Download celulas dendríticas

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
SUBDIRECCIÓN DE INVESTIGACION Y POSTGRADO
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
´´Análisis fenotípico de una población de DCs intestinales murinas in vivo
ante la administración de Brucella abortus ´´
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QUE PARA OBTENER EL GRADO D E :
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Q. F. B. MANUEL JAIME SUÁREZ MÉNDEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. RUBÉN LÓPEZ SANTIAGO
DR. LEOPOLDO FLORES ROMO
MÉXICO, D. F.2009
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de Inmunología Celular del
CINVESTAV y el laboratorio de Inmunología Celular I de la ENCB-IPN.
Este trabajo fue apoyado por el proyecto del factor de transferencia.
2
INDICE
ÍNDICE de FIGURAS................................................................................................................... 4
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................................... 5
RESUMEN ..................................................................................................................................... 6
ABSTRACT ................................................................................................................................... 7
CELULAS DENDRÍTICAS.......................................................................................................... 8
Células dendríticas intestinales. .............................................................................. 10
ANATOMÍA INTESTINAL......................................................................................................... 13
Mucosa......................................................................................................................... 13
Epitelio ......................................................................................................................... 13
Lámina propia ............................................................................................................. 14
Muscular de la mucosa ............................................................................................. 14
Submucosa ................................................................................................................. 15
Muscular Externa ....................................................................................................... 15
Serosa.......................................................................................................................... 15
Duodeno ...................................................................................................................... 15
Yeyuno ......................................................................................................................... 15
Ileon.............................................................................................................................. 16
Intestino Grueso ......................................................................................................... 16
INMUNOLOGÍA INTESTINAL.................................................................................................. 17
TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A INTESTINO .................................................................... 17
INMUNOLOGÍA INTESTINAL ANTE BACTERIAS COMENSALES ................................ 19
INMUNOLOGÍA INTESTINAL ANTE BACTERIAS PATÓGENAS ................................... 20
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 21
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 22
Objetivo General ........................................................................................................ 22
Objetivos particulares ................................................................................................ 22
MATERIAL Y METODOS ......................................................................................................... 23
RESULTADOS ........................................................................................................................... 26
DISCUSION................................................................................................................................. 36
CONCLUSIONES....................................................................................................................... 41
PERSPECTIVAS ........................................................................................................................ 42
REFERENCIAS .......................................................................................................................... 43
3
ÍNDICE de FIGURAS
Figura1. Expresión de CD45 en lámina muscular de la porción duodenal 20X.
Figura 2. Frecuencia de células CD45+ en lámina muscular de la porción duodenal 20X
Figura 3. Expresión de CD45 en lámina muscular de la porción Yeyuno-íleon 20X.
Figura 4. Frecuencia de células CD45+ en lámina muscular de la porción Yeyuno-íleon
20X.
Figura 5. Expresión de CD45 en lámina muscular de la porción del intestino grueso
20X.
Figura 6. Frecuencia de células CD45+ en lámina muscular de la porción Intestino
grueso 20X.
Figura 7. Expresión de MHC-II en lámina muscular de la porción duodenal 20X.
Figura 8. Frecuencia de células MHC-II+ en lámina muscular de diferentes porciones
Intestinales (Duodeno, Yeyuno-íleon, Intestino Grueso) 20X.
Figura 9. Expresión de MHC-II+ en lámina muscular de Yeyuno-íleon 20X.
Figura 10. Expresión de MHC-II+ en lámina muscular de Intestino grueso 20X.
Figura 11. Expresión de DEC205 en lámina muscular de la porción duodeno 20X.
Figura 12. Frecuencia de células DEC205+ en lámina muscular de diferentes porciones
Intestinales (Duodeno, Yeyuno-íleon, Intestino Grueso) 20X.
Figura 13. Expresión de DEC205 en lámina muscular de la porción yeyuno-íleon 20X.
Figura 14. Expresión de DEC205+ en lámina muscular de la porción Intestino grueso
20X.
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LISTA DE ABREVIATURAS
APC
del inglés Antigen prescenting cells
DC
Célula dendrítica, del inglés dendritic cell
MHC
Complejo principal de histocompatibilidad
Lin
Linfocito
CLA
Antígeno cutáneo asociado a linfocitos, del inglés cutaneous linfocite antigen
LPS
Lipopolisacarido
Fc
Fracción cristalizable
PP
Placa de Peyer
LP
Lámina Propia
MLN
Ganglios linfaticos mesentericos, del inglés mesenteric lymph nodes
IFR
Región interfolicular, del inglés interfolicular region
SED
Domo subepitelial, del inglés subepitelial dome
IFN
Interferon
TCR
Receptor de células T, del inglés T cell receptor
OVA
Ovoalbúmina
FAE
Epitelio asociado a foliculo del ingles Folicule asociated a epitelial
TNF-
Factor de necrosis tumoral alfa, del inglés tumoral necrosis factor alfa
MET
Microscopia electrónica de transmisión
GALT
Tejido linfoide asociado a intestino, del ingles Gut associated a lymphoid tissue
FDC
Células dendríticas folicularesdel ingles folicular dendritic cells
IEL
Linfocitos intraepiteliales, del ingles intraepithelial lymphocytes
ETEC
Escherichia coli enterotoxigénica
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RESUMEN
La inmunidad a mucosas es crucial para mantener el balance entre
microorganismos comensales así como nutrientes y microorganismos patógenos,
Brucella abortus es un patógeno intracelular facultativo, responsable de la fiebre de
Malta, una enfermedad que afecta a un amplio número de mamíferos. La Brucellosis se
caracteriza por un cuadro de fiebre aguda y subaguda de donde el acceso de este
patógeno a el humano es a través del tracto gastrointestinal.
El objetivo de este trabajo fue evaluar in situ las células dendríticas localizadas
en la lámina muscular intestinal tras la administración de Brucella abortus 2308. La
infección se realizo en ratones BALB/c a una dosis infectiva de (1x 106), mientras que
los ratones controles recibieron solamente SSF, después de 24 horas post-inoculación
los animales fueron sacrificados obteniéndose el intestino y separado este en diferentes
porciones de estudio (Duodeno,Yeyuno-ileón e intestino grueso) de donde se obtuvo la
lámina muscular e in situ se observo la expresión de CD45, MHC II y DEC205 en
células dendríticas.
In situ el análisis de la lámina muscular de los ratones infectados con Brucella
abortus presento una disminución en la distribución de células MHC-II+ en la porción del
yeyuno-íleon e intestino grueso, se encontró también, una disminución drástica en la
distribución del número de células DEC205+ en la porción del intestino grueso así como
la disminución en la frecuencia de las células CD45+ en la porción del duodeno.
Con estos resultados podemos concluir que la inoculación oral de Brucella
abortus 2308 induce cambios diferenciales en la frecuencia y expresión de MHC II+,
DEC205+ y CD45+ en diferentes regiones anatómicas de la lámina muscular del
intestino.
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ABSTRACT
Mucosal immunity is crucial to maintain the balance under exposure to nutrients as well
as comensal and pathogens microorganisms. Brucella abortus is a facultative
intracellular pathogen responsible of brucellosis or Malta fever, a disease affecting a
wide range of mammals. Brucellosis is characterized by an acute and subacute febrile
illness, the natural access to humans is through the gastrointestinal tract.
The objective of this work was to evaluate in situ the dendritic cells (DCs) within the
muscular layer of the mouse intestine after oral administration of Brucella abortus 2308.
BALB/c mice were inoculated with Brucella abortus (1 x 106), while controls received
saline solution (SS). After 24h we obtained the intestine and dissected it according to
anatomical regions (duodenum, jejunum, ileum and large intestine). Then, the muscular
layer was obtained to determine in situ the expression of CD45, MHC II, DEC205 on
DCs. In situ analysis of intestinal muscular layer of Brucella-inoculated mice showed
lower quantities of MHC II+ cells in the jejunum-ileum and large intestine, compared with
control mice. It was found lower quantities of DEC205
+
cells in the large intestine
compared to the controls. With these results it is concluded that oral inoculation of B.
abortus 2308 induced differential changes in the frequency and morphology of MHC II+,
DEC205+ and CD45+ DC in the different anatomical regions of the intestine.
7
CELULAS DENDRÍTICAS
Las células dendríticas (DC) son células de forma irregular que recibieron este
nombre por su morfología distintiva, ya que tienen prolongaciones membranales a las
cuales se les llamó dendritas, y fueron identificadas en 1973 por Steinman y Conh,
como una población no adherente en cultivos celulares de bazo de ratón (1). Las DCs
son células derivadas de médula ósea que tienen una importante función como células
APCs (del inglés “antigen presenting cells)(1,2). ya que capturan y transfieren
información antigénica a las células del sistema inmune adaptativo (3).
Se han descrito cuatro estadios de desarrollo, a) progenitores en médula ósea, b)
precursores de DCs que circulan a través de la sangre y linfa, así como en los tejidos
linfoides, que ante la exposición antigénica liberan citocinas, c) DCs inmaduras que
residen en tejidos periféricos y en mucosas, las cuales poseen alta capacidad
endocítica y fagocítica permitiendo la captura de Ag, y d) DCs maduras localizadas en
los órganos linfoides secundarios y que expresan altos niveles de moléculas de
coestimulación y moléculas del MHC permitiendo así la presentación efeciente de
antígeno (3).
