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Concentración Inhibitoria Mínima de tres extractos de plantas medicinales sobre bacterias del género Aeromonas, causantes de enfermedades en peces Madelin Núñez, Maylée Pozo y Josefa Valladares Centro de Investigaciones Pesqueras 5ta Ave.y 248, Barlovento, Santa Fé, Ciudad de La Habana (Cuba) Tel: (537) 29-7107 - Fax: (537) 24 9827 Resumen Se determinó la concentración inhibitoria mínima de extractos de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y Cassia alata frente a tres especies bacterianas del género Aeromonas, patógenas de peces. Se empleó el método de diluciones seriadas dobles en medio líquido con una concentración bacteriana de 108UFC/mL. Los resultados demostraron que Aeromonas salmonicida atípica tuvo la mayor sensibilidad al actuar con los tres extractos con valores de CIM entre 0.19 mg/mL y 0.32 mg/mL. Todos los extractos evaluados tuvieron actividad bactericida sobre al menos una de las especies ensayadas. El extracto de Eucalyptus sp. mostró esta actividad sobre el 100 % de las cepas probadas. Palabras claves: peces, plantas medicinales, antibacterianos. Abstract The minimal inhibitory concentration of Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius and Cassia alata extracts was determined in three bacterial species of Aeromonas genus, of pathogenic-fish. Doble serial dilutions method in liquid medium were used with a bacterial concentration of 108UFC/mL. The results showed that Aeromonas salmomicida atipica had the highest sensibility when acting upon the extracts previously mentioned whose values of minimal inhibitory concentration ranged between 0.10 mg/mL and 0.32 mg/mL . All the extracts assessed had a bactericide activity related to at least one of the species tested. The Eucalyptus sp. extracts showed a bactericide activity above 100% of the strains tested. Key words: fishes, medicinal herbs, antibacterial. Introducción La intensificación en los sistemas de cultivo provoca situaciones de estrés que conllevan a la aparición de enfermedades en los organismos acuáticos, entre las más comunes se encuentran las causadas por la proliferación de bacterias Gram negativas como Aeromonas salmonicida típica, Aeromonas salmonicida atípica y Aeromonas hydrophila. Una de las formas de control de estas enfermedades se realiza a través de la terapia con antibióticos. El empleo indiscriminado de antibióticos en la acuicultura ha provocado marcadas resistencias bacterianas, destrucción de los ecosistemas y elevado costo de producción, por lo que los medicamentos naturales constituyen una alternativa viable para mitigar estos daños. Silveira et al., (1999) comprobaron el efecto antimicrobiano de extractos vegetales sobre patógenos de organismos acuáticos cultivados en Cuba. En estos casos, los autores demostraron la efectividad y toxicidad de los medicamentos; pero no se determinó la concentración inhibitoria mínima, que permitiría establecer la dosis terapéutica adecuada. El objetivo de la presente investigación fue, determinar la concentración inhibitoria mínima "in vitro" de tres medicamentos herbarios; Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y Cassia alata frente a tres cepas bacterianas del género Aeromonas, patógenas a peces. Materiales y Métodos Se evaluaron extractos fluidos al 70 % de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y tintura al 20 % de Cassia alata elaborados según las normas ramales de calidad (NRSP 300/91, NRSP 311/91, NRSP 312/91, NRSP 314/91), por el Laboratorio de Control de la Calidad de Plantas Medicinales ubicado en Playa, Ciudad Habana, Cuba. El contenido de sólidos totales de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y Cassia alata fue de 14,5%, 11,2% y 4,6% respectivamente. Se emplearon cepas de Aeromonas salmonicida típica, Aeromonas salmonicida atípica y Aeromonas hydrophila, aisladas de procesos patológicos ocurridos en peces de agua dulce. Las cepas bacterianas se conservaban en medio de larga duración a 20º C en el cepario de referencia del Laboratorio de Microbiología del Centro de Investigaciones Pesqueras. Las mismas para su rejuvenecimiento fueron resembradas en tubos de ensayo con caldo triptona soya (OXOID) e incubados a 30ºC por 24 horas. Una vez obtenido el crecimiento se prepararon las suspensiones bacterianas; las cepas bacterianas se sembraron en caldo triptona soya (OXOID) y se incubaron a 30º C, se observó el crecimiento microbiano en el tiempo hasta obtener una concentración de trabajo de 108UFC/mL por comparación visual con la escala de Mc. Farland. Para la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) se empleó el método de las diluciones seriadas dobles (1:2) en medio líquido, descrita por Vanden and Vlietinck (1991). A partir del porciento de sólidos totales se determinó la concentración a la cual se encontraba cada extracto medicinal, que sirvió con posterioridad para evaluar un rango de concentración para el Eucalyptus sp. de 0.25-130.5 mg/mL, para el Schinus terebintifolius de 0,19- 110.8 mg/mL y para la Cassia alata de 0.08- 41.4 mg/mL. Los tubos que contenían las diluciones de los extractos, después de inoculados con las bacterias, fueron incubados a 30º C durante 24 horas; se determinó posteriormente la CIM de cada extracto para cada microorganismo a través de la inhibición del crecimiento bacteriano, lograda con una