Download Modulación de células dendríticas de la piel en la inducción de

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Modulación de células dendríticas de la piel en la
inducción de distintos tipos de respuesta inmune efectora.
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORADO EN
CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA
PRESENTA
M. en C. DAVID EDUARDO MEZA SANCHEZ
Directora: Dra. Laura Cecilia Bonifaz Alfonzo
Director interno: Dr. Francisco Javier Sánchez García
ii
iii
iv
INDICE GENERAL
INDICE DE FIGURAS
vi
ABREVIATURAS
vii
RESUMEN
viii
ABSTRACT
ix
ANTECEDENTES
x
Estructura de la piel
1
Subtipos de células dendríticas
3
Maduración de células dendríticas
4
Importancia de los Adyuvantes en la Respuesta Inmune
7
Inmunobiología de células dendríticas de la piel
8
Células dendríticas en epidermis
9
Células dendríticas en dermis
11
Inmunización en piel
12
JUSTIFICACIÓN
14
HIPOTESIS
15
OBJETIVO
16
MATERIALES Y METODOS
17
Ratones
17
Reactivos
Enriquecimiento de linfocitos T CD4
17
+
18
Marcaje y transferencia de linfocitos T CD4+
18
Inmunización
19
Co-cultivo
19
Determinación de citocinas
Citocinas en secreción
20
Tinción intracelular
20
Inmunofluorescencia
21
v
RESULTADOS
A. Proliferación de linfocitos T CD4
22
B. Efecto adyuvante en la proliferación de linfocitos T CD4+
antígeno específico.
24
C. Expresión de MHC-II, CD86 y CD40 en células de Langerhans
de ratones B10BR transferidos.
25
D. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 +
de ratones B10BR transferidos.
E. Determinación de citocinas Th1/Th2/Th17 en ratones Balb/c.
30
32
F. Expresión de citocinas después de la inmunización por diferentes
vías de inoculación.
G. Efecto adyuvante de Subunidad B de TC.
35
38
H. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de
la Respuesta inmune efectora después de inmunización en piel.
41
DISCUSIÓN
44
CONCLUSIONES
51
BIBLIOGRAFÍA
52
vi
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Anatomía de la piel y de células efectoras.
Figura 2. Fenotipo y localización de subtipos de células dendríticas.
Figura 3. Modelo de interacción entre subtipos de DC y linfocitos T durante la
infección.
Figura 4. Interacción de DC con células del sistema inmune.
Figura 5. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ con diferentes dosis de
antígeno vía intradérmica en oreja.
Figura 6. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios
ganglios linfáticos.
Figura 7. Proliferación de linfocitos T CD4+ en ganglios linfáticos cuando se
administran diferentes adyuvantes.
Figura 8. Expresión y distribución de MHC-II en células de Langerhans de
ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+.
Figura 9. Expresión y distribución de MHC-II y CD40 en células de
Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+.
Figura 10. Expresión y distribución de MHC-II y CD86 en células de
Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+.
Figura 11. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de
ratones B10BR transferidos.
Figura 12. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de
ratones Balb/c transferidos.
Figura 13. Proliferación de linfocitos T CD4+ cuando se administra el antígeno
en diferentes vías de inoculación.
Figura 14. Proliferación de linfocitos T CD4+ con 1 μg de LG en diferentes vías
de inoculación.
Figura 15. Expresión de citocinas cuando se administra el antígeno en
diferentes vías de inoculación.
Figura 16. Cinética de distribución de MHC-II y CD86 en TC y CTB.
Figura 17. Importancia de CTB en la inducción de respuesta inmune.
Figura 18. Las CD de la piel no son responsables de la proliferación de
Linfocitos T CD4+.
Figura 19. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de
respuesta inmune efectora.
Figura 20. Citocinas intracelulares en linfocitos T después de quitar el sitio de
Inoculación.
vii
ABREVIATURAS
Ag
Antígeno
BTC
Subunidad B de toxina de cólera
BSA
Albúmina sérica bovina
CD
Célula Dendrítica
CD40
Proteína coestimuladora en células presentadoras de antígeno
CD86
Proteína activadora de la familia B7
CL
Células de Langerhans
CPA
Célula presentadora de antígeno
FACS
Fluorescent activated cell sorter
GLd
Ganglio linfático de drenaje
IFN
Interferon gamma
IL
Interleucina
kDa
KiloDalton
LG
Lisozima de Gallina
M
Molaridad
MHC
Complejo principal de histocompatibilidad
OVA
Ovoalbúmina
PBS
Solución amortiguadora de fosfatos
PE
Ficoeritrina
RI
Respuesta Inmune
SFB
Suero Fetal bovino
Stv
Estreptavidina
TC
Toxina de cólera
TCR
Receptor T de linfocitos T
TLR
Receptores tipo Toll
TNF
Factor de necrosis tumoral
viii
RESUMEN
La respuesta inmune dada por la inmunización cutánea y el papel de las
células dendríticas
en el inicio de esta respuesta permanece controversial
hasta nuestros días,
Aquí nosotros evaluamos el linfocitos T CD4+ después
de la inmunización en la oreja con bajas dosis de un antígeno modelo en
combinación con toxina de cólera (TC).
Nosotros encontramos presentación
de antígeno local en ganglios linfáticos de drenaje (GLd) que se traduce en
producción de IFN-γ e IL-17 por linfocitos T CD4+, aunque las células
productoras de IFN-γ fueron más frecuentes que las células productoras de IL17 e IFN-γ/IL-17. la subunidad B de TC (BTC) indujo activación de CD
de la piel y diferenciación de linfocitos T de manera similar a la toxina
completa.
células
La presentación de antígeno pudo haber sido lograda por
presentadoras
notablemente
de
antígeno
en
el
GLd,
sin
embargo
y
la producción de IFN-γ/IL-17 por linfocitos CD4+ fue
dependiente de la presencia de células migrantes de la piel, que llegan al
GLd dentro de las primeras 24 horas después de la inmunización. Estos
resultados indican que en el contacto inicial después de la inmunización,
la respuesta de IFN-γ es dominante sobre IL-17, IL-4 e IL-5 sugiriendo
que la expansión clonal de linfocitos T CD4+ puede ser atribuida a CD
presentadoras en GLd, una segunda oleada de presentación de antígeno
por
CD
migrantes
de
la
piel
es
necesaria
para
una
eficiente
diferenciación de células T CD4+ productoras de IFN-γ/IL-17
ix
ABSTRACT
The immune response elicited by cutaneous immunization and the role of
migrating dendritic cells (DCs) in shaping this response remains controversial.