Las propiedades de las DCs incluyen:
1.
Alta capacidad de capturar, procesar y presentar antígenos
2.
Alta capacidad de migrar selectivamente a través de tejidos.
3.
La capacidad de interactuar, estímular y dirigir respuestas de
linfocitos T
Las DCs son consideradas APCs por excelencia pues son las únicas células
capaces de inducir respuestas inmunes primarias, y como consecuencia, permitir el
establecimiento de la memoria inmunológica(3). estas células cuentan con diversos
nombres según su localización anatómica. En la piel y mucosas son llamadas células de
Langerhans; en la linfa se llaman células veladas; en órganos como corazón, riñón e
intestino, son conocidas como células intersticiales; y las que se encuentran entre los
Lin T de los órganos linfoides son llamadas células interdigitantes. Se considera que las
DCs representan del 0.5 al 1% de los leucocitos en sangre circulante (4,5).
La migración selectiva de las DCs y su permanencia en un tejido dado, son
eventos estrechamente controlados, pero no bien conocidos aún. Los factores
quimiotácticos liberados por el tejido blanco parecen jugar un importante papel en el
8
tráfico de las DCs. Las DCs inmaduras y maduras difieren en el patrón de expresión de
receptores de quimiocinas, y por consiguiente en su sensibilidad a distintas quimiocinas.
Otras moléculas de superficie están involucradas en la migración de DCs. La expresión
del antígeno cutáneo asociado a linfocitos (CLA) puede permitir a las DCs colonizar la
piel tras su interacción con células endoteliales activadas mediante E-selectinas. La Ecadherina es una molécula implicada en la adhesión de las LCs con los queratinocitos; y
las isoformas de la molécula CD44 son importantes en la adherencia de las DCs a las
zonas paracorticales de los ganglios linfáticos.
Los estímulos activadores de DCs alteran la expresión de algunas moléculas entre
las que se incluyen la E-cadherina, CD44, integrinas 1 y receptores de quimiocinas, e
inducen rearreglos del citoesqueleto. Por lo tanto, los factores que promueven la
maduración de DCs como APCs son los mismos que llevan a la acumulación de DCs en
sitios de inflamación o que inducen migración de las DCs desde tejidos periféricos hacia
los ganglios linfáticos.
La maduración de las DCs inicia con señales del microambiente y frecuentemente
ocurre en el contexto de una respuesta inflamatoria. Estas señales incluyen productos
bacterianos como componentes de la pared celular (LPS o ácido lipoteicoico) y
fragmentos de DNA bacteriano, además de citocinas inflamatorias como la IL-1 y el
TNF-. Las DCs son capaces de responder a la presencia de patógenos e inducir
respuestas inmunes primarias, por lo que representan un importante eslabón entre la
inmunidad innata y la inmunidad adquirida.
Una vez que las DCs están en contacto con los Lin T, se inician una serie de
interacciones que llevan a la maduración terminal de las DCs. Particularmente, los LinT
liberan citocinas y expresan moléculas de superficie que refuerzan las funciones como
APCs de las DCs y prolongan la supervivencia de las mismas. Aunque no se ha
demostrado formalmente, es muy probable que una vez que las DCs han estimulado a
los LcT sufran muerte celular apoptótica. De hecho, las DCs no han sido identificadas
en las vías linfáticas eferentes. La repoblación de DCs en los tejidos es debido a un flujo
continúo de DCs o precursores de DCs desde la sangre, que tampoco se conoce bien.
Las DCs inmaduras son fagocíticas, muestran alta actividad endocitica y expresan
altos niveles de receptores de superficie involucrados en la captura de antígenos,
incluyendo el receptor de manosa, y receptores Fc de inmunoglobulinas, FcRII, FcRI y
FcRII. En contraste, el número de moléculas de MHC-II es bajo, y está localizado
principalmente intracelularmente; además, las moléculas de coestimulación y adhesión
se expresan muy débilmente.
9
Por el contrario las DCs maduras reducen su capacidad de captura y aumentan
considerablemente su capacidad de presentar antígenos. Las DCs maduras
incrementan la expresión de moléculas MHC-II considerablemente con un amplio
número de moléculas que llevan péptidos de larga vida hacia la superficie.
Células dendríticas intestinales.
Las DC en intestino han sido caracterizadas en PP, LP y ganglios linfáticos
mesentéricos (MLN, del inglés mesenteric lymph nodes), usando métodos que permiten
su estudio in situ (inmunohistoquímica) y además se ha logrado su purificación por
medio de digestiones enzimáticas y algunos métodos de enriquecimiento(6).
Las PP son el sitio donde las DC han sido más ampliamente estudiadas, se han
descrito claramente en las diferentes secciones de las PP en la porción subepitelial
(SED, del inglés subepithelial dome) y en la zona interfolicular (IFR, del inglés
interfollicular region). En el SED de ratón se han descrito células MHC-II+. Usando otros
marcadores de superficie, claramente se pueden identificar dos subpoblaciones en la
SED: una CD11b+ y la otra doble negativa (CD11b-/CD8-), dichas poblaciones no solo
pueden distinguirse por sus marcadores de superficie, sino también funcionalmente ya
que la población CD11b+ secreta citocinas como IL-4 e IL-10, mientras que las doble
negativas (CD11b-/CD8-), secretan interferón  (IFN)(7). En los humanos, se han
estudiado las DCs en el SED con el marcador S100(8). En la IFR se han descrito DC
que pueden clasificarse en dos subpoblaciones; CD8+ y dobles negativas (CD11b/CD8-). Dichas subpoblaciones secretan principalmente IFN(9). Además las DC en IFR
pueden ser claramente identificadas con marcadores como CD11c y DEC-205(10).
Se ha demostrado in vitro que las DC purificadas de PP son muy eficientes
(superiores a macrófagos y linfocitos B) estimulando linfocitos T virgenes. Usando
modelos transgénicos (por ejemplo ratones cuyo TCR reconoce solo OVA) en los que
se administra OVA oral, se demostró que desde las 12 hrs, las DC de las PP presentan
el Ag y estimulan linfocitos, sin embargo aún no está claro qué subpoblación celular
específica es la participante. La(11). migración de estos tipos celulares parece estar
controlada al menos por ciertas quimiocinas; para las poblaciones descritas se observó
que las DC en el SED expresan el receptor CCR6, mientras que las células de FAE
expresan el receptor CCR7.(12).
A pesar de la extensa caracterización fenotípica, el papel de las DC en las PP
sobre la estimulación de los linfocitos T no es claro y se han propuesto diversas
hipótesis. La más aceptada postula que las DC del SED captan el Ag transportado por
las células M y migran a las regiones de T, convirtiéndose en DC de IFR. Durante la
10
migración, las células pueden seguir dos vías de desarrollo. Si el Ag es no infeccioso,
se genera una respuesta tipo Th2 ó por medio de la secreción de altos niveles de IL-10
y TGF-. Cuando el Ag es infeccioso (las señales son LPS o cadenas dobles de RNA),
se induce la secreción de niveles altos de IL-12, lo cual a su vez induce a los linfocitos T
a secretar IFN- obteniéndose así una respuesta tipo Th1(13).
Las bacterias comensales representan un elemento importante en la respuesta
inmune intestinal. A pesar de que durante años se pensó que no se montaba respuesta
ante ellas por fenómenos de tolerancia o debido a que eran eficientemente eliminadas
por macrófagos, recientemente se describio la captación de bacterias comensales por
DC en PP. El Ag no
solo es captado sino que induce una respuesta eficiente de
anticuerpos IgA , los cuáles protegen y evitan que estas bacterias invadan. Aunado a lo
anterior, y de manera importante, esta respuesta es completamente local.
En lámina propia (LP) se han descrito DC usando métodos enzimáticos e
inmunohistoquímicos en diversos organismos; rata, ratón, perro. cerdo(14). y
humano(15). La identificación de estás células se ha realizado empleando tanto
caracteres morfológicos como la expresión de diversos marcadores, siendo el MHC-II
el más usado. Sin embargo, estos dos elementos no son suficientes para su
identificación ya que en intestino existe(n) otra(s) poblacione(s), sobre todo en LP, que
expresan MHC-II (Soestayo, Biewenga et al 1990), y algunos autores sugieren que la
caracterización in situ no es factible, ya que la marca para MHC-II en muchos de los
casos aparece solo como ¨manchas¨, y no denota células bien definidas(6).
