Download Secuenciación genómica de virus vegetales

Secuenciación genómica de virus
vegetales
Dra. Ana Julia Distéfano
Instituto de Biotecnología, INTA-Castelar
Enfermedades del maíz,
una guía para su
identificación en el campo.
CIMMYT
Maíz de Orán
(Salta) con clorosis
en la base de las
hojas
Sugarcane mosaic virus (SCMV)
Maize dwarf mosaic virus (MDMV)
Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus
Morfología: filamentosos y flexibles,
de simetría helicoidal y desnudos.
700-900 nm de largo y 11-13 nm de
ancho.
Género Potyvirus
Potato virus X (PVX), Potexvirus
Potato leafroll virus (PLRV), Polerovirus
Tejido vegetal
infectado
Purificación de la
partícula viral
Obtención de
DNA o RNA total
Obtención del
material genético
del virus
PCR o RT-PCR
Genotecas
PCR o RT-PCR
Genotecas
RNA
DNA
cDNA
Romper el DNA
3´
5´
cDNA 1ª cadena
Clonar
Primers al azar o poliT
Transcriptasa reversa
3´
5´
Secuenciar
cDNA 2º cadena
RNAsa H
DNA pol I
Clonar
Secuenciar
PCR o RT-PCR
Se diseñan primers en base a las secuencias depositadas en las bases de
datos públicas de virus relacionados al virus en estudio
Genoma DNA
PCR
Genoma RNA
cDNA
PCR
Oligonucleótido diseñado a partir de
un motivo altamente conservado en el
dominio NIb, amplifica la región 3’ del
genoma (producto:1,7-1,9 Kpb)
Los extremos 5´y 3’ del genoma son difíciles de obtener
5’
3’
1
2
Rapid Amplification of cDNAs Ends (RACE)
3’ RACE
5’ RACE
5’
5’
AAAAA 3’
3’ TTTTTT
AP
5’
3’
3’
5’
GSP
Transcriptasa reversa
5’
AAAAA 3’
TTTTTT
3’
Transcriptasa reversa
5’
3’
5’
3’
5’
RNAsa H
3’
RNAsa H
5’
TTTTTT
3’
Taq Pol
PCR
5’
TdT
3’ CCCC
5’
GSP
5’
3’
3’
TTTTTT
5’
Taq Pol
PCR
3’
5’
AUAP
5’
3’
5’
TTTTTT
AAAAAA
AAP
GGGG 3’
3’ CCCC
5’
3’ 5’
GSP 2
5’
3’
5’
3’
GSP2
5’
3’
GGGG
CCCC
3’
5’
Métodos de secuenciación de nueva generación
Instituto de Biotecnología- INTA Castelar
Secuenciación de genomas completos y regiones candidatas
Secuenciación y análisis de sRNAs
454 Sequencing –INDEAR, Rosario
Secuenciación de gDNA de virus por shotgun
Targeted resequencing strategies: estudiar una región genómica de interés
a partir de un producto de PCR
Detectar y cuantificar variantes de baja frecuencia, como mutaciones virales
resistentes a drogas
Aplicaciones a la genómica de virus
Tejido vegetal
infectado
Purificación de la
partícula viral
Obtención del
material genético
del virus
Genotecas
PCR o RT-PCR
Shotgun sequencing
Obtención de
DNA o RNA total
PCR o RT-PCR
Shotgun sequencing
Estudios de variabilidad de un virus a campo
Targeted resequencing strategies (454 Sequencing system)
PCR amplicon sequencing
El producto de PCR se amplifica con primers que poseen una región de adaptadores
especificos para el 454 y luego se secuencia sin necesidad de preparar una library
Analizar pools de muestras y se obtienen secuencias independientes del amplicon
( 100 ó 1000 ) en una única corrida
Secuenciacion de RNAs pequeños (Illumina)
En respuesta a una infección, los genomas virales son procesados por proteínas ribonucleasas
Dicer-like (DCL) en RNAs pequeños virales (vsRNAs) de tamaños discretos. Los vsRNAs son
luego usados como guias para el silenciamiento del genoma del virus.