Here we evaluated the initial priming of CD4+ T cells after ear immunization with
low doses of model antigens in combination with cholera toxin (CT). We found
local antigen presentation in draining cutaneous lymph nodes (dCLN) that
translates into the production of IFN-γ and IL-17 by CD4+ T cells, although IFNγ-producing cells were more frequent than IL-17 and IFN-γ/IL-17 cells. The β
subunit of CT (CTB) induced skin DC activation and T cell differentiation
similarly to the complete toxin. Antigen presentation could be achieved by
presenting cells in the dCLNs, however and remarkably, IFN-γ/IL-17 production
by CD4+ T cells was dependent on the presence of migrating skin cells that
arrive at the LN during the first 24 hr after immunization. These results indicate
that in the initial priming after ear immunization, IFN-γ responses are dominant
over IL-17, IL-4 and IL-5 and suggest that even when clonal expansion of CD4+
T cells can be achieved by DCs present in dCLNs, a second wave of antigen
presentation by migrating DCs is necessary for efficient IFN-γ/IL-17 CD4+ T cell
differentiation.
x
ANTECEDENTES
Estructura de la piel
La piel, es la interfase primaria entre el cuerpo y el ambiente, provee la
primera línea de defensa contra patógenos microbianos y agresores físicos y
químicos. La inmunovigilancia de un organo tan extenso y expuesto, presenta
un desafío único para las células dendríticas (CD) y otras células del sistema
inmune que lo constituyen. De tal forma que, si una respuesta inmune es
inadecuada, podrian desarrollarse infecciones y tumores y si, una respuesta
inmune es excesiva, entonces inflamación crónica y autoinmunidad pueden ser
desarrolladas. Por lo tanto, los mecanismos de defensa activos como las rutas
tolerogénicas contribuyen a la homeostasis inmune, asegurando que la
respuesta inmune en la piel sea la adecuada para el desafío antigenico. (Nestle
O. F., 2009).
Debido a su accesibilidad, la piel es un sistema ideal en el que podemos
estudiar tanto el tejido como todo el organismo ante daños locales y sistémcos.
La piel, tiene dos compartimentos principales: la epidermis y la dermis.
La epidermis es el compartimento exterior y contiene cuatro estratos. El estrato
basal es la capa inferior de la epidermis y es la responsable de la renovación
constante de las celulas de la piel. Esta capa contiene solamente una hilera de
células no diferenciadas conocidas como queratinocitos basales, que se
dividen frecuentemente. Estos se diferencian y mueven a la siguiente capa,
conocida como estrato espinoso, en donde comienza un proceso de
maduración pero también de división para la lamina basal. Las células que se
mueven del estrato espinoso cambian su forma de columna, a poligonales y
comienzan a sintetizar queratina. Los queratinicitos en el estrato granuloso
está caracterizado por marcas oscuras de material citoplasmático y estas
células producen activamente proteínas queratínicas y lípidos. Finalmente el
estrato corneo como último producto de maduración de los queratinocitos es el
estrato más expuesto de los cuatro y es el principalmente responsable de la
1
función de barrera de la piel, excluyendo agentes tóxicos y previniendo la
deshidratación. Células especializadas, como melanocitos (encargados de la
pigmentación de la piel) y células de Langerhans (CL), que son las principales
células del sistema inmune residentes en la piel, así como linfocitos T,
principalmente CD8+ pueden ser encontrados en los estratos basales y
espinosos.
La dermis es anatómicamente un tejido más complicado, con una gran
diversidad celular, ya que contiene células del sistema inmune especializadas,
como CD, linfocitos T CD4+ y linfocitos T γδ y células NKT, sin embargo,
macrófagos, células cebadas, fibroblastos y células del sistema nervioso
también están presentes.
La dermis es drenada por conductos linfáticos y
vasculares a través del cual, las células migrantes se pueden trasladar
(Proksch E., 2008)
Figura 1. Anatomía de la piel y de células efectoras (Frank O. Nestle, Nature review
Immunology, 2009)
2
Las CD a pesar de no ser tan abundantes, son células que se
encuentran
ampliamente
distribuidas
en
el
organismo
y
que
están
especializadas para la captura, procesamiento y presentación de antígenos a
linfocitos T.
Subtipos de células dendríticas
Existen dos posibles rutas de ontogenia de células dendríticas, a partir
de células progenitoras hematopoyéticas, una ruta genera células dendríticas
mieloides CDm y otra que genera DCp (Grouard G.,1997) El ligando de Flt3
aparece como el factor principal que dirige la homeostasis de las CD en reposo
In vivo, las CDm se encuentran en al menos tres compartimentos: CD
residentes de tejido periférico, CD residentes de órganos linfoides y CD en
circulación sanguínea.
Las CD convencionales pueden ser clasificadas en tres subtipos en
bazo, esto de acuerdo con la expresión de CD4 y CD8α (Vremec D., 2000).
No ha sido determinado si la mayoría de células CD4- CD8- son distintas del
subtipo CD4+, pero varios reportes han mostrado diferencias (Proietto A, 2004;
Lundie RJ, 2008)
La complejidad de los subtipos de CD se hace más evidente cuando
analizamos el ganglio linfático, ya que además de estar conformado por las CD
que normalmente se encuentran en el bazo, también lo conforman CD
migrantes de la piel que son las CL, CD dermales (CD der) y CD CD103+,
llamadas CD dermales Langerina+.
En la piel, estos tres tipos distintos de CDm migrantes, se encuentran en
dos áreas diferentes. Las células de Langerhans (CL) residen en la epidermis
y las CDder están presentes en la dermis64 al igual que las CD Langerina+
(Bursh LS, 2007; Poulin L.F., 2007; Ginhoux F., 2007).
3
Figura 2. Fenotipo y localización de subtipos de DC. (Heath W. and Carbone F. Nature
Immunology, 2009)
Maduración de CD
Las células dendríticas inician la respuesta inmune adaptativa, a través
de la captura de antígeno en la periferia, el procesamiento y presentación del
antígeno endocitado en forma de péptidos unidos a proteinas del MHC en la
superficie, y por movilización a ganglios linfáticos de drenaje donde establecen
contacto con los linfocitos T especificos. Aquí las células dendríticas derivadas
de la dermis migran lentamente, explorando el sitio, desplegando activamente
las dendritas mientras realizan frecuentes contactos transitorios con linfocitos T
altamente móviles (Millar MJ, 2004, PNAS; Millar MJ 2004 JEM).
Durante la inmunización activa, las interacciones de CD con linfocitos T
son más estables, iniciando la proliferación de linfocitos T y la consecuente
producción de citocinas (Millar MJ, 2004; Bousso P 2003;,Mempel TR, 2004)
4
Figura 3. Modelo de interacción entre subtipos de DC y linfocitos T durante la infección
(Heath W. and Carbone F. Nature Immunology, 2009)
La respuesta inmune mediada por linfocitos T se caracteriza por la
producción de citocinas específicas por células activadas, acompañadas por la
diversificación funcional de los linfocitos T. Generalmente, las CD responden a
microorganismos intracelulares induciendo linfocitos T CD4+ hacia una
respuesta tipo Th1, caracterizada por producción de IFN-γ.