Aunado a las poblaciones descritas, es importante considerar la población de DC
migrante en los vasos linfáticos, el estudio de esta población en el caso de la rata fue
posible gracias a una técnica en la que se retiran quirurgicamente los MLN, después de
este procedimiento los vasos linfáticos se reanostomosan y en el conducto torácico
linfático es posible observar el contenido de los vasos eferentes(16). En la linfa
canulada es posible observar una poblacion de DC que consta a su vez de dos
subpoblaciones que no sólo se segregan por los marcadores que expresan (CD4,
OX41), sino por su morfología, contenido enzimático (esterasa inespecífica) y la
capacidad como APC,
lo que demuestra que las poblaciones son distintas incluso
funcionalmente(17). En estas células se intenta conocer cuáles son los elementos que
estimulan su migración, y se ha establecido que el TNF- y la IL-1 juegan un papel
fundamental. También se ha evaluado la posible participación del LPS en la migración ,
dado que 12 hrs después de la estimulación sistémica con LPS se observa un
incremento en las DC de la linfa colectada. Al evaluar funcionalmente estas células
después de la estimulación, sorprendentemente las DC estimuladas son tan eficientes
11
como las DC sin estimular respecto a su capacidad de inducir proliferación de linfocitos
T. Sin embargo, se sugiere que la inducción de migración de DC ante la administración
de LPS está relacionada al TNF-, pues con anticuerpos anti-TNF- se inhibe el efecto
del LPS(6,18). Se ha demostrado también que la población CD4-/OX41-, tiene una baja
capacidad de presentación antigénica y porta en su citoplasma cuerpos apoptóticos de
células epiteliales, por lo que se sugiere que esta población participe en fenómenos de
tolerancia periférica(19,20).
Aún con toda esa información, hay que considerar que todos los estudios se han
realizados in vitro, lo cual es una limitante importante. Los ensayos in vivo son menos
frecuentes por las limitaciones técnicas, pero sobre todo debido a su dificil desarrollo
para controlar el mayor número de variables. Aún así, algunos de estos estudios han
demostrado la capacidad de las DC intestinales para captar y llevar Ags del lúmen
intestinal a los MLN.. Sin embargo, inyectando intraintestinalmente albúmina canina
marcada con FITC, se demostró que el Ag no se encontraba en las DC de las PP, ni en
las células migrantes en los vasos linfáticos. La marca del Ag se presentaba en LP en
cierto tipo celular pero no pudo establecerse si se trataba de DC o de macrófagos. Por
esta razón, el proceso de cómo el Ag pasa la barrera epitelial del intestino y quién lo
capta es aún incierto, algunos estudios proponen que el Ag podría entrar vía las células
M en las PP o vía el epitelio mismo, llegando por sí mismo hasta la LP(6).
Finalmente, la población de DC descrita más recientemente en intestino
corresponde a una población en LP relacionada con la capacidad de captación
antigénica directamente del lúmen. Tanto en ensayos in vitro como in vivo, Rescigno et
al demostraron la capacidad de las DC para captar Ags luminales sin romper la
integridad epitelial, debido a que estas células expresan proteínas de uniones estrechas
como ocludina, claudina I y zonula ocludens I(21). Este fenómeno demostró una ruta de
entrada antigénica no descrita anteriormente. Este hallazgo aportó un nuevo
mecanismo para muestrear el lúmen intestinal, en ausencia de daño epitelial e
independientemente de las células M en PP.
Los reportes que describen DC asociadas al epitelio intestinal son muy escasos.
Maric et al, usando prefijación antes de la inclusión en medios de congelación,
describieron en rata células MHC-II+ asociadas al epitelio(22). que podrían corresponder
a las células capaces de muestrear Ags directamente del lúmen. Se describió que sólo
las células que expresan un receptor de quimiocina CX3CR1 (aunado a las moléculas
de uniones estrechas antes descritas) son capaces de muestrear Ags directamente del
lúmen. La expresión de este receptor también media la eliminación de bacterias
enteroinvasivas del intestino(23). Quizá por estos últimos hallazgos, el interés no solo
en las DC intestinales sino en su localización precisa in vivo ha tomado gran relevancia.
12
En el año de 2005, adaptando al intestino la técnica de extracción de láminas
epidérmicas nuestro laboratorio fue capaz de separar dos capas; una interna hacia la
serosa (capa muscular) y otra externa, hacia el lumen del intestino. Al realizar
inmunohistoquímica, se observó en la capa muscular, y no en la capa hacia el lumen,
una densa población de células MHC-II+ con morfología dendrítica prominente presentes
a largo de todo el intestino. Tras efectuar el análisis fenotípico de esta población, se
encontró que expresaban además marcadores característicos de DC como DEC205,
CDllc y Langerina. Sin embargo, es importante señalar que el nivel de expresión de
estas moléculas, (en ratones sin estimulación antigénica especial), fue siempre menor al
de la población MHC-II+.
Evaluando marcadores de activación (CD25, CD80, CD86 y CD95) y de
endotelio vascular (CD31) no está claro si esta población se encuentra asociada a
vasos linfáticos; además, tras la estimulación antigénica específica empleando un
conjugado DEC-OVA, se demostró in vitro que estas DC son capaces de estimular
eficientemente células T tanto CD8+ como CD4+ específicas para este antígeno. Este es
el primer reporte de la presencia de una nueva población de DC localizada in situ en la
capa muscular de intestino de ratón adulto(24).
ANATOMÍA INTESTINAL
En el humano el intestino delgado tiene una extensión aproximada de 4-5 m ,
mientras que en el ratón mide 35 cm. El intestino delgado se divide en tres porciones;
duodeno, yeyuno e íleon. Aunque la distinción entre las diferentes porciones es dificil
macroscópicamente, histológicamnete sí pueden definirse claramente., Sin embargo, a
pesar de las variaciones entre estas regiones, la estructura histológica general se
mantiene en ellas, la cuál se describe a continuación:
Mucosa
Es la sección expuesta hacia el lúmen del intestino y su principal función es la de
absorber los componentes degradados del alimento. Este proceso se optimiza por
diferentes estructuras que aumentan la superficie luminal. A su vez, la mucosa se divide
en: el epitelio, la LP y la lámina muscular de la mucosa.
Epitelio
El epitelio es cilíndrico simple y está conformado por diversos tipos celulares;
células de Paneth, células caliciformes y células enteroendócrínas.
Los enterocitos o células de absorción son cilíndricas (25  de alto) con un
núcleo oval orientado a la porción basal. La superficie apical presenta un borde en
13
cepillo, que observado por microscopía electrónica de transmisión (MET), está formado
por microvellosidades de aproximadamente 1  de largo y 0.1  de ancho, dispuestas
en paralelo. Cada vellosidad aumenta la superficie mucosa aproximadamente 20 veces;
en el centro de éstas se encuentran filamentos de actina y miosina, lo que les confiere
capacidad contráctil.
La superficie epitelial se encuentra protegida por secreciones como mucinas,
defensinas (péptidos antimicrobianos), inmunoglobulinas de secreción (principalmente
IgA), uniones estrechas entre las células epiteliales que impiden el paso de
microorganismos y Ags.. Los enterocitos producen varias enzimas como disacaridasas
y dipeptidasas; otras funciones son la absorción de agua y reesterificación de los ácidos
grasos en triglicéridos para la formación de quilomicrones.
Las células de Paneth se encuentran en la base de las criptas de Lieberkuhn,
tienen forma piramidal con base ancha y vértice estrecho. Su citoplasma tiene
abundantes gránulos de secreción. Estas células producen lisozima, enzima capaz de
digerir algunas paredes bacterianas., y también se ha demostrado su activa
participación en la secreción de defensinas
Las células caliciformes se encuentran abundantemente distribuidas en el íleon,
tienen una morfología redondeada, la porción basal es estrecha donde se alojan el
núcleo y una gran cantidad de gránulos de secreción.. Dentro de estas funciones está la
elaboración de mucinógeno, cuya forma hidratada, la mucina, forma parte del moco (1%
mucina, 1% proteína libre y 95% agua), que reviste la luz intestinal.
Todos los tipos celulares presentes en el epitelio intestinal tienen una vida media
relativamente corta (48-72 hr) y están en constante recambio. Las células se diferencián
y migran a lo largo de la vellosidad, y cuando alcanzan la cresta de ésta, mueren por
apoptosis y son descamadas.
Por debajo del epitelio se encuentran la lámina basal, que consta de una lámina
densa de 20-50 nm de grosor, cuya función es dar polaridad a las células de absorción
y guiar su migración desde las criptas hasta las crestas de las vellosidades.
Lámina propia
La LP es un tejido que sostiene estructural, metabólica y fisiológicamente al
epitelio(25). Se extiende entre los núcleos de las vellosidades, y consta de fibras
reticulares y linfocitos(26), células plasmáticas, macrofagos y DC. La LP se considera el
sitio de mayor producción de Abs en las mucosas.
Muscular de la mucosa
Está formada por una delgada lámina de músculo liso dispuesta en dos estratos,
uno circular y otro longitudinal. Esta lámina le permite el plegamiento a la mucosa para
14
promover la digestión y la absorción de nutrimentos. Las fibras musculares de la capa
circular entran en la vellosidad y se extienden a todo lo largo del centro hasta llegar a la
menbrana basal.
Submucosa
La submucosa se encuentra entre la lámina mucosa y la muscular externa y
consta de tejido conectivo areolar con fibras elásticas, permite la movilidad de la
mucosa y contiene plexos de vasos sanguíneos, linfáticos y terminaciones nerviosas.,
las terminaciones nerviosas forman un plexo denominado plexo de Meissner, que
controla la movilidad de la mucosa.. Cabe mencionar que en el ratón esta porción se
encuentra reducida a su mínima expresión.
