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SINTESIS QUIMIO-ENZIMATICA DE POTENCIALES INHIBIDORES DE αGLUCOSIDASA A PARTIR DE SACAROSA.
Resumen
Se describe la obtención de intermediarios de iminoazúcares a partir de sacarosa, mediante
una aproximación quimio-enzimática que sigue tres variantes planteadas en esquemas 1, 2
y 3, las cuales difieren en virtud que la primera y tercera plantean la incorporación de un
grupo amino a la posición 4’ de fructosa y la segunda a la posición 6 de glucosa de la
sacarosa. La estrategia general propone la protección selectiva de algunas posiciones
hidroxílicas del disacárido y posterior secuencia de tosilación, intercambio por azida y
posterior reducción y desprotección para generar los correspondientes derivados de
sacarosa 7 y 17 y 26. Una vez instalado el grupo amino en las posiciones antes
mencionadas se propone la hidrólisis enzimática de los derivados de sacarosa modificados
para lo cual se emplea invertasa comercial y aislada de Cellulomona flavigena. De acuerdo
a la hipótesis de trabajo la acción hidrolítica por la acción de invertasa sobre los derivados
de sacarosa genera los derivados monosacáridos 9 y 18 los cuales llevan a cabo un
proceso de adición nucleofílica intramolecular para generar los iminoazúcares 10 y 20 de
potencial actividad inhibitoria de α-glucosidasa. Se describe el procedimiento de
aislamiento de la enzima invertasa a partir de la cepa de Cellulomona flavigena así como la
síntesis y caracterización estructural por resonancia magnética nuclear de los intermediarios
de sacarosa 5, 12 y 25 de acuerdo a los esquemas planteados.
Introducción
Los inhibidores de α-glicosidasa son compuestos de naturaleza glicosídica que contienen
en su estructura nitrógeno intra o extracíclico. Estos derivados han cobrado una gran
importancia en la terapéutica debido a que al inhibir α-glicosidasa producen un efecto
hipoglucemiante y por consiguiente son de gran utilidad en el control de glucosa sanguínea
en pacientes con diabetes mellitus. Actualmente el pseudotetrasacárido Acarbosa y el
iminoazúcar Miglitol el cual es un derivado de 1-desoxynojirimicina son 2 inhibidores de α
-glicosidasa aprobados para su uso en pacientes con diabetes tipo II (Jacob, 1995). Otros
candidatos que se encuentran en fase clínica avanzada son castanopermina, swainsonina,
kifunensina, y desoximanojirimicina entre otros representados en la figura 1.
O
O
OH
HO
HO
N
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HO
OH
NH
N
OH
OH
desoximannonojirimicina
castanospermina
OH
kifunensina
swainsonina
OH
OH
OH
HO
HO
NH
N
HO
HO
OH
O
OH
N
H HO
OH
OH
O
OH
N
O
OH
HO
OH
O
O
OH
HO
Acarbosa
OH
OH
Miglitol
Figura 1. Estructura de inhibidores de α-glicosidasa usados en el tratamiento de diabetes
mellitus tipo II.
Mecanismo de Inhibición de las Glicosidasa
Las glicosidasas son enzimas que desempeñan un papel importante en el procesamiento de
varias glicoproteínas y glicolípidos, y se ha postulado que el mecanismo de inhibición
procede a través de un estado de transición de media silla cargado positivamente que
interactúa con los residuos de ión carboxilato y GDP (Guanin Difosfato) en el sitio activo
de la enzima como se observa en la figura 2 (Ichikawa, 1992).
B
H
O
NH2
HO
OH
OH
G
OH
O
OH
O
P
O
OH
O
O
O
P
O
O
Figura 2. Mecanismo de inhibición de iminoazúcares en el sitio de acción de
α-glucosidasa.
Asimismo, se han determinado las posiciones dentro de la secuencia glicosídica sobre los
cuales los inhibidores de α-glucosidasa ejercen su actividad inhibitoria (Wong and
Kajimoto, 1995).
