Download RetroTools Two Step with buffer MgCl2 FREE esp
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C/ Valle de Tobalina, 52 - Nave 39 E-28021 Madrid (Spain) Tel: (34) 91 710 00 74 Fax: (34) 93 843 78 84 e-mail: [email protected] www.biotools.eu RetroTools® Two Step KIT con DNA-Amplification Buffer MgCl FREE 2 incluye Tth ADN Polimerasa recombinante termoestable CONSERVAR A - 20ºC El Kit RetroTools® Two Step Kit permite la amplificación de una secuencia específica de ARN a partir de ARN molde. La tecnología desarrollada por el kit combina de forma secuencial en dos pasos realizados en un solo tubo, la reacción de 2+ transcripción reversa (RT) y PCR utilizando una única enzima. La Tth ADN Polimerasa en presencia de Mg cataliza la 2+ polimerización de dNTPs usando como molde ADN, mientras que en presencia de Mn exhibe preferencia por utilizar ARN como molde. Como ventaja la Tth ADN polymerase permite realizar la RT a elevadas temperaturas aumentando así la especificidad de la reacción y permitiendo resolver estructuras secundarias del ARN. PROTOCOLO PARA LA REACCIÓN DE RT-PCR CON PRIMERS ESPECÍFICOS ER 1 -PASO: Reacción de Transcripción Reversa (RT). Añadir los siguientes reactivos en un tubo estéril: 2 µl 5X RT-Buffer 5 mM MnCl2 Solution 2 µl dNTP Mix, 10 mM each 0,25 µl ARN Molde de 10 pg a 1 µg Primer downstream 20 pmoles RetroTools® Polymerase 1.25 µl Agua bidestilada estéril Hasta 10 µl Incubar la mezcla de reacción a 60-70ºC durante 15 a 60 min. El tiempo de incubación dependerá de la longitud del fragmento buscado y se ha de optimizar en cada caso. La temperatura de preannealing (ver Nota 1) así como la utilizada para la reacción de transcripción reversa deben también ser optimizadas para cada primer downstream. NOTA 1: En el caso de que el primer downstream tenga una Tm inferior a 50ºC, se recomienda incluir un paso de preannealing de 3 min a 45-50ºC con el fin de incrementar la eficiencia de la transcripción y, por consiguiente, de la amplificación. NOTA 2: una vez finalizado el paso de RT, mantener el producto de la reacción en hielo e inmediatamente proceder al siguiente paso, también se puede congelar el producto de la RT. Si se ha congelado no olvidar añadir 0.3 µl de RetroTools® Polymerase fresca en la reacción de amplificación, ya que la enzima en la mezcla se inactiva tras la congelación. NOTA 3: para la detección de mensajeros poco abundantes, se recomienda aplicar un protocolo de transcripción reversa cíclica: 94ºC 1 min (desnaturalización inicial) + 4 ciclos (48ºC 5 min, 60ºC 15 min). 2DO-PASO: Reacción de Amplificación. Una vez llevada a cabo la reacción de transcripción reversa, el volumen de reacción por vial debe ser suplementado hasta 50 µl añadiendo los siguientes reactivos: 5X DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE 8 µl Primer upstream 20 pmoles 50 mM MgCl2 Solution Mínimo 2 µl (2 mM de concentración final) Agua bidestilada estéril Hasta 40 µl Condiciones recomendadas de la reacción de amplificación: 94ºC 94ºC 55-65ºC 72ºC 72ºC 2 minutos 15 segundos 30 segundos x 30-45 ciclos 1 minuto por Kb 3 minutos 4ºC La temperatura de annealing depende de la Tm de la pareja de primers a utilizar. Analizar el producto obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. PROTOCOLO PARA LA REACCIÓN DE RT-PCR CON PRIMERS INESPECÍFICOS PARA LA RT 1ER-PASO: Reacción de Transcripción Reversa (RT). Añadir los siguientes reactivos en un tubo estéril: 6 µl 5X RT-Buffer 5 mM MnCl2 Solution 6 µl dNTPs Mix, 10 mM each 0,25-0,5 µl Primer-s no específico-s 5-10 pmoles ARN Molde de 10 pg a 1 µg RetroTools® Polymerase 1.5 µl Agua bidestilada estéril Hasta 30 µl Incubar la mezcla de reacción a 42ºC durante 5 minutos. Incrementar lentamente (se recomienda utilizar la opción Ramp del termociclador) la temperatura hasta 60ºC-65ºC e incubar durante 30-60 minutos. El tiempo de incubación dependerá de la longitud del fragmento a transcribir, debiendo ser optimizado en cada caso. Tras la transcripción reversa, proceder inmediatamente al paso de amplificación. Como regla general, utilizar como molde 10 µl de producto de RT y guardar el resto de la reacción a –20ºC. Cuando se trabaje con mensajeros poco abundantes, el volumen de producto de RT a utilizar para la reacción de amplificación se puede aumentar hasta los 30 µl. NOTA: al usar la reacción RT almacenada, añadir previamente 0,3 µl de RetroTools® Polymerase fresca, ya que la congelación inactiva la enzima. 2DO-PASO: Reacción de Amplificación. Una vez realizada la transcripción reversa, añadir los reactivos siguientes al vial con 10 µl de producto de RT (ver los comentarios anteriores) hasta alcanzar un volumen final de 50 µl: 5X DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE 8 µl 50 mM MgCl2 Solution Mínimo 2 µl (2 mM concentración final) Primer “downstream” 5-10 pmoles Primer “upstream” 5-10 pmoles Agua bidestilada estéril Hasta 40 µl Condiciones recomendadas de la reacción de amplificación: 94ºC 2 minutos 94ºC 15 segundos 55-65ºC 30 segundos 72ºC x 35 ciclos 1 minuto por Kb 72ºC 3 minutos 4ºC La temperatura de annealing depende de la Tm de la pareja de primers específicos a utilizar. Analizar el producto obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. Ref. Producto 10.059 RetroTools® Two Step KIT with DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE (100 rxns) RetroTools® es marca registrada de Biotools, Biotechnological & Medical Laboratories, S. A. Ed. 09 – Marzo 14