Muscular Externa
Esta porción, también llamada túnica muscular, consta de dos capas de fribras
musculares lisas dispuestas una de forma circular (interna) y la otra longitudinal
(externa). Entre ambas existe un plexo vascular y un plexo nervioso denominado Plexo
Mesenterico de Auerbach.. Esta porción impulsa el material alimenticio por la luz
intestinal, fenómeno llamado peristaltismo.
Serosa
Es la túnica más extensa formada por tejido conectivo aerolar elástico. A veces
se mezcla con el tejido conectivo de las estructuras vecinas y recibe el nombre de
adventicia, pero hay otras regiones donde está cubierta por el peritoneo y entoces se
llama serosa..
Duodeno
El duodeno corresponde al primer segmento intestinal después del estómago y
es el más corto, ancho y fijo de éste. Su forma es la de una herradura pegada a la pared
abdominal posterior. Las vellosidades presentes en el duodeno son más anchas, altas y
numerosas por unidad de área, en relación a las otras porciones. En este segmento se
reciben enzimas pancreáticas y bilis hepática que ayudan a terminar el proceso de
digestión del alimento para que pueda ser absorbido.
Yeyuno
Se encuentra ocupando la porción superior izquierda de la cavidad abdominal.
La pared de esta porción intestinal es más gruesa y su luz aumenta, en relación al
15
duodeno. El patrón vascular mesentérico cuenta con arcos o asas únicas no intrincadas.
Es en esta porción donde se encuentra el mayor número de células caliciformes.
Ileon
Se encuentra ocupando la porción pélvica y la región inferior izquierda
abdominal. La luz intestinal es menor con relación al yeyuno y disminuye gradualmente
hacia el intestino grueso. El patrón vascular mesentérico cuenta con arcos o asas
intrincadas.
El yeyuno e íleon están suspendidos a la pared posterior del abdomen por un
mesenterio, con forma de abanico constituido por dos túnicas de peritoneo, entre las
cuáles se encuentran vasos sanguíneos, eferentes linfáticos y terminaciones nerviosas.
Además, en el mesenterio se encuentra los ganglios linfáticos mesentéricos dispuestos
a lo largo de una densa red de canales linfáticos. El sistema linfático del intestino consta
de capilares linfáticos de terminación ciega llamados vasos quilíferos, los cuales se en
cuentran en los centros de las vellosidades y descargan su contenido en el plexo
linfático submucoso.
Intestino Grueso
El intestino grueso (IG) está compuesto por ciego, colon, recto y ano. El IG se
extiende desde la válvula ileocecal, transición entre el ciego y el colon, hasta el ano.
Esta clasificación es fundamentalmente anatómica, macroscópica y condicionada
topográficamente. La función del IG es absorber la mayor parte del agua y los iones que
se encuentran en el quimo que recibe el intestino delgado, de este modo las heces
adquieren cierta consistencia. Es importante mencionar que la mucosa del intestino
grueso no presenta vellosidades, sin embargo, continúan las criptas de Lieberkuhn, y
éstas son más largas y rectas que en el intestino delgado.. En el ratón, el intestino
grueso tiene una extensión de 14 cm aproximadamente. El ciego es una estructura con
forma de evaginación alargada, cuya longitud es variable. Se caracteriza por presentar
un engrosamiento de la pared debido a cantidades importantes de tejido linfoide, que
forman una capa casi continúa de folículos.
La siguiente sección intestinal corresponde al colon, en la cual la lámina
muscular externa es notable debido a que su componente longitudinal no se continúa a
lo largo de toda la superficie, sino que remata en tres cintas estrechas de fascículos
musculares, conocidos como cintillas o tenias cólicas. Esta sección del intestino recibe
el quimo a nivel de la válvula ileocecal, además impide el flujo retrogrado del contenido
cecal hacia el íleon. Por último el recto, está cubierto parcialmente por peritoneo y
carece de mesenterio. Se localiza en la cavidad pélvica. la histología del recto es muy
16
similar a la descrita para el colon, salvo que sus criptas de Lieberkuhn son más
profundas, aunque en menor cantidad por área..
INMUNOLOGÍA INTESTINAL
La gran superficie del intestino delgado creada por las vellosidades intestinales y
las microvellosidades de las células epiteliales que lo cubren, es esencial para la
absorción de nutrientes. Sin embargo, esta gran superficie también aumenta el potencial
de absorción de moléculas antigénicas derivadas de la comida, bacterias residentes y
microorganismos invasores. Por este motivo, la mucosa intestinal necesita estar limitada
por una barrera que permita la absorción de nutrientes pero que también provea
protección contra antígenos dañinos. La mucosa intestinal representa la superficie de
contacto más amplia del organismo, y las respuestas que se montan en estas regiones
deben ser finamente reguladas, por un lado para eliminar agentes patógenos y por otro
lado para evitar la inflamación constante o reacciones ante Ags propios y alimentarios
que pueden conducir a patologías.
TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A INTESTINO
El tejido linfoide asociado a intestino (GALT, del inglés gut-associated lymphoid
tissue) es capaz de distinguir entre antígenos inocuos presentes en los alimentos y
bacterias comensales, y los de las bacterias patógenas. El GALT puede dividirse para
su estudio en: a) sitio efector y b) sitio inductor.
Los sitios inductores están constituidos por tejido linfoide organizado, como
PP, MLN, así como pequeños folículos linfoides aislados y las criptoplacas.
Las PP consisten de una colección de múltiples folículos linfoides encontrados
en el lado antimesentérico del intestino, principalmente en el íleon distal del intestino
delgado. Están constituidos por centros germinales y folículos de células B, rodeadas
por áreas que contienen predominantemente células T. Las áreas linfoides están
separadas del lumen intestinal por una capa simple de epitelio columnar conocido como
epitelio asociado a folículo (FAE, del inglés follicle-associated epitelium) y un área más
difusa colocada inmediatamente debajo del epitelio, denominado domo subepitelial
(SED, del inglés subepithelial dome). El FAE difiere del epitelio que cubre la
vellosidades de intestino en que presenta bajos niveles de enzimas digestivas y
microvellosidades menos pronunciadas, también se encuentra infiltrado con un mayor
numero de células T, B, macrófagos y DC. La característica más notable del FAE es la
presencia de células M, que se diferencian morfológicamente de los enterocitos en que
pierden el microvello de su superficie y la capa normal de moco. Estas características
17
permiten un fácil acceso del material de la luz intestinal al dominio apical de las células
M, donde dicho material es internalizado y transportado a la región del SED. El
mecanismo por el cual estas células pueden captar microorganismos o macromoléculas
varía de acuerdo con la naturaleza del material; partículas grandes y bacterias inducen
fagocitosis, virus y otras partículas adherentes son captadas por endocitosis vía
vesículas cubiertas de clatrina; mientras que material no adherente es internalizado por
endocitosis de fase fluída. Una característica de las células M es que, a diferencia de
otras células epiteliales intestinales, poseen una invaginación en la superficie
basolateral que facilita el contacto entre el antígeno entrante y el sistema inmune
especializado, en un ambiente separado de los elementos regulatorios del sistema
inmune mucosal
Por otra parte, los folículos linfoides aislados tienen la apariencia de PP
microscópicas, se encuentran distribuidos a lo largo de todo el intestino delgado y
grueso, y puesto que poseen analogía estructural con las PP, se asume que tienen
funciones similares a éstas
Las criptoplacas son agregados de tejido linfoide que funcionan como un
importante sitio de maduración extratímica de células T y son indispensables para el
desarrollo timo-independiente de los linfocitos intraepiteliales.
Desde el punto de vista histológico, el ganglio se encuentra subdividido en tres
regiones: a) la corteza, que alberga principalmente folículos en los que se encuentran
linfocitos B y células dendríticas foliculares (FDC, del inglés, follicular dendritic cells),
entre otras poblaciones (27). b) la paracorteza, en la que se encuentran principalmente
linfocitos T y APC, es en esta región donde probablemente ocurre la presentación
antigénica por parte de las APC a los linfocitos T; y, c) la médula, compuesta de
grandes senos linfáticos rodeados por cordones medulares, en los cuales encontramos
linfocitos, células plasmáticas y macrófagos (28).
El ganglio linfático mesentérico MLN es un órgano linfoide secundario típico,
encapsulado, con una parte cóncava denominada hilio en la cual se encuentran vasos
sanguíneos y linfáticos eferentes, los vasos linfaticos aferentes no se encuentran en el
hilio, estos últimos depositan la linfa en el seno subcapsular (28,29).
La lámina propia es el principal sitio efector del GALT. Es a este sitio donde
migran las células B y T maduras tras la inducción en las PP. La lámina propia contiene
un grupo grande y heterogéneo de células linfoides y mieloides. Los linfocitos
encontrados en ésta son en su mayoría células plasmáticas productoras de IgA, y
células T de memoria, además de macrófagos, DCs, neutrófilos y mastocitos.