Preparación de Iminoazúcares
El desarrollo de métodos de síntesis asimétrica tanto químicos como enzimáticos para la
obtención de iminoazúcares ha tenido un significativo desempeño y potencial generando
una importante variedad de sustancias activas en el tratamiento del HIV, diabetes,
enfermedad de Gaucher, y cáncer. (Brito-Arias, 2006). Algunas de las rutas sintéticas
descritas con éxito incluyen aproximaciones tipo azida a partir de monosacáridos
(Ichikawa, 1998; Roy, 2006), así como por síntesis enantioselectiva de tipo química y
enzimática. Para el primer caso se ha reportado la síntesis enantioselectiva en presencia de
(S)-Prolina como Organocatalizador (Liao, 2006), y para el segundo de aldolasas (Gijsen,
1996) y lipasas (Look, 1993) a partir de diversos sustratos donantes entre los que se
mencionan 2-azido aldehídos (Hung, 1991), epoxidos (Kanerva, 1993), cinamaldehido
(Wong, 1995), dihidroxi acetona fosfato (DHAP) seguido por aminación reductiva.
Síntesis químio-enzimática de cabohidratos.
La síntesis químio-enzimática de sustancias de potencial uso terapéutico es una poderosa
herramienta combinatoria ya que aprovecha los beneficios de ambas, es decir a través de la
síntesis orgánica se pueden preparar una amplia variedad de precursores de manera
accesible, y de la biocatálisis enzimática para llevar a cabo transformaciones con una
elevada estéreo especificidad y estéreo selectividad. El uso de enzimas para llevar
transformaciones químicas ha tenido un desarrollo notable principalmente en la síntesis
asimétrica y la resolución cinética de mezclas racémicas. Recientemente la desimetrización
entendiéndose como la modificación enzimática que elimina uno o más elementos de
simetría como estrategia para obtener sustancias óptimamente puras se revela como otra
estrategia de gran potencial (García-Urdiales, 2005).
La síntesis enzimática de carbohidratos requiere principalmente del uso de aldolasas. Estas
enzimas generan hexosas a partir de componentes de tres carbonos a través de una
condensación aldólica. Existen alrededor de 30 aldolasas identificadas y aisladas siendo
estas clasificadas en aldolasas tipo 1 y tipo 2 dependiendo del mecanismo involucrado.
Desde el punto de vista sintético las aldolasas se clasifican en 5 grupos dependiendo del
donante y el producto formado (H.M. Gijsen, L. Qiao, W. Fitz, and C.-H. Wong, Chem.
Rev. 96, 443 (1996): Dihidroxiacetona fosfato aldolasa,Piruvato aldolasa,2-Desoxiribosa 5fosfato aldolasa, Glicina aldolasa y Otras aldolasas.
Sacarosa e Invertasa
La sacarosa es un disacárido abundante y accesible que se obtiene de la caña de azúcar y
México ocupa el sexto lugar como productor a nivel mundial y de donde se extrae del 8 al
15% de sacarosa a partir de la zafra de la caña de azúcar (www.perafan.com).
La sacarosa es hidrolizada enzimáticamente por la invertasa. El nombre oficial de la
invertasa es β-fructofuranosidasa fructohidrolasa (E.C. 3.2.1.26) también conocida como
beta-fructosidasa o sacarasa. Actúa sobre el enlace O-glicosídico de la sacarosa
produciendo una mezcla equimolar de los monosacáridos α-D-glucopiranosa y α-Dfructofuranosa en cantidades equivalentes (figura 3). Su nombre se debe a que producto de
su hidrólisis cambia su rotación óptica de la sacarosa [+ 66.5] a una rotación negativa, que
es promedio de la rotación de la glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4].
OH
OH
O
O
OH
O OH
OH
OH
Invertasa
O
OH
O
+
HO
HO
OH
OH
HO
OH
Sacarosa
OH
HO
OH
α-D-glucopiranosa
HO
OH
α-D-fructofuranosa
Figura 3. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa
Métodos y Materiales
producción de la invertasa
Microorganismo
Cellulomonas flavigena (clave de identificación) (Colección de microorganismos del
CINVESTAV), la cepa de este microorganismo se resembró cada mes en tubos inclinados
con un medio de conservación.