Estudiar y caracterizar el perfil de vsRNAs que se producen durante el proceso
de Infección del virus en la planta
Caracterizar los miRNAs que se expresan luego de una infeccion viral
Se obtiene sRNAs pequeños de plantas infectadas y no infectadas
Se clonan y se realiza deep-sequenced utlizando la plataforma Illumia
Los vsRNAs son de 21 a 24 nt de longitud y sus secuencias deben coincidir
con las del genoma viral.
En general están distribuidos a lo largo de todo el genoma, pero hay regiones mas
representadas y en general son zonas esenciales del genoma viral. “hot spots”
Los vsRNA mapean en orientación sentido y antisentido del genoma viral. A veces
hay cantidades equivalentes de vsRNAs en sentio y antisentido, y aveces no
Información importante para diseñar estrategias de control de la
enfermedad por PTGS
Ejemplo de un virus nuevo encontrado por pirosecuenciación
Phytopathology 2013
Identification of a new enamovirus associated with citrus vein enation
disease by deep sequencing of small RNAs.
Vives MC, Velázquez K, Pina JA, Moreno P, Guerri J, Navarro L.
Con el objetivo de identificar el agente causal de la enfermedad “citrus vein
enation”, examinaron por deep sequencing (Solexa-Illumina) la fracción de
small RNA (sRNA) de plantas de cítricos (Etrog citron) con síntomas y
sanas.
El ensamblado de los Contigs de los vsRNA mostraron identidad de
secuencia con Luteovirus, particularmente con Pea enation mosaic virus,
perteneciente al genero Enamovirus. La secuencia genómica del RNA de
este nuevo virus , denominado provisoriamente Citrus vein enation virus
(CVEV), fué completada y caracterizada.
Secuenciación y caracterización molecular del virus
del Mal de Río Cuarto (MRCV) del maíz.
.
A. J. Distéfano, V. Mongelli, G. Maroniche, E. Hopp, M. del Vas
Instituto de Biotecnología-INTA
CONICET
Distribución de la enfermedad
Tomado del informe PROMARC, IFFIVE-INTA
Síntomas de la enfermedad
 Acortamiento de los entrenudos y altura reducida
Tomado del informe PROMARC, IFFIVE-INTA
 Las mazorcas presentan escasa formación de granos
 Síntoma distintivo:
Enaciones en las nervaduras en el envés de las hojas
Insecto vector: Delphacodes kuscheli
Fennah (chicharrita)
Partícula del MRCV
Genoma del MRCV
4500 pb
S1
S2/S3
S4
S5
S6
S7
S8
1700 pb
S10
S9
10 segmentos genómicos
de dsRNA (~ 29 Kpb)
Estrategias de clonado y secuenciación (1999-2002)
 Genoteca de cDNA con oligonucleótidos al azar
 Genotecas de cDNA con oligonucleótidos específicos
 Amplificación por RT-PCR
Amplificación de los extremos 5’ y 3’ de los segmentos
por “Rapid Amplification cDNA Ends” o RACE
5’
3’
MRCV S1
1
2
3
4
Secuenciación y caracterización del genoma
del virus asociado a la enfermedad azul del
algodón.
V. Delfosse, Y. Agrofoglio, M.F Casse, I. Bonacic Kresic, E. Hopp, A.J. Distéfano
Instituto de Biotecnología-INTA
CONICET
Producción de Algodón en Argentina
El algodón (Gossypium spp.) es un cultivo regional importante en el NEA.
Enfermedad azul del algodón
Es causada por
Cotton leafroll dwarf
virus
Osmério Pupim Junior et al., 2008.