concentración del agente antimicrobiano. La ausencia de crecimiento en los tubos le confiere al extracto actividad bacteriostática. Para la determinación de la concentración bactericida mínima (CBM), se tomaron alícuotas de aquellos tubos donde se observó inhibición del crecimiento y se sembraron en placas con agar triptona soya. Después de incubados a 30º C durante 24 horas, se definió la CBM como la menor concentración de la sustancia capaz de inhibir totalmente el crecimiento microbiano. El control positivo empleado fue el cloranfenicol y el control negativo etanol a 70%. Resultados y Discusión Los valores de CIM del extracto fluido al 70% de Eucalyptus sp. se muestran en la Tabla 1,con un 100% de efectividad sobre todas las cepas bacterianas. Tuvo actividad bactericida frente a estas con valores de CIM similares a los de CBM, demostró un amplio espectro de actividad, lo que coincide con los resultados obtenidos por Silveira et al., (1999). La presencia de taninos, eucaliptol, terpenos y otros son los responsables de esta actividad. Herwing (1979), planteó que los taninos han sido utilizados como desinfectantes y antisépticos en el cultivo de peces. Esta planta se ha recomendado para el tratamiento en carpas con enteritis bacteriana por Pseudomonas (Bauer et al., 1977). En la Tabla 1 se observan los resultados del efecto del extracto fluido al 70 % de Schinus terebintifolius con valores de CIM coincidentes a la CBM para Aeromonas salmonicida típica y Aeromonas salmonicida atípica, tuvo por tanto un efecto bactericida sobre las mismas; no ocurrió así para Aeromonas hydrophila, donde se observó un efecto bacteriostático. Roig (1988) plantea que estos extractos presentan propiedades antisépticas, desinfectantes y comprobada actividad antimicrobiana, actuando frente a cepas patógenas de humanos. Responsables de esta actividad los taninos presentes en las hojas. Tabla 1: Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y Concentración Bactericida Mínima (CBM) de Eucalyptus sp., Schinus terebintifolius y Cassia alata. para Aeromonas Eucalyptus sp. Schinus terebintifolius Cassia alata Especies CIM CBM CIM CBM CIM CBM (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) A. salmonicida típica 1.01 1.01 0.39 0.39 2.58 5.17 A. salmonicida atípica 0.25 0.25 0.19 0.19 0.32 0.32 A. hydrophila 0.50 0.50 1.57 3.15 2.58 5.17 La tintura al 20% de Cassia alata presentó valores de CIM 2.58 mg/mL para Aeromonas salmonicida típica y Aeromonas hydrophila (Tabla1). Actuando como bacteriostático frente a estas cepas, evidenciado por la inhibición del crecimiento microbiano al existir valores de CBM diferentes en una dilución a los de CIM. Coincidiendo la CBM y CIM para Aeromonas salmonicida atípica, sobre la que tuvo actividad bactericida. Guerra, et al., 1995 demostraron la actividad antibacteriana de las hojas de Cassia alata a partir de tintura al 20% y extractos fluidos al 30% y 70% frente a bacterias y hongos dermatofitos, el de mejor efecto fue el extracto fluido al 70% con valores detectables de CIM y CBM. No ocurrió así con la tintura al 20%. A diferencia, en nuestro caso, la tintura al 20% de Cassia alata fue efectiva para todas las cepas con valores de CIM y CBM inferiores a los de las bacterias de origen clínico. Aeromonas salmonicida atípica fue la bacteria más sensible al resultar inhibida con la menor dosis de los tres extractos antibacterianos con valores de CIM entre 0.19 mg/mL y 0.32 mg/mL. En ningún caso se encontró el efecto del solvente sobre las células microbianas, la presencia de principios activos en los extractos le confieren la actividad bacteriostática y bactericida, resultado similar al obtenido por Silveira et al., (1999) al comprobar la actividad antibacteriana de estos extractos. Bibliografía Bauer, O.N; V. A. Musselius; B.M. Nikoaleva; Y.A. Strelkouv(1977.) Ictiopatología (en ruso) Edit. Pishevaya promichlennost: 431 p. Guerra, M.; E. Sánchez; Gálvez, M.A.; García, M.(1995) Actividad antimicrobiana de Cassia alata. Congreso de la Sociedad Cubana de Ciencias Farmacéuticas. (en prensa). Herwing, N.(1979 ) Handbook of drugs and chemicals used in the treatment of fish diseases. Edit. Charles C. Thomas. Pub. Springfield, Illinois. U.S.A : 272p. Norma Ramal NRSP 300/91. Medicamentos de origen vegetal. Hojas de Eucalipto citriodora. Especificaciones. Norma Ramal NRSP 311/91. Medicamentos de origen vegetal. Extractos fluidos ytinturas. Procesos tecnológicos. Norma Ramal NRSP 312/91. Medicamentos de origen vegetal. Extractos fluidos y tinturas. Métodos de ensayo. Norma Ramal NRSP 314. Medicamentos de origen vegetal. Extracto fluido de Eucalipto citriodora. Especificaciones. Roig, J. T.(1988) Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. Tomo I . Edit. Científico-Técnica, segunda edic. La Habana: 548 p. Silveira.R; M. Núñez; A. Prieto; M. Martínez; J.Valladares; M. Pozo.(1999) Actividad terapéutica de extractos naturales de origen vegetal para el control de parásitos y bacterias de organismos acuáticos de cultivo. Presentado en VI Jornada Científica de Ciencia y Tecnología Pesqueras. Ciudad Habana. Cuba. 4-7 Septiembre. 1999. Vanden, O.B and A.J. Vlietrinck( 1991). Screening methods for antibacterial and antiviral agents from Higher Plants. ISBNO 12461016-1 . Methods in plant Biochemestry (6,4-6) Academia Press Limited. Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 14, julio 2001