Producción de invertasa
La producción del extracto enzimático se realizo en un cultivo por lote. El crecimiento de
Cellulomonas flavigena en el tubo de ensayo se resuspendió en 3.3 ml de regulador de
fosfatos (1.22 M pH 7) y se transfirió a un matraz Erlenmeyer nefelométrico de 500 ml con
100 ml de medio conteniendo: 10 g/L Glicerol, 3 g/L (NH4)2SO4, 0.16 g/L MgSO47H2O,
0.075 g/L NaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O, 800 µg/L ZnSO47H2O, 21µg/L MnCl2 4H2O2,
4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina
El cultivo se incubo en una agitadora orbital a 150 rpm y 37ºC por 24 h. La cinética de
crecimiento fue seguida por medición directa de las unidades klett en un fotocolorímetrico.
La biomasa fue usada para el crecimiento en reactor.
Se realizo un cultivo por lote en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de 10 L,
conteniendo 5 L con la siguiente composición: 10 g/L Sacarosa,3 g/L (NH4)2SO4,0.16 g/L
MgSO47H2O, 0.075 g/LNaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O,800 µg/L ZnSO47H2O,21µg/LMnCl2
4H2O2,120µg/L FeSO4 /H2O,120µg/L CoCl2 6H2O, 0.13µg/L Na2MoO4 2H2O,0.7µg/L
CuCl2 H2O,1.1µg/L BaCl2 2H2O,1.25µg/L NiSo4 6H2O,0.75µg/L Na2B4O7
10H2O,0.65µg/L Kl, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina y Fosfatos 2 mMoles.
Extracción enzimática
Después de 21 h la biomasa fue separada por centrifugación a 10 000 rpm por 40 min
(datos de la centrifuga) y lavadas con Buffer de Acetatos 0.1M pH 6.5 bajos las mismas
condiciones de centrifugación. Posteriormente y manteniendo a 4°C se adiciono inhibidor
de proteasas (cantidad de enzima, concentración) y fueron rotas las células en una prensa
francesa (características: a que presión trabajo).
Actividad Enzimática
A 1750µL de buffer de Tris HCl 0.1M pH 7 conteniendo Sacarosa (10% p/v) se le
adicionaron 250 µL del extracto enzimático. La actividad de la invertasa fue determinada
midiendo la cantidad de azucares reductores liberados incubando a 55ºC durante 5min.
Los azucares reductores fueron medidos con el método de DNS usando una mezcla
equimolar de glucosa y fructosa como estándar (Miller, 1959). Una unidad internacional
(UI) de actividad es definida como 1 µmol de azúcar reductor por minuto bajo las
condiciones del ensayo. Todos los ensayos fueron hechos por triplicado y el valor
promedio fue reportado.
Las muestras se leyeron un espectrofotómetro (características) a 550 nm.
Caracterización enzimática
pH y Temperatura Óptima
En la determinación del pH óptimo se trabajo en el rango de 5.5 a 8 en buffer de Tris - HCl
0.1M. Para la temperatura óptima se utilizo el buffer antes mencionado al pH que resulto
óptimo para la enzima. La determinación se realizo en el rango de 50-65 ºC.
Parámetros cinéticos (Km y Vmax)
Para la determinación del Km y Vmax, se trabajo a pH y temperatura óptimos para la
enzima. La concentración de sacarosa fue del 5% al 40%). Para el cálculo de km y Vmax se
empleo la representación de Lineaweaver- Burk.
Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre el intermediario.
A 1750 µL de buffer de Tris HCl 0.1M pH 7 conteniendo cada uno de los intermediarios
disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v) se le adicionaron 250 µL del
extracto enzimático de C.flavigena. La actividad de la invertasa fue determinada por la
liberación de azucares reductores que da como resultado el cambio de coloración al incubar
a 55 ºC durante 5min. Los azucares reductores fueron medidos con el método de DNS
usando una mezcla equimolar de glucosa y fructosa como estándar (Miller, 1959).
Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de Sacharomyces cerevisae
sobre los intermediarios obtenidos en la ruta sintética.
A 1750 µL de buffer de Acetatos 0.1M pH 5.5 conteniendo cada uno de los intermediarios
disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v) se le adicionaron 250 µL de una
solución enzimática de una invertasa comercial de Sacharomyces cerevisae. La actividad de
la invertasa fue determinada por la liberación de azucares reductores que da como
resultado el cambio de coloración al incubar a 55 ºC durante 5min. Los azucares reductores
fueron medidos con el método de DNS usando una mezcla equimolar de glucosa y fructosa
como estándar (Miller, 1959).
Obtención de los Amino azúcares
La metodología sintética para la obtención de los iminoazúcares objeto de nuestro estudio
se basa en los esquemas 1 y 2 que se describe a continuación.
El esquema 1 inicia con la protección selectiva de sacarosa 1 en las posiciones hidroxílcas 6
y 4 de glucosa para los cual se utiliza benzaldehído dimetilacetal en medio ácido (Garegg,
1995, Robyt, 1997), generando el intermediario protegido 2. El siguiente paso consiste en
la reacción de tosilación en piridina para incorporar el ester sulfónico en la posición 4’ de
fructosa conteniendo la posición hidroxílica primaria (Rai, 2005), para generar el
intermediario 3. Posterior peracetilación con anhídrido acético en piridina conduce a la
obtención del intermediario 4, este
último paso tiene la finalidad de permitir la separación de las señales de los hidrógenos del
disacárido en su espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) así
como favorecer la purificación del disacárido en sistemas no polares. El intermediario
resultante se hace reaccionar con azida de sodio en DMF para mediante una reacción de
sustitución nucleofílica reemplazar el grupo tosilo por el grupo azida y dar lugar a la
formación del intermediario 5. La reacción subsecuente de este intermediario bajo
condiciones de hidrogenación catalítica conduce a la formación intermediario 6 el cual
contiene una amina primaria en la posición 4’ de la fracción de fructosa del disacárido. La
remoción final de los grupos protectores bencilinen y acetato se llevara a cabo con Yodo en
metanol y solución de metóxido de sodio respectivamente para generar el intermediario de
sacarosa isostérico 7. El siguiente paso es crítico y consiste en someter el intermediario 7 a
la acción de la enzima hidrólitica invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el
sustrato modificado conteniendo el grupo amino en la posición 4’ de fructosa que es un
isóster clásico del alcohol primario del sustrato natural. Si el reconocimiento no es posible
se someterá el intermediario de sacarosa antes mencionado a condiciones de hidrólisis
ácida con la finalidad de separar los monómeros constitutivos, aunque como se ha
documentado existe el riesgo de modificación estructural de los carbohidratos cuando están
sujetos a condiciones ácidas (Brito-Arias, 2006). Para esta ruta sintética la hidrólisis del
disacárido modificado representa la liberación del intermediario de fructosa 9 conteniendo
el grupo amino el cual llevara a cabo una reacción de adición nucleofílica intramolecular
(Ichikawa, 1998) dando lugar a la formación de la imina cíclica la cual por reducción
catalítica conducirá a la formación del imino azúcar 10 que constituye uno de los productos
de interés como sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante.
Esquema 1
R1O
R1O
R2O
OR2
vii
OR3
OR3
O
O
iii
iv
v
vi
+
OR2
8
R3O
ii
O
R1O
R2O
OR4
i
OR3
R1O
O
HO
OR4
OH
R3O
1 R1, R2, R3, R4 = H
4 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = Ts
H
HO
N
HO
OH
5 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = N3
6 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
7 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
9
viii
2 R1 = CH(Ph), R2, R3, R4 = H
3 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = H, R4 = Ts
OR3
O
10
HO
O H2N
HO
OH
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.
vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
El esquema 2 propone la protección inicial de sacarosa 1 con benzaldehído dimetilacetal en
medio ácido generando el intermediario 11 el cual es sometido a condiciones de
peracetilación dando lugar al intermediario 12. El siguiente paso consiste en la remoción
del grupo benciliden de las posiciones 4 y 6 de glucosa para lo cual se emplea yodo en
metanol a reflujo (Robyt, 1996) generando el intermediario parcialmente protegido 13 el
cual se hace reaccionar con cloruro de tosilo en piridina con la finalidad de producir el
intermediario 14, el cual contiene el éster sulfónico en la posición 6 de glucosa.