5
Por otro lado, la infección por patógenos extracelulares lleva a la
polarización de linfocitos T hacia una respuesta inmune tipo Th2, caracterizada
por la producción de IL-4 (Agrawal S., 2003).
Estas funciones de
especialización de linfocitos T CD4+ activados, dependen de varios factores.
De manera general, el destino de las células T naive, es determinado por tres
señales provistas por las CD, en contacto con patógenos
1)
La señal 1, resulta de la ligación del receptor de células T (TCR)
con
péptidos
derivados
de
patógenos,
presentados
por
moléculas MHC-II en la superficie de las CD (complejo MHC-IIPéptido), y por la unión de CD40 con su ligando CD154; estas
señales determinan la especificidad del antígeno.
2)
La señal 2, es una señal coestimuladora, y es principalmente
mediada por la activación de CD28 a través de moléculas CD80
y CD86 expresadas en CD después
de su activación
(Cunningham A.J., 1977).
3)
La señal 3 es una señal polarizante, esto es, se refiere a señales
derivadas de células presentadoras de antígeno (APC) hacia
células T, determinando la diferenciación de una célula T
efectora (células T helper (TH1), células TH2, TH3, TH17, Treg o
linfocitos T citotóxicos Kalinski P., 1999; Curtsinger J.M, 2003).
La señal 3, depende del estímulo de maduración recibido, así
como las condiciones impuestas por el microambiente.
Estas tres senales, en conjunto, determinan la funcion que desarrollaran los
linfocitos T.
6
Importancia de los adyuvantes en la Respuesta Inmune
Varios adyuvantes han sido utilizados en vacunas para incrementar la
respuesta inmune humoral y celular, teniendo un papel crítico en la
determinación de la polarización de linfocitos T (Agrawal S, 2003; Pulendran B,
2006) adyuvantes tales como LPS u oligonucletidos CpG no metilados (CpG),
activan
células
dendríticas
vía
receptores
tipo
Toll,
TLR4
y
TLR9
respectivamente, estímulos que promueven una respuesta inmune tipo Th1
(Pulendran B, 2006).
Recientemente ha sido mostrado que la polarización hacia el tipo Th2
puede ser inducida por cistein-proteasas, como la papaína o por toxinas
derivadas de bacterias, como E. coli o Vibrio cholerae.
La toxina producida por Vibrio cholerae, es una enterotoxina termolábil
con peso molecular de 10,000 a 90,000 Daltons (Besson P., 1977). Está
conformada por dos subunidades (A y B). La subunidad “A” está compuesta a
su vez por dos moléculas; la molécula que corresponde a la fracción tóxica, la
cual transforma el ATP en AMPc, y la molécula A2 que esta encargada de unir
la unidad “A” con la subunidad “B”, mediante puentes disulfuro. La subunidad
“B” es un homopentámero, encargado de unir la toxina a un receptor
denominado gangliosido GM1 (monosialogangliosido), el cual está presente en
todas las células nucleadas de los mamíferos (Holmgren J. 1981).
La toxina de cólera (TC) administrada por vía oral, induce una rápida
movilización de células dendríticas inmaduras en la pared intestinal que es
seguida por la expansión de una gran cantidad de CD maduras en los nódulos
linfáticos mesentéricos (NLM) de drenaje, con aumento en la expresión de
CD80 CD86 y CD40 (D). La TC, es uno de los más potentes adyuvantes
utilizados en mucosas, ya que no únicamente abroga la tolerancia, sino que
también potencia predominantemente una respuesta de linfocitos T y B (Elson
C, 1984; Holmgren J, 1993; Lycke N, 1986; Xu-Amano J, 1993).
7
Algunos estudios han propuesto que la TC induce una fuerte respuesta
tipo Th2 co-administrada con antígenos modelo, basados en la producción de
IL-4, IL-5 e IL-10, pero bajas cantidades de IFN-γ (Yamamoto S, 1997; XuAmano J, 1993;
Simecka JW, 2000; Marinaro M, 1995).
Además, se ha
demostrado que TC y la enterotoxina de E. coli pueden suprimir la producción
de IL-12 e IFN-γ (Ryan EJ, 2000; Braun MC, 1999). Sin embargo, otros
estudios han reportado una mezcla de respuestas Th1/Th2, con producción
simultanea de IFN-γ e IL-4 después de la inmunización con TC por las vías
oral e intranasal (Yanagita M, 1999, Schaffeler MP, 1997) y Lavelle et al,
demostró que la TC también promueve la generación de células T reguladoras
contra antígenos modelo. (Lavelle EC, 2003)
En un estudio reciente, Lee y colaboradores demostraron la capacidad
que tiene TC de inducir una respuesta tipo Th17, con una alta producción de IL17 e IL-6, siendo precisamente esta última, clave para desarrollar este tipo de
respuesta (Lee JB, 2009).
Inmunobiología de CD de la piel
Con la ayuda del microscopio de dos fotones, el cual permite visualizar el
sistema inmune in vivo en tiempo real y por medio de tinción intravital,
Debasish S. y colaboradores revelaron las secuencias de movilidad e
interacción dinámica que tiene las células dendríticas de la piel en la dermis y
epidermis, cuando están en presencia de adyuvantes y como esto puede
contribuir a la polarización de linfocitos T (Debasish S, 2010).
En este estudio, determinaron que: i)En la oreja, las CL están presentes
dentro de los primeros 40 μm de la superficie y las CD dermales se localizan
más profundamente, entre 40 y 100 μm. Dentro del cojinete plantar, las CL se
localizaron dentro de los 60 μm de profundidad, pero importantemente, no se
detectaron CD dermales a más de 350 μm. ii) Las CD dérmicas y CL son
diferencialmente movilizadas durante la sensibilización por contacto y por
8
adyuvantes, tales como CpG y LPS que inducen una respuesta tipo Th1 o
Papaína que se ha demostrado que induce una respuesta tipo Th2. iii) La
sensibilización en la oreja por LPS, CpG y Papaína, inducen movilización de
CD dermales en tres distintas fases: a) Incremento de la movilidad y sondeo de
CD, la cual ocurre dentro de los primeros 10 a 20 minutos después de aplicado
el estímulo, b) migración dirigida que se da entre los 20 y 90 minutos
subsecuentes y c) la entrada a vasos linfáticos que ocurre después de los 90
minutos aproximadamente. iiii) Durante este mismo tratamiento, las CL de la
oreja permanecen inmóviles por más de 48 horas, iiiii) La polarización Th1 de
linfocitos T CD4+, fue independiente del sitio de inmunización, mientras que la
inmunización en la oreja, favoreció la respuesta Th2.