Corrêa et al., 2005
Enrollamiento de las hojas
hacia su cara inferior
Hojas con textura coriácea
con coloración verde
oscura–azulada
Clorosis en las nervaduras
Enanismo, entrenudos
cortos y tallos en zig-zag
Vector: Aphid gossypii Glover o pulgón del algodón
El virus es transmitido por el vector Aphis gossypii Glover en forma
persistente, circulativa y no-propagativa
No se transmite en forma mecánica
Virus esta restringido a las células acompañantes del floema
Familia Luteoviridae
 Los viriones son icosahedricos, de aproximadamente 25 nm de diámetro
 Limitados al floema de sus plantas huéspedes
 Genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positiva de entre 5 a 6 kb
Los virus pertenecientes a la familia Luteoviridae se agrupan en tres géneros
Género
Especie tipo
Luteovirus
Barley yellow dwarf virus-Pav, BYDV-PAV
Polerovirus
Potato leafroll virus, PLRV
Enamovirus
Pea enation mosaic virus-1, PEMV-1
Organización genómica de los Polerovirus
RdRp
P0
5’
ORF0
ORF2
ORF1
sgRNA
CP
RT
ORF3
ORF5
ORF4
MP
El genoma esta formado por seis marcos abiertos de lectura (ORFs)
Los ORFs 0, 1 y 2, próximos al extremo 5´, se traducen a partir del RNA viral dando como producto las
proteínas P0, P1 y la proteína P1-2 a partir de un cambio de marco traduccional (frameshift). La
proteína P0 corresponde al supresor de silenciamiento, las proteínas P1 y P1-2 son componentes de la
RNA polimerasa dependiente de RNA.
Los ORFs 3, 4 y 5, próximos al extremo 3´ viral, se traducen a partir de un RNA subgenómico (sgRNA),
dando lugar a las proteínas P3, P4 y P3-5. La proteína P3 corresponde a la cápside viral, P4 a la proteína
de movimiento viral y P3-5 al dominio readthrough de la proteína de cápside
3’
OBJETIVOS GENERALES
Los objetivos generales del trabajo son la secuenciación y caracterización
del genoma del virus asociado a la enfermedad azul del algodón presente
en la región del NEA, y la caracterización de las proteínas codificadas por
el mismo para profundizar los conocimientos básicos que se tienen sobre
las funciones virales.
Secuenciación del genoma (2008-2009)
En la EEA Saenz Peña del Chaco, se obtuvieron plantas infectadas con el
virus presente en la zona en condiciones controladas de invernáculo.
Extraccion de RNA con Trizol
Síntesis de cDNA
PCR
Se utilizaron las secuencias de los siguientes Polerovirus :
Turnip yellows virus (TYV, NC003743),
Beet mild yellowing virus (BMYV, AF167480),
Beet western yellows virus (BWYV, NC004756),
Beet chlorosis virus (BChV, NC002766)
Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV, AY758560),
1
4
6
8
3
2
10
5
7
*
ORF 0
12
15
9
13
11
P0
ORF 2
225
225
18
ORF 5
ORF 3
P3
3630
21
22
5866
4236
22.3 kDa
P1
70.1
kDa
16
ORF4
856
29.8 kDa
19
20
◊
ORF 1
71
17
14
2156
P5
3630
5717
77.1 kDa
P1+P2
1706
1706
3661
3442
P4
4185
20 kDa
119 kDa
Esta estrategia permitió secuenciar el genoma viral
completo (5,866 Kb)
Distefano y col, Archieves of Virology 2010
Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV)
Familia Luteoviridae, genero Polerovirus
Genoma de ARN simple cadena positiva de 5866 nt
Posee los seis marcos abiertos de lectura (ORFs) típicos de los Polerovirus
RdRp
P0
5’
ORF0
ORF2
ORF1
sgRNA
CP
RT
ORF3
ORF5
3’
ORF4
MP
Distéfano, 2010
PHYLIP_1
PEMV
TVDV
100
98
93
88
80
96
85
100
96
100
100
0.1
Neigbhor joining method
SbDV
BLRV
PLRV
CYDV-RPV
100
CYDV-RPS
GRAV
CAbYV
CpSDaV
CLRDVBr
100
100
CLRDVAr
BMYV
88
BWYV
100
TYV
73
BChV
ScYLV
BYDV-MAV
BYDV-PAV
BYDV-PAS
Polerovirus
*
Luteovirus
Enamovirus
Enfermedad azul atípica
En las campañas de algodón 2009/2010, 2010/2011, 2012/2013 se observaron
plantas con síntomas atípicos de enfermedad azul en la provincia de Chaco
Entrenudos acortados
Enrollamiento de las hojas y hojas
arrugadas
Clorosis internerval y marginal de las
hojas afectadas
Las plantas infectadas tardíamente en el
desarrollo presentan una morfología
normal en la parte inferior de la planta
pero deformaciones en las hojas
apicales (achaparramiento)
Enfermedad azul atípica
Los síntomas no se corresponden con enfermedades descriptas en el
país
Se observó inicialmente tanto sobre las variedades susceptibles como
las resistentes.