Posteriormente se sigue una secuencia de pasos similares al esquema 1 consistentes en la
reacción con azida de sodio en DMF e hidrogenación catalítica para dar lugar a la
obtención de los intermediarios 6 y 7 respectivamente. La reacción de desacetilación para
generar el intermediario 15 será un paso previo para la reacción de hidrólisis enzimática del
disacárido modificado antes mencionado el cual contiene el grupo amino en la posición 6
de glucosa. La acción hidrólitica de invertasa liberará el intermediario aminado de glucosa
16 el cual llevara a cabo la ciclización intramolecular para conducir a la imina cíclica que
generara después de ser sometida a hidrogenación catalítica a la formación del iminoazúcar
17 siendo este el producto de interés en esta síntesis.
Esquema 2
R1O
R2O
R3O
OR3
OR4
R1O
O
viii
OR4
OR4
O
O
O
R2O
R3O
+
18
OR5
R4O
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
OR3
HO
OR4
O
OR5
OH
R4O
19
ix
1 R1, R2, R3, R4, R5 = H
11 R1, R2 = CH(Ph), R3, R4, R5 = H
NH2
12 R1, R2 = CH(Ph), R2 , R3, R4 = Ac
H
13 R1, R2 = OH, R2 , R3, R4, R5 = Ac
14 R1 = Ts, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
15 R1 = N3, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
N
OH
O
OH
HO
OH
H
OH
OH
20
16 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
17 R1 = NH2, R2, R3, R4, R5 = OH
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) Ac2O, Py, t.a. iii) I2, MeOH reflujo iv) TsCl, Py, t.a., 7 h. v) NaN3, DMF, reflujo
6 h. vi) H2, Pd-C, EtOH. vii) MeONa, MeOH. viii) Invertasa. o H3O+. ix) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la secuencia de
reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como grupo protector de las
posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden.
Esquema 3
R1O
R1O
R2O
O
OR2
OR3
OR3
O
O
OR4
R3O
i
ii
iii
iv
v
vi
1 R1, R2, R3, R4 = H
21 R1 = CMe2, R2, R3, R4 = H
22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = Ts
23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = Ts
24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3
25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
26 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.
vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
Resultados
Meta 1
Purificación de la Enzima Invertasa (Enero-Marzo 2006)
La cinética de crecimiento para la producción de invertasa de C.flavigena se llevo acabo en
una fermentación por lote (figura 4).
Figura 4. Cinética de crecimiento de Cellulomonas flavigena en sacarosa al 1%. Actividad
hidrólitica (
), crecimiento (
)
Como se observa en la figura 6, durante las primeras 14 h el crecimiento fue exponencial.
Posteriormente se presentó un crecimiento lineal de 15 a 35 h. A partir de las 35 h el
crecimiento se mantiene constante y aproximadamente a las 38 h empieza a decaer. El
máximo de actividad hidrólitica se obtuvo al inicio de la fase estacionaria de crecimiento e
inmediatamente empezó a decaer.
Una vez obtenido el caldo de cultivo se separo la biomasa determinando actividad
hidrólitica en el sobrenadante, al no detectarse actividad hidrólitica se procedió a romper las
células encontrando actividad; por lo que la invertasa que produce esta bacteria es
intracelular. En la literatura se encuentra reportado que tanto en hongos y bacterias la
invertasa puede ser extracelular e intracelular, esta última tiene un peso molecular menor
que la extracelular.