Las células T de la lámina propia son principalmente células T CD4+ (60-70%),
la mayoría de las cuales expresan el TCR con cadenas  (TCR, del inglés T cell
18
receptor) Las células T  de la lámina propia se encuentran en un estado de mayor
activación que en la sangre periférica, al parecer como resultado de su continua
exposición a antígenos. Las células T de la lámina propia poseen un fenotipo maduro o
de memoria, indicado por los marcadores de superficie CD44high CD62low CD45RBlow
(ratón)/CD45RO+ (humano) y altos niveles de integrinas 47.(30).
Las células T CD8+ representan aproximadamente el 30 – 40 % de las células T
en la lámina propia. Esta población celular contiene células efectoras citolíticas que
parecen controlar los niveles de infección viral y otros microorganismos que en su ciclo
de vida presentan un estado intracelular en la lámina propia (31).
El GALT contiene además un grupo inusual de células T, los linfocitos
intraepiteliales (IEL, del inglés intraephitelial lymphocytes), que son predominantemente
CD8+ low, lo cual implica que reaccionan de manera restringida a MHC-I. Por otra parte, la
composición de esta clase de linfocitos es diferente de acuerdo al sitio anatómico.
Mientras que en yeyuno humano los IELs son CD8+, en el íleon e intestino grueso hay
una mayor cantidad de IELs CD4- CD8-. Es probable que esta variación se deba a las
diferencias en microflora y alimentos del contenido intraluminal. En el intestino delgado
humano 5-30% de IELs expresan TCR , CD4- y CD8- o CD8+.
INMUNOLOGÍA INTESTINAL ANTE BACTERIAS COMENSALES
El intestino contiene la mayor cantidad de antígeno que cualquier otra parte del
organismo, existe una flora extremadamente densa de diversas bacterias que
normalmente no son dañinas para el individuo inmunocompetente. Esta flora intestinal
comensal alcanza densidades de 1012 bacterias por gramo de contenido intestinal. Para
sobrevivir con tan alta carga de microorganismos en extrema cercanía, el tejido
intestinal y el sistema inmune del intestino deben estar altamente regulados y
adaptados.
La respuesta inmune mucosal es inducida por un pequeño número de
microorganismos comensales que penetran en las PP y que pueden ser capturados por
las DC (32). A la fecha se han descrito dos mecanismos principales mecanismo de
captura de antígeno en el intestino: el primero es a través de las células M, capaces de
transportar fluídos, nutrientes y bacterias; el segundo mecanismo es mediado por
células dendríticas.
Experimentos in vitro han demostrado que estas últimas pueden penetrar las
uniones estrechas (del inglés, tight junction) entre células epiteliales y conducir
prolongaciones citoplasmáticas hacia la luz intestinal donde son capaces de captar y
después interiorizar bacterias directamente desde el lumen (33,34). La integridad de la
19
barrera epitelial es preservada durante este proceso porque la DC es capaz de
establecer nuevas estructuras ¨tight junction-like¨ con las células epiteliales adyacentes
(35,36).
Una vez que la DC ha capturado el antígeno, éste es procesado y presentado a
células T CD4 específicas, ya sea en la propia PP o después de migrar al MLN. Una vez
que las células T han sido activadas, son inducidas a expresar las integrinas 47 y el
receptor de quimiocina CCR7, moléculas mediante las cuales logran retornar, a través
de circulación sanguínea y linfática, a la mucosa intestinal donde serán capaces de
poblar áreas alejadas del sitio inductivo original(37,39).
Aunque las DC cargadas con bacterias comensales pueden transitar al MLN,
parece que no pueden alcanzar tejidos linfoides sistémicos secundarios, dando como
resultado que la respuesta inmune sea confinada sólo a la mucosa.
INMUNOLOGÍA INTESTINAL ANTE BACTERIAS PATÓGENAS
La respuesta inmune intestinal dependerá de cómo es presentado el antígeno a
los linfocitos T por las células dendriticas ya que algunas bacterias alteran la
maduración y función de las DCs presentando una estrategia de evasión de la
respuesta inmune.
Es por eso que en el 2005 Langarica
y col.
administrando E. coli
enterotoxigénica (ETEC) por vía oral , demostraron un claro incremento en células DEC205 y CD11c+ en lámina muscuar de intestino delgado de ratón, el cual fue más
drástico con respecto a la estimulación sistémica con LPS.
Otra bacteria asociada frecuentemente con padecimientos gastrointestinales es
el genero Brucella, patógeno intracelular, Gram(- ) y agente etiologico de la brucelosis.
La brucelosis es una de las cinco zoonosis más comunes en el mundo y es la
más frecuente antropozoonosis con más de 500,000 nuevos casos anualmente,
caracterizandose por abortos en hembras así como orquitis crónica en machos(40-44).
Las infecciones en humanos ocurren por inhalaciones de aerosoles o por el
consumo de alimentos contaminados. La brucelosis consiste de una infección aguda
que cursa con fiebre ondulante y astenia, ya en su fase crónica la infección es causante
de endocarditis, encefalitis y espondilitis, una vez invadido el sistema linfatico la bacteria
se desarrolla al interior de fagocitos mononucleares pudiendo infectar células y
diseminar la bacteria en diferentes sitios anatómicos del organismo.
20
JUSTIFICACIÓN
El intestino representa la mayor superficie de contacto antigénico, sobrepasando
por mucho a la piel. Son pocos los estudios in vivo que demuestren cambios fenotipicos
en la red de DC tras el estimulo con una bacteria viva.
Langarica y col en el 2005 observaron cambios en la morfologia y la frecuencia de
DC de lámina muscular tras la estimulación sistémica con LPS y ETEC por via oral
donde la expresión de MHC-II+ se presenta en mayor cantidad , así como una
disminución en la frecuencia de esta población, al igual que para la población DEC205+
. Con la estimulación por vía oral, la expresión de MHC-II+ no mostró cambios en la
frecuencia celular, resultado que correlaciona con la expresión de CD45+ que no se ve
modificada, al analizar la frecuencia de las células DEC205+ se observó un claro
incremento, el cuál fue más significativo con respecto al observado con la estimulación
sistémica. Por lo anterior es de gran interes observar la distribución y frecuencia de
estas poblaciones celulares ante la administración de una bacteria viva por via
intragastrica.
21
OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar los cambios fenotípicos de las DCs de las láminas intestinales ante la
administración intragástrica de una bacteria viva invasiva (Brucella abortus)
Objetivos particulares
Evaluar los cambios morfológicos y de la frecuencia de células expresando las
moléculas CD45+, MHC-II+ y DEC205+ en respuesta a una estimulación local.
22
MATERIAL Y METODOS
Animales
Se emplearon ratones hembra BALB/c adultos
proporcionados por el bioterio del
CINVESTAV.
Bacteria
La cepa virulenta Brucella abortus 2308 se obtuvo del laboratorio de Inmunología
celular, del Departamento de Inmunología, de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas, I.P.N. Se creció en , tripticasa soya agar(TSA) durante 48h a 37°C en
atmosfera de 5% de CO2.
Inoculación y dosis de bacteria
Los ratones se inocularon por vía oral, utilizando una sonda esofágica, con 106 UFC de
Brucella abortus 2308 , preparada a partir de una suspensión bacteriana ajustada a 0.4
de absorbancia, a 540 nm, equivalente a 108 UFC de bacterias, . Se amortiguó el pH
estomacal de los animales con 50 l de solución de bicarbonato antes de la inoculación
de la bacteria, dejando pasar 15 min entre la administración del bicarbonato y la de la
bacteria; el grupo control sólo recibió la administración del bicarbonato y posteriormente
solución salina.
Obtención de láminas intestinales
Después de sacrificar los animales, se llevó a cabo la disección el intestino que
se colocó en solución salina al 0.9% para su manipulación; se extendió y se obtuvieron
las porciones de intestino delgado y grueso. El intestino delgado se dividió en dos
segmentos: duodeno y yeyuno-íleon., Ambos se abrieron “en canal” con la ayuda de
tijeras y pinzas dejando expuesto el contenido intestinal. Con el intestino grueso se
realizó la misma operación para los segmentos del colon y recto. Posteriormente a los
lavados, las capas intestinales se separaron por cuidadosa tracción mecánica con
ayuda de pinzas y un bisturí, obteniéndose dos capas, la “externa” ubicada hacia el
lumen intestinal y la “interna” (lámina muscular) hacia la serosa.
Las capas se fijaron con acetona fría por 20 min., se lavaron 2 veces en solución
salina y posteriormente se bloquearon las peroxidasas con H2O2 al 9% en PBS con 1%
de azida de sodio) durante 20 min. a temperatura ambiente. Posteriormente y a modo
de evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a utilizar, las capas se incubaron con
2% de suero de chivo y bloqueador universal Biogenex por 1 hora y 30 min
respectivamente, a temperatura ambiente.
23
Finalmente las capas fueron fraccionadas en segmentos de aproximadamente 2
ó 1 mm para los inmunomarcajes.