Con este estudio concluyen que la movilización de CL incrementa una
respuesta Th1, pero no Th2, mientras que la movilización de CD dermales es
suficiente para inducir proliferación de células T y polarización inicial de
linfocitos T hacia una respuesta Th2 (Sen D, 2010),
CD en epidermis
En la actualidad, las evidencias sobre el papel de las células de
Langerhans en el organismo en condiciones de salud y enfermedad son
contradictorias,
Algunos reportes indican que al aplicar un antígeno directamente en la
epidermis por administración epicutánea, después de remover el estrato
corneo, se induce una respuesta tipo Th2 en ausencia de adyuvantes (Strid, J.,
2004)
Otros trabajos describen que, a diferencia de lo descrito para CD en
reposo, las CD de la piel, migran constantemente al ganglio linfático, en donde
las CL inducen una eficiente respuesta inmune con secreción de IFN-γ.
Mayerova, D., 2004), sugiriendo que la función de estas células, incluso en
reposo, es la inducción de respuesta inmune.
9
Algunos resultados muestran que después de infectar ratones con el virus
de herpes simple exclusivamente en la epidermis, las células de Langerhans no
son las que presentan e inducen respuesta inmune contra el virus (Allan, R.S,
2003). Estos resultados sugieren que las CL sólo transportan el antígeno de la
epidermis y que las CD CD8+ residentes del ganglio son las que
transpresentan el antígeno a los linfocitos T (Bosnjak L, 2005). También se ha
reportado recientemente que CL aisladas de la epidermis o migrantes de
explantes de la piel, realizan presentación cruzada de proteínas solubles o
antígenos acoplados a células en moléculas de MHC-clase I a células T CD8+.
A demás, estas células T CD8+ activadas, ejercen funciones efectoras tal como
producción de citocinas y actividad citotóxica (Stoitzner P, 2006).
Recientemente, se han desarrollado modelos murinos en los que las CL
pueden ser depletadas por inoculación de toxina diftérica (TD) o aisladas por
una molécula de EGFP+ unidas a la molécula de Langerina (LanherinaDTREGFP), (Bennett C, 2005; Kissenpfennig A, 2005). Estos modelos serán un
impulso importante para el desarrollo de experimentos in vivo que permitan
entender la función de las CL.
En
otros
modelos
murinos
experimentales,las
CL
nunca
se
desarrollaron y estos ratones carecen constitutivamente de esta células
(ratones Langerina-DTA) (Kaplan D, 2005).
Los resultados obtenidos en el modelo experimental de depleción por TD
han sido contradictorios, ya que cuando cantidades bajas de antígeno son
aplicadas en la piel las CL son determinantes en la respuesta inmune. Sin
embargo, cuando grandes cantidades de alergenos son aplicados, las CD
pueden substituir la carencia de CL y mediar la hipersensibilidad por contacto
(Noordegraaf M, 2010). Estos resultados, contrastan con los modelos de ratón
en los que las CL están ausentes desde el nacimiento, ya que en estos últimos
se ha demostrado que, sin importar la cantidad de sensibilizante utilizado, las
CL incrementan las reacciones de hipersensibilidad por contacto. Esta
discrepancia no ha sido explicada.
10
CD en dermis
En el caso de la dermis, los recientes descubrimientos de nuevos
subtipos de CD dermales que expresan Langerina+, han complicado la historia
aun más ( Poulin L, 2007; Ginhoux F, 2007), Bursch LS, 2007) El subtipo de
células CD dermales Langerina+ constituye del 30-60% de todas las CD
Langerina+ en los nodos linfáticos de drenaje de la piel, aunque dicha
población es escasa en la dermis. Estas células representan un subtipo de
células dendríticas distintas ya que al parecer cumplen muchas de las
funciones que habían sido atribuidas hasta ese momento a las CL (Kaplan,
2008). Varios reportes indican que estas CD dermales Langerina+, son
mediadores de la respuesta inmune en la piel, como hipersensibilidad por
contacto (Wang L, 2008), y presentación cruzada de antígenos expresados en
los keratinocitos de la epidermis, así como antígenos virales (Bedoui S, 2009).
Figura 4.
Interacción de DC con células inmune (Nestle O.F., Nature Reviews
Immunology, 2009
11
Inmunización en piel
El diseño de nuevas propuestas de vacunación a través de la piel es
muy atractiva por su simplicidad y facilidad, pero principalmente por la
respuesta inmunológica que pueden inducir las CD, es por eso que las CD son
prometedoras candidatas para inmunoterapia contra cancer. Actualmente, la
inmunoterapia convencional de CD, consiste , en la diferenciación in vitro de
monocitos de sangre periférica o de células precursoras CD34+ de pacientes, a
CD, posteriormente estas células son cargadas con el antígeno tumoral y
transferidas de regreso a los pacientes con cancer (Stoizner 2008). Algunos
pacientes con cancer con tumoraciones sólidas malignas tal como son el
cancer renal y el melanoma, han mostrado mejoría clínica e incluso la completa
remisión del tumor (Schuler G, 2003; Shuler Thurner, 2002).
Las desventajas
que presenta este tratamiento, es el elevado costo, además de lo incomodo
que resulta para el paciente todo el proceso. Es por eso que se han buscado
nuevas estrategias de inmunoterapia en piel que resuelvan estos problemas.
Una de las estrategias que se han seguido, es cargar las células
Langerhans in situ con proteínas antigénicas, a través de inmunización
epicutánea en la piel, que consiste en retirar el estrato corneo mediante el
contacto repetitivo con cinta adhesiva. El uso de esta inmunoterapia ha
demostrado que no solo las LC, si no también las CD dermales, presentan el
antígeno a los linfocitos T en el ganglio drenante, y además, inducen células T
CD8+ de memoria de larga duración, capaces de inhibir el crecimiento del
melanoma trasplantado en un modelo murino (Stoitzner P, 2008).
Otra aplicación importante es el tratamiento de prevención de
infecciones. Glenn et al, comenzaron a desarrollar vacunación con toxinas,
como toxina de cólera y toxoide tetánico, con las cuales lograron proteger a
ratones, de subsecuentes desafíos con estas toxinas (Glenn G, 1998).
12
En un estudio, donde se comparó la eficiencia de la vía epicutánea,
quitando el estrato corneo, contra la vía intramuscular, se administró Agripal,
que es una vacuna contra influenza, disponible comercialmente. Ambas rutas
de vacunación indujeron producción de IFN-γ en células T CD4+ activadas, sin
embargo, la respuesta de células T CD8+ fue únicamente detectada solo en la
administración en piel y no en el músculo (Vogt A, 2008)
Una característica importante que tiene la piel, es que las vacunaciones
que se realizan en ella, puede generar respuestas inmune diferentes, como se
ha demostrado por la inducción de tolerancia, inhibiendo la encefalomielitis
autoinmune experimental (Bynoe M, 2003).