Caracterización bioquímica
pH y Temperatura óptima
Para la determinación de pH óptimo se hicieron ensayos con diferentes buffers: Acetatos
0.1 M, Fosfsatos0.1 M, Citratos fosfatos, Maleato 0.1 M y tris HCl 0.1 M.
Los datos de pH óptimo que se encuentran reportados para las invertasas en la literatura, la
mayoría son acidas. Las invertasas dependiendo de su pH se clasifican en: acidas, básicas y
neutras. El pH óptimo para esta enzima fue de 7 por lo que se clasifica como neutra. La
invertasa producida por Cellulomonas flavigena es una invertasa neutra, mostró actividad a
otros pH, alcanzando su máxima en un buffer de Tris HCl a pH =7. En la siguiente tabla
se muestran las máximas actividades en cada uno de los buffers probados:
Tabla 1. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena en
buffers diferentes
Buffer
Actividad UI/ml
Tris HCl
1.4
Tris Maleato
0.57
Fosfatos
no presento actividad
Acetatos
0.734
Citratos Fosfatos
no presento actividad
Meta 2 (Abril-Diciembre 2006)
Síntesis Quimioselectiva de aminoazucares
El desarrollo experimental para la obtención de los iminoazúcares inició con la ruta
propuesta en el esquema 1 y consistió en la reacción de protección selectiva de las
posiciones 4 y 6 de la glucosa con benzaldehído dimetilacetal para lo cual se llevaron a
cabo diferentes condiciones experimentales. Los resultados obtenidos mostraron similitud
en sus espectros de RMN de hidrógeno y en la cromatografía de capa fina. El espectro de
1
H RMN del intermediario 2 parcialmente purificado muestra señales en la región alifática,
vinílica y aromática. En la región entre 3.3 y 4.5 ppm se observa un patrón de señales
multiples sobrepuestas que corresponden a los hidrógenos de la sacarosa. En 5.4 ppm una
señal simple que corresponde al hidrógeno bencílico, y en la región entre 7.2 y 7.6 una
señal múltiple correspondiente a los hidrógenos aromáticos. El siguiente paso consistió en
la reacción de tosilación del intermediario 2 utilizando cloruro de tosilo y piridina a
temperatura ambiente durante 24 horas para generar el intermediario 3. El espectro de 1H
RMN del intermediario 3 presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. En
campo alto 2.42 ppm se observa una señal simple correspondiente al metilo del grupo
tosilo. Entre 4.0 y 4.7 ppm se observa un sistema complejo de señales correspondientes a
los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa, así como en 6.0 ppm una señal simple
para el hidrógeno bencílico, y en 6.06 ppm una señal doble (J= 8.4) correspondiente al
hidrógeno de la posición anomérica de glucosa. En 7.6 se observa un patrón de señales
doble y múltiple y en 7.82 ppm una señal doble que corresponde al sistema monosustituído
del grupo benciliden y a los hidrógenos del grupo tosilo característico de un sistema A2X2
para-sustituido. La reacción de peracetilación se llevó a cabo bajo condiciones de anhídrido
acético en piridina a temperatura ambiente obteniéndose el intermediario 4 aunque
parcialmente acetilado. El espectro de 1H RMN del intermediario 4 presenta señales en la
región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 ppm de observan 2 señales
simples que integran para 9 hidrógenos lo que supone que la protección se dio solo en
posiciones hidroxílicas. En 2.42 ppm se observa una señal simple correspondiente al metilo
del grupo tosilo. De 4.2 a 4.6 ppm se observa un sistema de señales múltiples
correspondientes a 7 hidrógenos no intercambiables de la sacarosa, en 5.1 ppm una señal
múltiple, en 5.5 una señal doble, en 6.0 una señal doble y en 6.1 ppm una señal simple para
el hidrógeno bencílico. En 7.2 se observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82
ppm una señal doble que corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y a
los hidrógenos del grupo tosilo característico de un sistema A2X2 para-sustituido. El
intermediario 4 se hace reaccionar con azida de sodio en dimetilformamida bajo
condiciones de reflujo generando el intermediario 5. El espectro de 1H RMN presenta
señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 ppm de observa 1
señal simple que integra para 9 hidrógenos lo que supone que la protección se dio solo en 3
posiciones hidroxílicas. Entre 3.4 y 3.8 ppm se observan 2 señales doble de doble
correspondiente a 2 hidrógenos. Entre 4.4 y 4.6 ppm una señal doble de doble y una señal
doble que integran para 2 hidrógenos. En 5.16 ppm se observa una señal múltiple que
integra para 1 hidrógeno. En 5.6 ppm, 6.1 ppm y 6.2 ppm se observan 2 señales dobles y 1
señal simple que integran para 3 hidrógenos. En campo bajo se observa en 7.4 ppm una
señal múltiple que corresponde al anillo aromático del grupo benciliden, no observandose
las señales correspondientes al grupo tosilo lo cual demuestra la sustitución por el grupo
azida (figura 5).
