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RetroTools® Two Step KIT con DNA-Amplification Buffer MgCl FREE
2
incluye Tth ADN Polimerasa recombinante termoestable
CONSERVAR A - 20ºC
El Kit RetroTools® Two Step Kit permite la amplificación de una secuencia específica de ARN a partir de ARN molde. La
tecnología desarrollada por el kit combina de forma secuencial en dos pasos realizados en un solo tubo, la reacción de
2+
transcripción reversa (RT) y PCR utilizando una única enzima. La Tth ADN Polimerasa en presencia de Mg cataliza la
2+
polimerización de dNTPs usando como molde ADN, mientras que en presencia de Mn exhibe preferencia por utilizar ARN
como molde. Como ventaja la Tth ADN polymerase permite realizar la RT a elevadas temperaturas aumentando así la
especificidad de la reacción y permitiendo resolver estructuras secundarias del ARN.
PROTOCOLO PARA LA REACCIÓN DE RT-PCR CON PRIMERS ESPECÍFICOS
ER
1 -PASO: Reacción de Transcripción Reversa (RT).
Añadir los siguientes reactivos en un tubo estéril:
2 µl
5X RT-Buffer
5 mM MnCl2 Solution
2 µl
dNTP Mix, 10 mM each
0,25 µl
ARN Molde
de 10 pg a 1 µg
Primer downstream
20 pmoles
RetroTools® Polymerase
1.25 µl
Agua bidestilada estéril
Hasta 10 µl
Incubar la mezcla de reacción a 60-70ºC durante 15 a 60 min. El tiempo de incubación dependerá de la longitud del
fragmento buscado y se ha de optimizar en cada caso. La temperatura de preannealing (ver Nota 1) así como la
utilizada para la reacción de transcripción reversa deben también ser optimizadas para cada primer downstream.
NOTA 1: En el caso de que el primer downstream tenga una Tm inferior a 50ºC, se recomienda incluir un paso de preannealing
de 3 min a 45-50ºC con el fin de incrementar la eficiencia de la transcripción y, por consiguiente, de la amplificación.
NOTA 2: una vez finalizado el paso de RT, mantener el producto de la reacción en hielo e inmediatamente proceder al siguiente
paso, también se puede congelar el producto de la RT. Si se ha congelado no olvidar añadir 0.3 µl de RetroTools® Polymerase
fresca en la reacción de amplificación, ya que la enzima en la mezcla se inactiva tras la congelación.
NOTA 3: para la detección de mensajeros poco abundantes, se recomienda aplicar un protocolo de transcripción reversa cíclica:
94ºC 1 min (desnaturalización inicial) + 4 ciclos (48ºC 5 min, 60ºC 15 min).
2DO-PASO: Reacción de Amplificación.
Una vez llevada a cabo la reacción de transcripción reversa, el volumen de reacción por vial debe ser suplementado
hasta 50 µl añadiendo los siguientes reactivos:
5X DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE
8 µl
Primer upstream
20 pmoles
50 mM MgCl2 Solution
Mínimo 2 µl (2 mM de concentración final)
Agua bidestilada estéril
Hasta 40 µl
Condiciones recomendadas de la reacción de amplificación:
94ºC
94ºC
55-65ºC
72ºC
72ºC
2 minutos
15 segundos
30 segundos
x 30-45 ciclos
1 minuto por Kb
3 minutos
4ºC
La temperatura de annealing depende de la Tm de la pareja de primers a utilizar. Analizar el producto obtenido
mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida.
PROTOCOLO PARA LA REACCIÓN DE RT-PCR CON PRIMERS INESPECÍFICOS PARA LA RT
1ER-PASO: Reacción de Transcripción Reversa (RT).
Añadir los siguientes reactivos en un tubo estéril:
6 µl
5X RT-Buffer
5 mM MnCl2 Solution
6 µl
dNTPs Mix, 10 mM each
0,25-0,5 µl
Primer-s no específico-s
5-10 pmoles
ARN Molde
de 10 pg a 1 µg
RetroTools® Polymerase
1.5 µl
Agua bidestilada estéril
Hasta 30 µl
Incubar la mezcla de reacción a 42ºC durante 5 minutos. Incrementar lentamente (se recomienda utilizar la opción
Ramp del termociclador) la temperatura hasta 60ºC-65ºC e incubar durante 30-60 minutos. El tiempo de incubación
dependerá de la longitud del fragmento a transcribir, debiendo ser optimizado en cada caso.
Tras la transcripción reversa, proceder inmediatamente al paso de amplificación. Como regla general, utilizar
como molde 10 µl de producto de RT y guardar el resto de la reacción a –20ºC. Cuando se trabaje con
mensajeros poco abundantes, el volumen de producto de RT a utilizar para la reacción de amplificación se
puede aumentar hasta los 30 µl.
NOTA: al usar la reacción RT almacenada, añadir previamente 0,3 µl de RetroTools® Polymerase fresca, ya que la
congelación inactiva la enzima.
2DO-PASO: Reacción de Amplificación.
Una vez realizada la transcripción reversa, añadir los reactivos siguientes al vial con 10 µl de producto de RT (ver los
comentarios anteriores) hasta alcanzar un volumen final de 50 µl:
5X DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE
8 µl
50 mM MgCl2 Solution
Mínimo 2 µl (2 mM concentración final)
Primer “downstream”
5-10 pmoles
Primer “upstream”
5-10 pmoles
Agua bidestilada estéril
Hasta 40 µl
Condiciones recomendadas de la reacción de amplificación:
94ºC
2 minutos
94ºC
15 segundos
55-65ºC
30 segundos
72ºC
x 35 ciclos
1 minuto por Kb
72ºC
3 minutos
4ºC
La temperatura de annealing depende de la Tm de la pareja de primers específicos a utilizar. Analizar el producto
obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida.
Ref.
Producto
10.059
RetroTools® Two Step KIT with DNA-Amplification Buffer MgCl2 FREE (100 rxns)
RetroTools® es marca registrada de Biotools, Biotechnological & Medical Laboratories, S. A.
Ed. 09 – Marzo 14