Por lo anterior, las células dendríticas de la piel son las mejores
candidatas para evaluar tanto los procesos de maduración de las CD in vivo,
como para estudiar la capacidad de respuesta de las CD inmaduras a distintos
estímulos.
En conclusión, la inmunización en piel, representa una nueva
opción para el tratamiento y prevención de una multitud de afectaciones que
aquejan al ser humano.
13
JUSTIFICACIÓN
Las células dendríticas de la piel parecen jugar un papel clave en la
inducción de la respuesta inmune y hasta el momento se desconoce si las CD
de la piel pueden controlar y dirigir el tipo de repuesta. Es importante, por lo
tanto, determinar las consecuencias de la inmunización en piel, en el inicio de
una respuesta inmune celular.
14
HIPOTESIS
La calidad de la respuesta inmune inducida por inmunización en piel,
será distinta a la generada por otras vías de inoculación y esto será
dependiente, de la presencia o ausencia de células dendríticas de la piel.
Las células dendríticas de la piel juegan un papel clave en la inducción y
tipo de respuesta inmune celular inducida por la inmunización en piel.
15
OBJETIVOS
GENERAL
„
Determinar la participación de las células dendríticas de la piel en la
inducción y tipo de respuesta inmune inducida por la inmunización en la piel.
ƒ
PARTICULARES
ƒ
Inocular bajas cantidades de antígeno por vía intradérmica en
oreja del ratón y evaluar la proliferación de linfocitos T antígeno
específicos en los ganglios linfáticos drenantes al sitio de
inoculación.
ƒ
Determinar la activación de células dendríticas de la piel (CL)
después de la administración local de diferentes adyuvantes
mediante la expresión de moléculas MHC clase II y moléculas
coestimuladoras.
ƒ
Evaluar el patrón de citocinas que expresan los linfocitos T
antígeno específicos, después de inocular bajas dosis de
antígeno en la piel (oreja) en presencia de distintos adyuvantes y
en comparación con otras vías de inoculación.
ƒ
Determinar el tipo de respuesta inmune inducido por la
coadministración de bajas cantidades de antígeno en la piel en
combinación con la subunidad B de TC.
ƒ
Determinar si la respuesta inmune inducida en piel, depende de
las migración de las CD de la piel al ganglio linfático drenantes.
16
MATERIALES Y METODOS
Ratones
Se utilizaron ratones 3A9 (I-Ak) TCR transgénicos, cuyos TCR, en
linfocitos T CD4+, son especificos para el péptido 46-61 de lisozima (HEL). Se
realizaron cruzas heterocigotas con ratones B10BR (I-Ak) y se seleccionaron
con I-Ad y Vβ 8.2 por citometría de flujo a partir de linfocitos en sangre
periferica.
También se utilizaron ratones DO11.10 (I-Ad) transgénicos, que
expresan en linfocitos T CD4+ el receptor Tαβ específico para Ovoalbúmina de
Gallina (OVA), estos ratones fueron donados amablemente por el Dr. Ignacio
Terrazas (ENEP Iztacala). Además, ratones Balb/c (I-Ad) y ratones C57/BL6 (IAb) que fueron proporcionados por el Bioterio de la Unidad de Medicina
Experimental de la Facultad de Medicina de la UNAM, ubicado dentro de las
instalaciones del Hospital General de México. Todos los ratones utilizados en
los experimentos, fueron de 8-10 semanas de edad y usados de acuerdo a los
lineamientos del Comité de Ética Institucional para el cuidado de animales de
experimentación
Reactivos
Los anticuerpos anti CD4 PE, anti CD4 APC, anti CD11c APC, anti
CD11c PE, anti I-Ab PE, anti IL-17 PE, anti IFN-γ PE, anti CD86 PE, anti B7-H1
PE, anti CD40 PE, STV-APC, así como el kit de CBAs para citocinas Th1/Th2
de ratón y el Flex set IL-17 e IL-10 de ratón, son de origen comercial
Pharmingen-BD Biosciences®. Los sobrenadantes de anticuerpos anti CD8
(TIB105), anti B220 (RA3-6B2), Anti F4/80 (F4/80), anti I-Ab (TIB-120), fueron
producidos en el laboratorio a partir de hibridomas obtenidos de ATCC.
Anticuerpos anti I-Ak (H116.32) Biotina, anti TCR Vβ8.2 (F23.1) Biotina, anti
MHC-II (NIM-R4) Alexa 488, anti DEC-205 biotina (NLDC-45), anti CD40
(IC10), fueron producidos, purificados y marcados en el laboratorio.
17
Lisozima y la subunidad B de toxina de cólera
fueron de
Sigma-
Aldrich®, toxina de cólera de Chalbiochem ®, Poli I:C de Amersham
Biosciences ®, Brefeldin-A de Roche ®, MACS anti CD11c de ratón de Miltenyi
Bistec ® y CFSE de Fluka®, anti IgG rata.
Enriquecimiento de linfocitos T CD4+
De ratones 3A9 y DO11, se extrajo bazo y ganglios, los cuales fueron
macerados hasta obtener una suspensión celular uniforme. Estas células se
incubaron con una mezcla de anticuerpos que contenían: anti CD8, anti B220,
anti F4/80, anti MHC-II y anti CD11c y CD11b, en una cantidad de 2x107
células/ml durante 30 minutos a 4 °C. Posteriormente se colectaron las células
y después de los lavados correspondientes, se colocaron en placas p100
cubiertas con anti IgG en una proporción de 4x107 células/placa, resuspendidas
en 5 ml de medio RPMI suplementado durante 30 minutos a 37°C. Pasado este
tiempo, se recuperaron las células no adheridas, se cuantificaron y se
determinó su pureza.
Marcaje y transferencia de linfocitos T CD4+
Para determinar proliferación, los linfocitos T CD4+ enriquecidos se
marcaron añadiendo 1 μL de CFSE 5 mM por cada 107 células y se incubó
durante 10 minutos a 37 °C. Concluido este tiempo, se añadió suero fetal
bovino en igual volumen al que estaban las células resuspendidas. Después de
los lavados correspondientes, las células se resuspendieron en PBS en un
volumen final de 5x107 células/ml.
5x106 linfocitos CD4+ purificados de ratones 3A9 o DO11 fueron
transferidos en un volumen de 100μl vía i.v., a ratones B10BR y Balb/c
respectivamente.