Inmunohistoquímica
Los cortes de intestino se incubaron durante 12 horas a 4°C con los anticuerpos
primarios anti-CD45+, MHC-II+ y DEC205+, posteriormente se realizaron tres lavados de
10 min cada uno con 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA, del inglés bovine serum
albumin) en PBS. El anticuerpo secundario dependió del origen del anticuerpo primario,
y se incubaron las muestras por una hora a temperatura ambiente. El tejido se incubó
además con estreptavidina POX (marca comercial, país de origen)por 30 min a
temperatura ambiente. La reacción se reveló con el cromogeno VIP sustrato para
peroxidasa Vector durante el tiempo requerido para cada marca.
Las muestras se colocaron en portaobjetos previamente desengrasados y
después de someterlas a una desecación rápida se montaron como muestras
permanentes con resina Poli-mount Polysciences.
La expresión de las moléculas de estudio se evaluó empleando un microscopio
de campo claro con aumentos de 10, 20 y 40X y las fotografías se tomaron con una
cámara Alpha Innotech.
Evaluación de la frecuencia celular por área de tejido intestinal.
Se contabilizó el número de células con morfología dendrítica por campo a un
aumento de 20X, analizándose un total de 10 campos de muestras representativas
obtenidas de la mezcla de los intestinos de 6 ratones diferentes; 3 para los identificados
como grupo control y 3 para los ratones infectados Se analizaron ambos grupos a las 24
horas de administrada la bacteria La frecuencia celular se calculó contando células
positivas por campo con morfología dendrítica), para posteriormente hacer el cálculo de
células positivas por mm2, considerando el aumento al cual fueron contadas y utilizando
las siguientes fórmulas:
Diámetro de campo= Cifra de campo visual/aumento del objetivo 70
Diámetro de campo= 18 mm/20x
Diámetro de campo= 0.75mm
Una vez obtenido el diámetro de campo, se obtuvo el área por campo de acuerdo con la
siguiente fórmula.
24
Área de campo= r 2
Área de campo= (3.1416) (0.375mm)2 Área de campo= 0.4417mm
El análisis estadístico se llevo a cabo para poder determinar las diferencias entre
el control y muestras tratadas. Utilizando la prueba de T de Student, pareada
25
RESULTADOS
Análisis de la expresión de CD45+, MHC-II+ y DEC205+ en diferentes porciones de
lámina muscular intestinal de ratones adultos inoculados por vía oral con Brucella
abortus .
Análisis de la expresión de CD45+ en la porción duodenal de ratones control e
inoculados.
Se analizó el fenotípo de las DCs en la lámina intestinal de la porcion duodenal del
intestino 24 h después de la inoculación oral de B. abortus. Las células expresando
CD45+ presentaron una morfología diferente en los ratones inoculados con respecto a la
población de células CD45+ en la lamina muscular de los que solo fueron administrados
con bicarbonato, presentando un alargamiento de las dendritas y una disminución en la
intensidad de la expresión en las células CD45+.
Inoculados
Control
A
B
Figura1. Expresión de CD45 en lámina muscular de la porción duodenal 20X.
Distribución y frecuencia de células CD45+ en la porción duodenal.
La población CD45+ se encontró desde la región proximal hasta la distal del intestino.
Es
importante
mencionar
que
la
frecuencia
de
estas
células
disminuyó
significativamente en la porción del duodeno en los ratones infectados con la bacteria,
en comparación con los controles, con una ** p<0.002. con una frecuencia de 460.39
cel/mm2 en el grupo control, y de 257.79 cel/mm2 en el grupo infectado .
26
700
Células CD45+ / mm2
600
Control
**
Brucella 106
500
400
300
200
100
0
Duodeno
Yeyuno-ileon
Intestino grueso
+
Figura 2. Frecuencia de células CD45 en lámina muscular de la porción duodenal 20X. *
p<0.05, ** p< 0.001, *** p< 0.0001.
Análisis de la expresión de CD45+ en la porción yeyuno-ileon.
Al igual que en la porción duodenal se analizó el fenotípo de las DCs en la
lámina intestinal de la porción comprendia por yeyuno e íleon del intestino 24 h después
de la inoculación intragastrica con B. abortus. En este caso la expresión de CD45+
presenta una forma celular diferente en los ratones inoculados con respecto al grupo
control, donde la intensidad de la tinción se observa en mayor grado en el grupo
infectado.
Control
Inoculados
A
B
Figura 3. Expression de CD45 en lámina muscular de la porción Yeyuno-íleon 20X.
27
Distribución y frecuencia de células CD45+ en la porción Yeyuno-Ileon .
En este caso la frecuencia de células en los controles fue de 315 cel/mm2 y en los
infectados con B. abortus fue de 280 cel/mm2 donde a pesar de estas diferencias en
número no nos indica diferencias significativas entre un grupo y otro por lo que estas
variaciones en frecuencia no son significativas significativas.
700
Células CD45+ / mm2
600
Control
**
Brucella 106
500
400
300
200
100
0
Yeyuno-ileon
Duodeno
Intestino grueso
+
Figura 4. Frecuencia de células CD45 en lámina muscular de la porción Yeyuno-íleon 20X. * p<0.05, ** p<
0.001, *** p< 0.0001.
Análisis de la expresión de CD45+ en la porción del intestino grueso .
Al igual que en las dos porciones anteriores se analizó el fenotípo de las DCs en
la lámina intestinal de la porcion del intestino grueso 24 h después de la infección por
vía oral con B. abortus. En este caso la expresión de CD45+ presenta una forma celular
diferente en los ratones inoculados con respecto al grupo control donde la intensidad de
la tinción se observa en mayor grado en el grupo infectado.
28
Control
Inoculados
A
B
Figura 5. Expression de CD45 en lámina muscular de la porción del intestino grueso 20X.
Distribución y frecuencia de células CD45+ en la porción del intestino grueso .
La frecuencia de células en los controles fue de 306.69 cel/mm2 y en los infectados fue
de 400.51 cel/mm2. donde
A pesar de estas diferencias en número no nos indica
diferencias significativas entre un grupo y otro por lo que estas variaciones en
frecuencia no son significativas significativas .
700
600
Células CD45+ / mm2
Control
**
Brucella 106
500
400
300
200
100
0
Duodeno
Yeyuno-ileon
Intestino grueso
+
Figura 6. Frecuencia de células CD45 en lámina muscular de la porción Intestino grueso 20X. * p<0.05,
** p< 0.001, *** p< 0.0001.
29
Análisis de la expresión de MHC-II+ en la porción duodenal
La expresión de MHC-II+ presenta una forma celular diferente en los ratones
infectados con respecto a los controles, presentando una mayor intensidad de marca en
los ratones infectados, el alargamiento de las células observado en otras porciones del
intestino con otras marcas no son evidentes en esta porción. En el caso de las células
MHC-II+ se observan claras diferencias en la intensidad de la tinción en los ratones
infectados con respecto al grupo control
Control
A
Inoculado
B
Figura 7. Expression de MHC-II en lámina muscular de la porción duodenal 20X.
30
Distribución y frecuencia de células MHC-II+ en diferentes porciones intestinales
(duodeno, yeyuno-íleon e Intestino grueso).
Tras la infección observamos que la población de células MHC-II+ se encontraba
presente desde la región proximal hasta la distal del intestino. Por lo anterior, es
importante mencionar que la frecuencia de células MHC-II+ disminuye significativamente
en las tres porciones de estudio desde la región proximal hasta la distal duodeno,
yeyuno-ileon, e intestino grueso con respecto a las células MHC-II+ de la lámina
muscular de los ratones control
1000
Control
Brucella 106
Células MHC-II+/ mm2
800
***
***
600
***
400
200
0
Yeyuno-ileon
Duodeno
Intestino grueso
+
Figura 8. Frecuencia de células MHC-II en lámina muscular de diferentes porciones Intestinales
(Duodeno, Yeyuno-íleon, Intestino Grueso) 20X. * p<0.05, ** p< 0.001, *** p< 0.0001.
31
Análisis de la expresión de MHC-II+ en la porción yeyuno-íleon .
La expresión de MHC-II+ no presenta diferencias en la forma celular en la lámina
muscular de ratones infectados con respecto a los controles, pero si en la intensidad de
la expresión donde la intensidad de la tinción se observa en mayor grado en el grupo
infectado.
En el caso de las células MHC-II+ se observan claras diferencias en intensidad
de marca en los infectados con respecto a la expresión de CD45+ en la misma porción
intestinal (yeyuno-íleon)
Inoculado
Control
A
B
+
Figura 9. Expression de MHC-II en lámina muscular de Yeyuno-íleon 20X.
Análisis de la expresión de MHC-II+ en la porción del intestino grueso.
Al igual que en las dos porciones anteriores, se analizó el fenotípo de las DCs en
la lámina intestinal del intestino grueso 24 h después de la inoculación oral de B.
abortus. En este caso la expresión de MHC-II+ fue claramente diferente en cuanto a la
morfología en los ratones infectados con respecto a los que solo fueron administrados
con bicarbonato, presentando un alargamiento de las células, con una menor cantidad
de dendritas donde la intensidad de marca no presentó cambios notables al ser
analizado.
32
Control
Inoculado
A
B
+
Figura 10. Expression de MHC-II en lámina muscular de Intestino grueso 20X.
Análisis de la expresión de DEC205+ en la porción del duodeno .