Incidencia entre un 7 a un 12% de plantas afectadas, dependiendo del
material genético y del lugar geográfico
En todos los casos y en ambas campañas agrícolas, se observó la
presencia del pulgón del algodonero (Aphis gossypii) y también en
algunos lotes la presencia de mosca blanca (Bemisia tabacci).
Los síntomas se observaron en variedades de algodón susceptibles y
resistentes en enfermedad azul
Debido a la sintomatología presentada por las plantas de algodón infectadas y por el tipo
de insecto vector observado en los campos afectados (mosca blanca) y pulgón
algodonero (Aphis gossypii), se analizaron por PCR las siguientes familias virales:
Familia Geminiviridae
Familia Bromoviridae
Género Begomovirus
Cotton leaf crumple virus (CLCrV)
Cotton leaf curl disease (CLCuD)
Abutilon mosaic virus (AbMV)
Género Ilarvirus
Tobacco streak virus (TSV)
Familia Potyviridae
NEGATIVO
Familia Luteoviridae
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
Un virus recombinante o una nueva variante del CLRDV?
Los virus recombinantes son comunes en esta familia. Se analizó la región
intergénica con primers universales que amplifican a virus del todo el género de
polerovirus
La región analizada tiene un 97% de identidad con CLRDV
Se descartó la idea de que el virus se generó por
recombinación
Una nueva variante del CLRDV
La variabilidad natural en la secuencia genómica de los virus de
RNA es del 2-3%.
La región analizada era similar al CLRDV pero había un quiebre en
la resistencia y además las plantas presentaban distinta
sintomatología.
Por este motivo se decidió secuenciar el nuevo virus por completo
Estrategia de secuenciación
Obtuvimos la secuencia completa del genoma utilizando primers
específicos, diseñados en base a la nueva secuencia viral obtenida de un
lado, y un primer degenerado del otro lado.
Identidad de secuencia en aminoácidos y nucleótidos entre el CLRDV y la
nueva variante
P0
P1
P1-P2
P3
P4
P3-P5
Amino acid sequence identity
88,2%
93,6%
95,6%
98,0%
95,4%
96,6%
Nucleotide sequence identity
91,6%
94,4%
95,5%
97,9%
98,7%
96,7%
La proteína P0 tiene menos del 90% de identidad
con el CLRDV
Agrofoglio et alresultados no publicados 2014
Uno de los criterios para determinar una nueva especie dentro del género
Polerovirus es una diferencia mayor al 10% en la secuencia de aminoácidos
de cualquier producto génico.
Además, la sintomatología diferentes es un criterio importante para la
definición de buevas especies.
Por lo tanto proponemos que la enfermedad azul atípica esta
asociada a una especie viral nueva del genero Polerovirus y
proponemos denominarla Cotton leafroll bushy virus (CLRBV)
Desarrollo y caracterización de un clon infectivo del CLRDV
pGEMT-35S-CLRDV
sonda
ORF5
ORF3
ORF2
ORF0
p35S
ORF4
ORF1
pBin19-CLRDV
Sal I
p35S
LB
Sal I
CLRDV
A(15)
RB
Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404
A(15)
Estudio de la capacidad de replicación del clon infectivo en
plantas de algodón
Se registró la aparición de síntomas
típicos
de
la
infección
(enrollamiento de las hojas,
enanismo, color verde-azulado) y
se analizó la capacidad de
replicación y de infección del clon
infectivo de cDNA en las hojas
sistémicas (NI) mediante RT-PCR y
Northern blot.
Delfosse et al, Virus Res 2013
Virus quimeras
Reemplazo de P0
Reemplazo de MP
Ejemplos de la aplicación de la tecnología Illumina
MUCHAS GRACIAS