18
Inmunización
Después de 24 horas, los ratones B10BR y Balb/c transferidos, fueron
inmunizados vía intradérmica en la oreja del ratón, de acuerdo a las
condiciones experimentales establecidas, utilizando: Lisozima (LG) 0.3, 1, 3 y
10 μg, Ovoalbúmina (OVA) 1 μg, toxina de cólera (TC) 1μg, subunidad de
toxina de cólera (BTC) 1 μg, Poli I:C 1 μg, anti CD40 2μg y LPS 1μg. Después
de 72 horas de administrado el antígeno solo o en combinación con alguno de
los adyuvantes, se obtuvieron los ganglios drenantes a la oreja del ratón, y así
los ganglios distales al mismo. Estos ganglios se trabajaron individualmente,
obteniendo una suspensión celular, enriqueciendo linfocitos CD4+ mediante la
panning y colocando en cocultivo.
Alternativamente a la vía de inoculación intradérmica en la oreja del
ratón, se utilizó la vía subcutánea en cojinete plantar y la vía intraperitoneal
cuando el experimento así lo requirió.
Co-cultivo
Un día antes de obtener los ganglios, se extrajo bazo, ganglios
cervicales, axilares, braquiales, inguinales y poplíteos de ratones B10BR o
Balb/c en medio Hanks con Ca+ y Mg+, y se añadió colagenasa D, perfundiendo
los órganos en un principio y posteriormente disgregando el tejido durante 30
minutos a 37 °C. Después de la lisis y cuantificado el número de células totales,
éstas se incubaron por 30 minutos con perlas magnéticas CD11c+ a 4 °C,
obteniendo por selección positiva células dendríticas, las cuales se fueron
resuspendidas en 1x106 células/ml de medio RPMI suplementado y colocando
100μl en placas de 96 pozos y 1 ml en placas de 12 pozos. La mitad de estos
pozos fueron marcados como re-estímulación y se agrego lisozima en una
cantidad de 10 μg/ml.
19
Pasadas 18 horas, las células totales y CD4+ de los ratones transferidos
e inmunizados, se colocaron en cocultivo con las CD CD11c+ con y sin LG u
OVA según fuera el caso, en una proporción de 3:1. Después de 12 horas de
incubación a 37 °C en 5% de CO2 se colectaron los sobrenadantes de cada
condición y se congelaron a -20 °C para la determinación de citocinas.
Determinación de citocinas
Citocinas en secreción
Para determinar las citocinas secretadas en los sobrenadantes del
cocultivo, se utilizó el kit de CBAs Th1/Th2 y el Flex set para IL-10 e IL-17 de
acuerdo al procedimiento establecido por BD para el tratamiento de las
muestras y analizadas mediante FACS Calibur BD y Flow Jo.
Tinción intracelular
Para determinar los marcadores externos celulares, se bloqueó
inespecíficamente a las células, incubando por 20 minutos con suero de caballo
al 2% a 4 °C, posteriormente se administró αCD4 y Vβ 8.2, incubando
nuevamente por 20 minutos a 4 °C, y lavando 3 veces más con FACS buffer.
Para determinar las citocinas intracelulares, en el último lavado se
añadió perm/wash resuspendiendo y lavando inmediatamente las células,
posteriormente se añadió citofix/citoperm, dejando incubar durante 20 minutos
a 4°C. Finalmente se añadió αIFN-γ APC e αIL-17 e incubamos bajo las
condiciones indicadas con anterioridad. El analisis se realizó en FACS CAlibur
BD y el Flor Jo.
20
Inmunofluorescencia
Ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+ fueron inoculados con
PBS, HEL, o una mezcla de HEL+CT y HEL+CTB, HEL+ Poli I:C, HEL+ αCD40
y HEL+Poli I:C/αCD40 vía i.d. en la oreja del ratón, después de 6, 12, 18, 24,
48 y 72 horas, los ratones fueron sacrificados y las orejas depiladas antes de
su escisión. Las orejas se colocaron en placas con EDTA 0.5M durante 2 horas
a 37 °C, continuando con 2 horas más en PBS bajo condiciones similares.
Concluida la incubación, la epidermis se separó de la dermis mecánicamente y
se fijo y permeabilizó en acetona a -20 °C por 20 minutos. Posteriormente las
láminas epidérmicas fueron reconstituidas en PBS y bloquedas por 2 horas con
suero de caballo al 2%. Después de los lavados, se añadieron los anticuerpos
αMHC-II Alexa 488, αCD86 PE, αCD40 PE a los pozos correspondientes y se
dejó incubando toda la noche a 4 °C. Las láminas fueron lavadas con PBS
minuciosamente y montadas en vectashild para su observación en el
microscopio confocal Carl Zeiss.
21
RESULTADOS
A. Proliferación de linfocitos T CD4+
El primer objetivo fue determinar la dosis de LG adecuada, para inducir
presentación de antígeno y proliferación de linfocitos T antígeno específicos en
el modelo murino de inoculación en piel. Para esto se enriquecieron linfocitos
T CD4+ específicos para LG de ratones 3A9 transgénicos (I-Ak) y se marcaron
con CFSE para transferirlos a ratones B10BR (I-Ak), con la finalidad de que un
porcentaje importante de linfocitos T CD4+ correspondieran al TCR
transgénico, lo que permitiría su seguimiento, pero al mismo tiempo, tener un
repertorio diverso de linfocitos T.
Primeramente, enriquecimos linfocitos T CD4+ de ratones 3A9,
mediante panning, obteniendo una pureza del 95%. Estas células fueron
marcadas con CFSE y transferidas a ratones B10BR vía i.v. en una volumen de
100 μl, 5x106 células/ratón. Al día siguiente, se administró vía intradérmica en
la oreja del ratón, PBS y LG, esta última en dosis de 0.3, 1, 3 y 10 μg y
después de 72 horas se obtuvieron los ganglios linfáticos de drenaje (GLd),
cervicales y distales para determinar por citometría de flujo, la dilución de la
CFSE que correlaciona con la división de los linfocitos T.
Vβ
a) 8.2
PBS
11 %
0.3 μg
76 %
1 μg
3 μg
91%
93 %
10 μg
97 %
CFSE
Figura 5. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ con diferentes dosis de antígeno vía
intradérmica en oreja. Se transfirieron 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con
CFSE a B10BR vía i.v. 24 horas después se inoculó por vía intradérmica en la oreja 0.3,1, 3 y
10 μg/ml de LG. Células CD4+ CFSE+ Vβ 8.2+ en el nódulo linfático de drenaje 3 días después
de inmunizado el ratón. Los diagramas de puntos e histogramas son representativos de al
menos 2 experimentos independientes.
22
En la figura 5, se puede observar que a partir de la administración de
dosis muy bajas de antígeno (0.3μg), se logra inducir una tasa de proliferación
de linfocitos T CD4+ Vβ+ 8.2. La administración de PBS induce un basal de
proliferación, pero sin hacerse evidentes los ciclos del mismo. En cambio,
desde la administración de 0.3 μg y hasta 10 μg dichos ciclos de proliferación
son detectados, y el número de células en las últimas rondas de proliferación,
aumenta de manera proporcional a la dosis administrada.