Figura 5.- Espectro de 1H RMN del intermediario 5 en CDCl3.
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la secuencia de
reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como grupo protector de las
posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden. La ruta sintética consistió en la
preparación inicial del intermediario 21 al hacer reaccionar sacarosa comercial con acetona
y 2,2- dimetoxipropano en medio ácido. En el espectro de 1H RMN se observan señales en
la región alifática y vinílica. A campo alto se observan 3 señales simples en 1.2 ppm y 2.7 y
2.8 ppm que corresponden a los metilos del grupo acetónido y dimetilformamida
respectivamente. En la región de 3.6-4.2 se observa un sistema sobrepuesto de señales
correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa. El siguiente paso
consistió en hacer reaccionar el intermediario 21 con cloruro de tosilo y piridina a
temperatura ambiente durante 24 horas para generar el intermediario 22. El espectro de 1H
RMN presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se
observan 3 señales simples que corresponden a los metilos del grupo acetónido y al grupo
metilo unido al benceno. Entre 3.4 y 4.2 ppm se observa el sistema complejo de señales
correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la región
aromática 7.2 y 8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a los hidrógenos
unidos al anillo aromático típicos de un sistema A2X2 para-sustituido. El intermediario 22
se sometió a condiciones de acetilación bajo condiciones de anhídrido acético y trietilamina
para generar el intermediario 23 a temperatura ambiente durante 24 horas. El espectro de
1
H RMN del intermediario 23 presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática.
A campo alto 1.2 ppm se observan 3 señales simples que corresponden a los metilos del
grupo acetónido y al grupo metilo unido al benceno. En 2.1 se observan señales asignables
a los grupos acetato. Entre 3.7 y 4.7 ppm se observa el sistema complejo de señales
correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la región
aromática 7.2 y 8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a los hidrógenos
unidos al anillo aromático típicos de un sistema A2X2 para-sustituido. El siguiente paso
consistió en la reacción de sustitución nucleofílica del grupo tosilo por el grupo azida
seguido por una hidrogenación catalítica para generar el intermediario reducido 25. El
espectro de 1H RMN muestra señales dobles que corresponden al acetónido, en 2.0 ppm se
observan 3 señales simples para los grupo acetato, y de 3.2 a 5.0 ppm se muestra un sistema
múltiple de señales para los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa (figura 6). Para
verificar la reducción del grupo azida al amino se obtuvo el espectro de infrarrojo
correspondiente, observándose la aparición de una banda ancha entre 3280 y 3460 cm-1, así
como la ausencia de la banda característica del grupo azida entre 2080 y 2160 cm-1.
Figura 6.- Espectro de 1H RMN del intermediario 25 en CDCl3.
Referencias
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Impacto
El desarrollo de este proyecto contribuye al desarrollo de estrategias experimentales que
permiten el aislamiento de una enzima de importancia comercial a partir de una cepa
distinta a las comúnmente empleadas y de procedimientos quimio-enzimáticos orientados a
la obtención de sustancias de potencial uso en el tratamiento de diabetes mellitas tipo II.
Contribuye además al desarrollo de metodologías relacionadas a la química de
carbohidratos que tiene la finalidad de modificar de manera selectiva materias primas como
la sacarosa para la obtención de productos con un mayor valor agregado. El desarrollo del
proyecto permiten la formación de recursos humanos a nivel posgrado relacionados al área
de bioprocesos y los resultados tienen la finalidad de ser publicados en revistas
especializadas.