La expresión de las células DEC205+ presenta diferente formas celulares en los
ratones infectados con respecto a las formas celulares de los ratones control,
observando una intensidad de tinción semejante en ambos grupos de estudio, el
alargamiento de las células observado en otras porciones del intestino con otras marcas
no es evidente en esta porción. Cabe recordar que la intensidad de tinción de DEC205+
es menor en esta región anatómica (Langarica 2005)
Control
Control
A
Inoculado
B
Figura 11. Expression de DEC205 en lámina muscular de la porción duodeno 20X.
33
Distribución y frecuencia de células DEC205+ en la porción del duodeno en lámina
muscular .
La población DEC205+ se encuentra presente en la porción del duodeno y
yeyuno-íleon de la lámina muscular del intestino. Por lo anterior es importante
mencionar que la frecuencia de células disminuyó significativamente en las tres
porciones de estudio desde la región proximal hasta la distal (duodeno, yeyuno-ileon)
pero destacando el hecho de que en el intestino grueso de los ratones infectados el
descenso en la frecuencia de células
fue considerable con respecto a los ratones
control disminuyendo drásticamente.
500
Control
***
Brucella 106
Células DEC205+ / mm 2
400
300
**
***
200
100
0
Yeyuno-ileon
Duodeno
Intestino Grueso
+
Gráfica 12. Frecuencia de células DEC205 en lámina muscular de diferentes porciones Intestinales
(Duodeno, Yeyuno-íleon, Intestino Grueso) 20X. * p<0.05, ** p< 0.001, *** p< 0.0001.
Análisis de la expresión de DEC205+ en la porción del yeyuno-íleon.
En esta porción la expresión de DEC205+
presenta una forma celular muy
similar en los ratones infectados con respecto al grupo control. Mientras que la
intensidad de la tinción es semejante en los dos grupos de estudio. Por otro lado
observamos una disminución en el tamaño de las células, como si perdieran parte de su
34
soma. La expresion de esta molécula por la intensidad en la tinción es similar en el
grupo infectado y en el control ,
Control
Inoculado
A
B
Figura 13. Expression de DEC205 en lámina muscular de la porción yeyuno-íleon 20X.
Análisis de la expresión de DEC205+ en la porción del intestino grueso.
En esta porción la expresión de DEC205 es compleja de analizar ya que la
presencia de células positivas fue casi nula por lo que evaluar los cambios morfológicos
no es posible.
Con respecto a la intensidad de marca en el caso de las células que se
lograron observar es tenue comparando con la intensidad de marca en el grupo control.
En esta porción del intestino la caida en la frecuencia de células fue más drastica.
Control
Inoculado
A
B
+
Figura 14. Expression de DEC205 en lámina muscular de la porción Intestino grueso 20X.
35
DISCUSION
CD45, también conocido como antígeno leucocitario común, es una glicoproteína
transmembranal expresada abundantemente en todas las células hematopoyéticas
nucleadas (45). Está identificado como un receptor especifico leucocitico tipo tirosin
fosfatasa (PTP) el cual participa en la regulación de la respuesta inmune (46, 47). Se
sabe que es uno de los principales reguladores de la familia Src proteína tirosina cinasa
en linfocitos las cuales se requieren para iniciar funciones tales como la señalización a
través de receptores y la modulación en la producción de citocinas, también participa en
la adhesión de macrófagos (48). en la degranulación de histamina como consecuencia
del entrecruzamiento de los receptores para IgE de los mastocitos (49). mientras que el
entrecruzamiento de CD45 en los neutrófilos regula los receptores de quimiocinas lleva
a la activación de citotoxicidad mediada por los receptores Fc así como a la producción
de IL-6 (50).
En nuestro trabajo se analizó la expresión de CD45 en ratones inoculados con B.
abortus comparando con sus respectivos controes de SSF en las diferentes porciones
del intestino. particularmente en la porción del duodeno del intestino delgado se observa
disminución en la intensidad de la marca de las células morfología ddendritica CD45+ de
los ratones inoculados con B. abortus comparados con la intensidad de la marca de las
células con morfología dendritica CD45+ de los ratones control inoculados con SSF. A
pesar de ser considerado un marcador de células de origen hematopoyético también se
ha encontrado CD45+ en células acinares de páncreas de rata, modelo donde se ha
visto que bajo estímulos inflamatorios las células acinares disminuyen la expresión de
CD45 y que dicha disminución correlaciona con un aumento en la producción de TNF
por parte de las células acinares (51). En los ratones KO de CD45 las DC de bazo al
igual que las DC de MO incrementan la producción de IL-6 y TNF, dicho aumento al
parecer esta ligado a la presencia de PAMPs y a su interacción con los
correspondientes TLRs por lo que se propone que CD45 modula la señalización de
TLRs directamente por la desfosforilación de algunas moléculas (52), en los ratones KO
de MyD88 aumenta la susceptibilidad de los ratones a la infección por B abortus y esto
se debe a la alteración en la maduración de las DCs y la baja producción de IL-12 que a
su vez afecta la producción de IFN por parte de los linfocitos T (53). Se sabe que la
producción tanto TNF como IL-12 son importantes para resistir a la infección por B
abortus vía la producción de IFN (54), entonces es posible que la disminución de la
expresión de CD45 en las células de la lamina muscular intestinal en la porción del
36
duodeno de los ratones infectados con B abortus involucre la disminución de IL-12 y a
su vez de IFN y haga mas susceptible esta zona del intestino a una posible infección.
También se observó cambio en la morfología de las células CD45+ de las láminas
intestinales de los ratones inoculados con respecto a la morfología de las células CD45+
de los ratones control, Andrew S Mc William y cols observaron a las DCs de pulmón con
morfología de células maduras con las típicas dendritas alargadas (descrita como
morfología dendriforme) 24 horas después de inocular M catharralis (55,56), por lo que
es posible las células CD45+ de los ratones inoculados con B abortus se encuentren en
proceso de maduración, lo cual correlación con el hallazgo en la disminución de la
frecuencia (número de células) de las células CD45+ de la lamina intestinal de la porción
del duodeno de los ratones infectados; en estudios previos se ha visto que bajo el
estimulo de TNF las DCs epidérmicas se movilizan rápidamente y migran hacia los
ganglios linfáticos regionales (57), también se conoce que en presencia de LPS las DCs
se movilizan de la pared intestinal hacia la linfa (58), ya que hemos hecho referencia a
que la disminución de la expresión de CD45 esta relacionada con el aumento en la
producción de TNF (59,60), es posible que la disminución de la frecuencia celular se
deba a la presencia de esta citocina y al estimulo de LPS por la presencia de B abortus.
Así como en la porción del duodeno se analizó el fenotípo de la porción de la lamina
intestinal correspondiente al yeyuno e íleon 24 horas después de la inoculación con B
abortus, en este caso se observa que no se modifica la intensidad de la tinción, la
morfología y no hay diferencias significativas en la frecuencia celular de las células
CD45+ con respecto a las células CD45+ de los ratones inoculados con SSF, al parecer
B abortus no modifica la expresión de CD45 en las células de esta porción por lo que
posiblemente estas células produzcan menor cantidad de TNF y/o no exista un
estimulo suficiente que induzca migración celular.
Al igual que en las dos porciones anteriores se analizó el fenotipo de la porción de la
lamina intestinal correspondiente al intestino grueso 24 horas después de la inoculación
con B abortus, en este caso se observa que no se modifica la intensidad de la tinción y
no hay diferencias significativas en la frecuencia celular pero si se modifica la
morfología de las células CD45+ con respecto a las células CD45+ de los ratones
inoculados con SSF, en esta porción del intestino parece que las células se encuentran
en proceso de maduración dado el cambio de morfología adquirida (morfología
dendriforme) el cual se deba quizá a la presencia de LPS de B abortus o algún otra
molécula intermediaria entre la bacteria y las células con morfología dendrítica de la
lamina muscular.
37
Las moléculas del MHC-II están compuestas por dos cadenas polipeptídicas asociadas
en forma no covalente, una cadena alfa de 32-34 Kd y una cadena beta de 29-32Kd, a
diferencia de las moléculas de clase I, ambas cadenas de las moléculas de clase II
estan codificadas por genes polimorfos del MHC. Se expresan principalmente en células
presentadoras de antígeno especializadas, cómo células dendríticas, macrófagos y
linfocitos B y algunos otros tipos celulares, tales como células endoteliales y células
epiteliales del timo . La expresión de los productos génicos del MHC se potencia por
estimulos iinflamatorios e inmunitarios, sobre todo por citocinas como IFN- y TNF-(Abbas 2003).