De tal forma que la administración de 0.3 μg de LG, indujo una
proliferación del 76% de las células CFSE+ Vβ8.2 que al menos se dividieron
una vez.
Para 1μg de LG, la proliferación resultante fue del 91%, donde
observamos células con un mayor número de divisiones.
Después de la
administración de 3 y 10 μg de LG se observan un 93 y 97% de células en
división respectivamente. Con 10μg de antígeno (LG) se obtiene prácticamente
el máximo de proliferación.
0.3
μg
1 μg
3 μg
10μ
g
Distal
Cervical
Drenante
PBS
CFSE
Figura 6. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios linfáticos. Se
transfirieron 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con CFSE a B10BR vía i.v. 24
horas después se inoculó por vía i.d. 0.3, 1, 3 y 10 μg/ml de LG. Proliferación de linfocitos T
CD4+ CFSE+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios linfáticos, cuando se administran dosis crecientes
de LG. Los diagramas de puntos e histogramas son representativos de al menos 2
experimentos independientes.
23
Cuando se analizo la proliferación de los linfocitos T LG específicos en
los GLd al sitio de inoculación en comparación con el resto de los ganglios
(figura 6), observamos que en los primeros, la proliferación es mayor en todas
las dosis administradas y que las células se encuentran principalmente en los
últimos ciclos de proliferación, a diferencia los otros ganglios, en donde la
mayoría de células se encuentran en los primeros ciclos de proliferación. De
manera importante, las células que proliferan son escasas en el resto de los
ganglios cuando se administran bajas dosis de antígeno comparado con lo
observado en los GLd.
Estos resultados indican que la vía de inoculación i.d. de bajas dosis de
LG en la oreja del ratón, es eficiente para inducir proliferación de linfocitos T
antígeno específicos y esta parece estar restringida a los ganglios que drenan
el sitio de inoculación.
B. Efecto adyuvante en la proliferación de linfocitos T CD4+ antígeno
específicos.
Una vez determinada la dosis de LG adecuada para la presentación de
antígeno y proliferación de los linfocitos T antígeno específicos, decidimos
evaluar el efecto que podría inducir la administración de distintos adyuvantes
en conjunto con el antígeno, en la proliferación de linfocitos T CD4+.
Para determinar este efecto, se enriquecieron nuevamente linfocitos T
CD4+, y se marcaron con CFSE. Se transfirieron 5x106 células a ratones
B10BR. Después de 18 horas, se administro PBS, LG, LG+LPS y LG+CT vía
intradérmica en la oreja del ratón y 72 horas después, se obtuvieron los
ganglios drenantes y distales para determinar la dilución de CFSE por
citometría de flujo (figura 7).
24
TC
LPS
LG
PBS
Figura 7. Proliferación de linfocitos T CD4+ en ganglios linfáticos cuando se administran
diferentes adyuvantes. Transferimos 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con
CFSE a B10BR vía i.v. y 24 horas después, fueron inmunizados vía intradérmica con 1μg de
LG, LG+LPS o LG+TC. 72 horas después se colecta el ganglio drenante y distal y se determina
la proliferación de células CD4+ CFSE+, Vβ 8.2+. Los histogramas son representativos de al
menos 2 experimentos independientes.
Cuando administramos LG mezclada con los distintos adyuvantes ya sea
LPS o TC por vía i.d en la oreja, observamos que la mayoría de las células
CD4+ CFSE+ Vβ8.2 obtenidas de el GLd, se encuentran en los últimos ciclos
de proliferación comparado con la administración de LG sola. Este no es el
caso para las células que se encuentran en los ganglios distales, ya que LG
sola mostró más células proliferantes que LPS y TC. De manera importante
este último se observan prácticamente la mayoría de células CFSE+ sin
proliferar.
Estos resultados indican que la co-administración de LG y un adjuvante
impacta en la proliferación de los linfocitos T específicos y esto se observa
solamente en los GLd al sitio de inoculación.
C.
Expresión de MHC-II, CD86 y CD40 en células de Langerhans de
ratones B10BR transferidos.
Una vez que determinamos incremento de proliferación por el efecto
adyuvante en el GLd, se determinó in situ en la piel del ratón, las diferencias
que existen en CL, cuando administramos el antígeno solo o en conjunto con
distintos adyuvantes.
25
Una vez transferidos linfocitos T CD4+ CFSE+ de ratones 3A9 a ratones
B10BR en mismo número que en experimentos anteriores. Se administró 18
horas después PBS, LG, y LGL en combinación con TC, Poli I:C, αCD40 y una
mezcla de Poli I:C/αCD40. Después de 24 horas, se obtuvieron las orejas de
los ratones inoculados, las cuales fueron tratadas con EDTA 0.5M.
Posteriormente se aislaron las láminas epidérmicas y se
determino la
expresión y distribución de MHC-II (3a) CD40 (3b) y CD86 (3c) por
inmunofluorescencia.
PBS
Poly I:C
LG
TC
αCD40
Poli I:C/
αCD40
Figura 8. Expresión y distribución de MHC-II en células de Langerhans de ratones B10BR
transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos y
transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después de 24 horas
son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, HEL 1μg, CT 1μg, Poli I:C 1 μg αCD40
2μg y una mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las
orejas tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de
separar la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con
MHC-II Alexa 488, para determinar la distribución de esta molécula. La observación se realiza
a 40X. A) y C) 100X, en un microscopio confocal Carls Zeiss. Las imágenes que se muestran
son representativas de al menos 3 experimentos independientes.
26
En la figura 8, podemos observar imágenes de CL en la epidermis de
ratones inoculados con diferentes adyuvantes. La administración de PBS y LG
muestran una expresión de MHC-II muy semejante entre sí, con una
distribución uniforme en las células. De manera importante, cuando se
administra TC la distribución de MHC II se localiza principalmente en el centro
de la célula y prácticamente, no se observan las dendritas. Después de la
administración de Poli I:C, se observa expresión de MHC-II en toda la célula,
tanto en cuerpo como en dendritas, pero con mayor abundancia en el primero.
Tanto en los ratones administrados con αCD40, como la mezcla de éste con
Poli I:C, mostraron una distribución distinta a la TC, ya que la molécula de
MHC-II se expresa en toda la célula, pero principalmente en las dendritas, que
se perciben de mayor tamaño.
Además de los cambios observados en la distribución de MHC-II de
cada condición, se determinó la expresión de CD86 y CD40 en las láminas
epidérmicas. En la figura 9, se observa que en los casos donde administramos
PBS y LG, no se expresa la molécula CD40 a diferencia de cuando se
administra TC, en donde se observa CD40 colocalizando con MHC-II en el
centro de la célula. La expresión de CD40, también se pudo observar con la
administración conjunta de Poli I:C/αCD40 colocalizando con MHC-II en áreas
centrales de las células.
