestran
en la Tabla 1,con un 100% de efectividad sobre todas las cepas bacterianas.
Tuvo actividad bactericida frente a estas con valores de CIM similares a los de
CBM, demostró un amplio espectro de actividad, lo que coincide con los
resultados obtenidos por Silveira et al., (1999). La presencia de taninos,
eucaliptol, terpenos y otros son los responsables de esta actividad. Herwing
(1979), planteó que los taninos han sido utilizados como desinfectantes y
antisépticos en el cultivo de peces. Esta planta se ha recomendado para el
tratamiento en carpas con enteritis bacteriana por Pseudomonas (Bauer et al.,
1977).
En la Tabla 1 se observan los resultados del efecto del extracto fluido al 70 %
de Schinus terebintifolius con valores de CIM coincidentes a la CBM para
Aeromonas salmonicida típica y Aeromonas salmonicida atípica, tuvo por tanto
un efecto bactericida sobre las mismas; no ocurrió así para Aeromonas
hydrophila, donde se observó un efecto bacteriostático. Roig (1988) plantea que
estos extractos presentan propiedades antisépticas, desinfectantes y comprobada
actividad antimicrobiana, actuando frente a cepas patógenas de humanos.
Responsables de esta actividad los taninos presentes en las hojas.
Tabla 1: Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y Concentración Bactericida Mínima (CBM)
de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y Cassia alata. para Aeromonas
Eucalyptus sp.
Schinus terebintifolius
Cassia alata
Especies
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
A. salmonicida típica
1.01
1.01
0.39
0.39
2.58
5.17
A. salmonicida atípica
0.25
0.25
0.19
0.19
0.32
0.32
A. hydrophila
0.50
0.50
1.57
3.15
2.58
5.17
La tintura al 20% de Cassia alata presentó valores de CIM 2.58 mg/mL para
Aeromonas salmonicida típica y Aeromonas hydrophila (Tabla1). Actuando
como bacteriostático frente a estas cepas, evidenciado por la inhibición del
crecimiento microbiano al existir valores de CBM diferentes en una dilución a
los de CIM. Coincidiendo la CBM y CIM para Aeromonas salmonicida atípica,
sobre la que tuvo actividad bactericida.
Guerra, et al., 1995 demostraron la actividad antibacteriana de las hojas de Cassia alata a partir de tintura al 20% y extractos fluidos al 30% y 70% frente a
bacterias y hongos dermatofitos, el de mejor efecto fue el extracto fluido al
70% con valores detectables de CIM y CBM. No ocurrió así con la tintura al
20%.
A diferencia, en nuestro caso, la tintura al 20% de Cassia alata fue efectiva
para todas las cepas con valores de CIM y CBM inferiores a los de las bacterias
de origen clínico.
Aeromonas salmonicida atípica fue la bacteria más sensible al resultar inhibida
con la menor dosis de los tres extractos antibacterianos con valores de CIM
entre 0.19 mg/mL y 0.32 mg/mL. En ningún caso se encontró el efecto del
solvente sobre las células microbianas, la presencia de principios activos en los
extractos le confieren la actividad bacteriostática y bactericida, resultado
similar al obtenido por Silveira et al., (1999) al comprobar la actividad
antibacteriana de estos extractos.
Bibliografía
Bauer, O.N; V. A. Musselius; B.M. Nikoaleva; Y.A. Strelkouv(1977.)
Ictiopatología (en ruso) Edit. Pishevaya promichlennost: 431 p.
Guerra, M.; E. Sánchez; Gálvez, M.A.; García, M.(1995) Actividad
antimicrobiana de Cassia alata. Congreso de la Sociedad Cubana de
Ciencias Farmacéuticas. (en prensa).
Herwing, N.(1979 ) Handbook of drugs and chemicals used in the
treatment of fish diseases. Edit. Charles C. Thomas. Pub. Springfield,
Illinois. U.S.A : 272p.
Norma Ramal NRSP 300/91. Medicamentos de origen vegetal. Hojas de
Eucalipto citriodora. Especificaciones.
Norma Ramal NRSP 311/91. Medicamentos de origen vegetal.
Extractos fluidos ytinturas. Procesos tecnológicos.
Norma Ramal NRSP 312/91. Medicamentos de origen vegetal.
Extractos fluidos y tinturas. Métodos de ensayo.
Norma Ramal NRSP 314. Medicamentos de origen vegetal. Extracto
fluido de Eucalipto citriodora. Especificaciones.
Roig, J. T.(1988) Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba.
Tomo I . Edit. Científico-Técnica, segunda edic. La Habana: 548 p.
Silveira.R; M. Núñez; A. Prieto; M. Martínez; J.Valladares; M.
Pozo.(1999) Actividad terapéutica de extractos naturales de origen
vegetal para el control de parásitos y bacterias de organismos acuáticos
de cultivo. Presentado en VI Jornada Científica de Ciencia y Tecnología
Pesqueras. Ciudad Habana. Cuba. 4-7 Septiembre. 1999.
Vanden, O.B and A.J. Vlietrinck( 1991). Screening methods for
antibacterial and antiviral agents from Higher Plants. ISBNO 12461016-1
. Methods in plant Biochemestry (6,4-6) Academia Press Limited.
Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 14, julio 2001