En nuestro trabajo se analizó la expresión del MHC-II en diferentes porciones del
intestino delgado y grueso (duodeno, yeyuno-íleon y cólon respectivamente) de la
lámina muscular así como la distribución celular con respecto a esta tinción,
observandose cambios en la expresión de la molécula en las tres porciones del grupo
infectado con respecto al grupo control y con una disminución siginficativa en el numero
de células en las tres porciones analizadas de acuerdo a los controles. Se sabe por
estudios realizados que IL-10 disminuye la producción de INF- tras la infección por
Brucella abortus, IFN- es importante en el control de la infección por Brucela en el
ratón, de acuerdo a esto los macrofagos activados por interferon controlan la replicación
de Brucela 2308 in vitro y neutralizan el INF- endogeno in vivo llegando a mantener el
control de la infección, IL-10 es producida por células CD4+ , macrófagos activados y
células B, y es sabido que disminuye la respuesta de un perfil Th1 e incrementa la
susceptibilidad a un gran numero de bacterias y parásitos(61), por lo que nosotros
creemos que si bien el IFN- contribuye en la expresión génica del MHC-II, en este caso
el aumento en la expresión de esta molécula en las tres porciones de la lámina
muscular del intestino de los ratones infectados no obedece a una participación de esta
citocina ya que parece ser un mecanismo de Brucella abortus para evitar el control de
la infección. Por otro lado IL-12 juega un papel importante en ,la induccion de inmunidad
celular a patogenos intracelulares desencadenando la presencia de IFN- por celulas
NK y LinT(7) pero en el caso de la infección por Brucella abortus de acuerdo a Baldwin
y col, la perdida en la producción de IFN-
por ratones BALB/c se encuentra
parcialmente relacionado en la disminución de la afinidad del receptor β2 de IL-12 (62).
Cheers y col mostraron que el TNF- tiene una participación importante en el control de
la infección y esto es de suma importancia debido a que se ha visto que son varios los
posibles mecanismos por los cuales TNF puede contribuir a la protección de los ratones
BALB/c infectados por Brucella abortus. Esto ha sido demostrado en ratones
que
carecen del receptor para TNF y son deficientes en la producción de IL-12, sugiriendo
38
que TNF media en la producción de IL-12.Se ha visto en otros estudios que IFN- por
mecanismos independientes regula la producción de IL-12 en la contención de la
infección por leishmania (63). TNF-α además se sabe que tiene un papel importante en
la producción de oxido nítrico.
TNF- esta involucrado en la activación de macrófagos por la actividad
brucelicida de estos en ausencia de la activación de IFNγ lo que contribuye a la
disminución de la bacteria por fagocitosis(64).
Por todo lo anterior si bien sabemos de la trascendental participación en la infección
de IFN-, IL-12 y TNF-(65), la razón del porque el aumento en la intensidad de la
tinción de MHC-II en nuestro trabajo todavía no es claro, pero de acuerdo a Celada y
col. el
LPS puede aumentar la expresion de moléculas MHC-II mientras que en
macrófagos se inhibe por la inducción de IFNγ.
En este estudio se muestra que LPS aumenta la expresión constitutiva de MHCII en DCs y en celulas B de la linea celular A20 por aumento en la transcripción de
CIITA via el factor transcrpcional AP-1(66), y aunque en nuestro trabajo el análisis se
hizo in vivo es posible que un fenomeno semejante se este presentando en el aumento
en la expresión de estas moléculas. Lo anterior puede seguir la ruta; LPS de Brucella
abortus que señaliza via TLR2 y TLR4, donde TLR2 no juega un papel importante en la
infección(67), donde TNF- es TLR2 dependiente mientras que IL-12 es TLR2
independiente pero MyD88 dependiente, por lo que la síntesis de IL-12 es TLR9
dependiente y se ha visto que en ratones TLR9 knockout, la respuesta en el perfil Th1
en el ratón no es efectiva. En este estudio también concluyen que la deficiencia en la
síntesis de IL-12 por células dendríticas tiene un impacto directo sobre la producción de
IFN-γ.
La disminución en el número de células presentes con respecto a las observadas en
los controles puede deberse a que algunas citocinas pueden inducir migración celular y
como describimos anteriormente la disminución en la expresión de IFN- sitúa a IL-12 y
TNF- como los principales participantes en la inducción migracional en las tres
diferentes porciones intestinales de la lámina muscular del ratón infectado vs. control.
Por lo que creemos pueden suceder dos cosas: que al transcurrir las 24h post infección
la Brucella, infecta macrófagos y células dendríticas localizadas en la vecindad de la
lamina propia y vía la excreción de citocinas proinflamatorias observamos la migración
así como la expresión de moléculas MHC-II+ en células dendríticas y macrófagos de la
39
lámina muscular, o por otro lado que por mecanismos que desconocemos la bacteria
sea tan invasiva que a las 24h llegue hasta ese estrato en el intestino generando los
procesos antes mencionados, aumento en la expresión de la molécula de clase II y la
migración de algunas de estas células.
DEC205 (CD205) es un receptor que participa en la captura y procesamiento de
antígenos, pertenece a la familia de receptores multilectinas transmembranal tipo I, al
igual que el receptor de manosa y el receptor de fosfolipasa A2; el dominio extracelular
de estas moléculas contienen un domino rico en cisteinas, un dominio tipo fibronectina
tipo II y múltiples dominios de lectina tipo C (68), la porción intracitoplasmatica contiene
motivos para tirosina y/o aminoácidos hidrofóbicos que participan en la endocitosis
(69,70). Se expresa en las células de Langerhans, DCs interdigitantes, epitelio tímico
(71), DC interfoliculares (72, 73), el ligando especifico aun no se conoce, sin embargo
se sabe que participa activamente en el proceso de endocitosis y se internaliza hacia
los compartimentos ricos en moléculas de clase II (74), cuando los antigenos son
dirigidos in vivo conjugando estos a un anticuerpo anti-DEC205, al parecer se
incrementa la eficacia de la presentación de dicho antígeno (75). En este trabajo se
analizó la expresión de DEC205 en lamina intestinal de las porciones del duodeno
yeyuno-ileon e intestino grueso encontrándose células positivas para estas moléculas
en general con intensidad en la tinción baja como se había reportado previamente tanto
en los ratones inoculados con B abortus así como en las células DEC205+ de los
ratones control (76), se observa menor cantidad de células positivas para DEC205 en
las tres porciones analizadas de lamina intestinal, destacando la porción de la lamina
intestinal del intestino grueso de los ratones inoculados con B abortus donde se observa
una disminución drástica en la frecuencia comparado con los ratones inoculados con
SSF, no hemos determinado la presencia de la bacteria en las laminas pero es un
hecho que la inoculación modifica la cantidad de células en las laminas intestinales, las
cuales posiblemente estén migrando; cabe destacar que en la estructura del LPS de B
abortus en su O-polisacarido se encuentran compuesto por manosa, glucosamina, N
acetil glucosamina (77, 78), moléculas que posiblemente sean reconocidas por DEC205
dada la características del grupo de lectinas al que pertenece (79).
40
CONCLUSIONES

Tras la estimulación intragástrica de una bacteria viva (Brucella abortus) se
observaron cambios fenotípicos en las DCs de las láminas intestinales:

Las células CD45+ presentaron una morfología diferente en los ratones
inoculados con respecto a la población control en la lámina muscular,
presentando un alargamiento
de las dendritas y una disminución en la
intensidad de la expresión así como una mayor distribución celular en la porción
del duodeno.

La expresión de CD45 en la porción yeyuno-íleon presenta una forma celular
diferente en los ratones inoculados con respecto al grupo control, donde la
intensidad de la tinción se observa en mayor grado en el grupo infectado.

La expresión de CD45 en la porción del intestino grueso presenta una forma
celular diferente en los ratones inoculados con respecto al grupo control donde
la intensidad de la tinción se observa en mayor grado en el grupo infectado.

La distribución celular en las porciones yeyuno-íleon e intestino grueso
comparado con la porción duodeno del marcador CD45 no presento diferencias
significativas con respecto a los controles.

Las células MHC-II+ presentan claras diferencias en la intensidad de la tinción en
los ratones infectados con respecto al grupo control en las diferentes porciones
del intestino así como, una significativa disminución en la frecuencia celular. Las
células DEC205+ no presentan diferencias en la intensidad de la tinción entre las
diferentes porciones del intestino pero si, una disminución significativa en la
frecuencia celular de la lámina muscular del intestino grueso

De acuerdo a la composición antigénica de Brucella abortus (compuesta entre
otras moléculas por LPS), y a la posible síntesis de factores solubles presentes
en el ambiente celular (IFN-γ,TNF-α, IL-12,) es posible observar cambios en la
migración y expresión de células dendríticas CD45+, MHC-II+ y DEC205+ de la
lamina muscular del intestino.
41
PERSPECTIVAS

Identificar la presencia de la bacteria en estudio in situ para verificar la
interacción con las células residentes de este tejido y afirmar el efecto que esta
pueda causar en ellas.

Determinar por RT-PCR la presencia de citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-12
para
verificar su participación en el fenómeno observado.

Verificar la expresión de moléculas relacionadas (TLRs) con la interacción
bacteria-hospedero relacionadas con la presencia del LPS de Brucilla
42
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48
Ac
Dilución HUÉSPED
DISTRIBUIDOR
No. CAT
553076
CD45
1:500
Rata
Pharmigen
MHC-II
1: 50
Rata
Donado por Dr. Leopoldo Santos
DEC205
1: 5
Rata
Serotec
IgG-Rata
1: 100
Control
Jackson
012000003
Chivo
Vector
BA-4001
Southern Biotech
7100-05
a Rata-Biot 1: 1000
SAV-POX
1: 1000
_
MCA949-
49
50