Cuando se evaluó la expresión de CD86 (figura 10), no se observó
expresión de esta molécula al administrar PBS o LG. En el caso de TC, la
molécula de CD86, co-localiza nuevamente en el centro de la célula con MHCII. Poli I:C/αCD40, induce la expresión de CD86 en toda la célula, aunque en
menor intensidad que la TC.
27
MHC-II
CD40
COMBINACIÓN
PBS
LG
TC
Poli I:C
/αCD40
8. Expresión y distribución de MHC-II y CD40 en células de Langerhans de ratones
B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son
enriquecidos y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después
de 24 horas son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, LG 1μg, TC 1μg y una
mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las orejas
tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de separar
la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con MHC-II
Alexa 488 y CD86. La observación se realiza a 40X, en un microscopio confocal Carl Zeiss.
Las imágenes que se muestran son representativas de al menos 3 experimentos
independientes.
28
MHC-II
CD86
COMBINACIÓN
PBS
LG
TC
Poly I:C/
CD40
Figura 10. Expresión y distribución de MHC-II y CD86 en células de Langerhans de
ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son
enriquecidos y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después
spués
de 24 horas son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, LG 1μg, TC 1μg y una
mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las orejas
tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de separar
la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con MHC-II
Alexa 488 y CD86 PE. La observación se realiza a 100X, en un microscopio confocal Carl
Zeiss. Las imágenes que se muestran son representativas de al menos 3 experimentos
independientes.
29
Estos resultados indican que la administración de LG en combinación
con los distintos adyuvantes y en particular con la TC induce activación de las
células dendríticas de la piel a diferencia de la LG sola en la que no se perturba
el fenotipo basal de las células dendríticas de la piel.
D. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 + de ratones
B10BR transferidos.
Posteriormente, se evaluó si el impacto en la proliferación de las células
T LG específicas y la activación de las CL observada de acuerdo al adyuvante
utilizado, podían ser determinantes, en el tipo de respuesta inmune inducida.
Utilizando el modelo descrito, se enriquecieron y se transfirieron
linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 específicos para LG a ratones B10BR.
Después de 24 horas se administró por vía i.d. en la oreja PBS, LG, LG+TC,
LG+Poli I:C y LG+Poli I:C/αCD40. Después de 72 horas, se obtuvieron los GLd
y se purificaron linfocitos T CD4+ por panning, colocándolos en co-cultivo con
CD de ratones B10BR previamente incubadas con LG 18 horas antes. Después
de 12 horas de cultivo se colectó el sobrenadante y se determinaron las
citocinas en los sobrenadantes de cultivo por CBAs.
En la figura 11, podemos observar en barras blancas, que en los
sobrenadantes de los co-cultivos de linfocitos T CD4+ con células dendríticas
CD11c+ sin LG,
prácticamente no se observa ninguna de las citocinas
evaluadas ya que los valores son inferiores a 20 pg/ml (límite de detección del
ensayo), a excepción de TNF-α para el que se detectaron valores de 50 a 100
pg en las distintas condiciones, y particularmente en el caso de la inmunización
del antígeno con la mezcla Poli I:C/αCD40, se observaron valores de 300 pg/ml
cuando los linfocitos T fueron re-estimulados in vitro con CD en ausencia de
antígeno.
30
a)
b)
IL-2
4000
500
***
400
***
300
200
**
***
***
3000
pg/mL
pg/mL
Sin re-estímulo
Re-estimulado
IFN-γ
2000
***
1000
100
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
aC
D Po CT
40 ly
/P I :
ol C
y
I:C
PB
S
H
EL
aC
D Po CT
40 ly
/P I :
ol C
y
I:C
PB
S
H
EL
IL-17
f)
c)
150
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
0
0
TNF-α
500
400
pg/mL
***
50
pg/mL
***
100
***
300
200
100
0
8
6
6
S
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
0
PB
0
PB
2
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
2
S
EL
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
4
H
pg/mL
8
4
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
IL-5
10
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
pg/mL
PB
S
H
EL
aC
D Po C
40 l T
/P y I
ol :C
y
I:C
e)
IL-4
10
aC
d)
H
D Po CT
40 ly
/P I:
ol C
y
I:C
PB
S
H
EL
aC
aC
PB
S
H
EL
D Po CT
4 0 ly
/ P I:
ol C
y
I: C
0
+
Figura 11. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 de ratones B10BR
+
transferidos. Linfocitos T CD4 de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y
transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administró a
diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, Poli I:C 1μg o Poli I.C/αCD40
1μg/2μg respectivamente. 72 horas después, se obtienen los linfocitos T CD4+ de los
ganglios drenantes y se cocultivan con células dendríticas CD11c+ solas o cargadas
con LG 1μg en los pozos, en proporción 3:1. Después de 12 horas de estimulación se
colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. La media y
desviación estandar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3.
31
Las barras negras, muestran las citocinas producidas en el co-cultivo de
linfocitos T CD4+ provenientes de ratones inoculados con diferentes
condiciones experimentales y co-cultivados con CD CD11c+ en presencia de
LG.
Se puede observar
que la producción de distintas citocinas es nula
cuando los linfocitos T provienen de ratones inoculados con PBS o LG. En
contraste cuando los ratones fueron inmunizados con LG en combinación con
TC o con una mezcla de Poli I:C/aCD40 se obtiene una expresión significativa
tanto de IL-2 como de TNF-γ.
La citocina que se expresó en mayor cantidad en los ratones
inmunizados con LG en combinación con TC fue IFN-γ. Se observó también
una expresión significativa de esta citocina en ratones inmunizados con TC y la
mezcla de Poli I:C/αCD40. La expresión de IFN-γ fue mayor es las condiciones
mencionadas comparada con la expresión por la inoculación de LG y Poli I:C.
Tomando en cuenta que la TC es un adjuvante que predominantemente
induce repuesta celular tipo Th2 en mucosas, se evaluaron los sobrenadantes
de cultivo para determinar citocinas del tipo Th2. Como se puede observar en
la figura 11D y 11F no se detectaron valores por encima del nivel de detección
del ensayo para IL-4 e IL-5. De manera importante en los sobrenadante de cocultivo de linfocitos T CD4+ y CD incubadas con LG se observó expresión de
IL-17 con valores de100 pg/mL en el caso de los ratones inmunizados con TC y
Poli I:C/aCD40.
Estos datos indican que la administración de LG por vía i.d. en la oreja,
induce proliferación de linfocitos T CD4+ específicos para LG pero no es
suficiente para inducir secreción de citocinas en los ratones B10BR
transferidos. En contraste, la administración de LG con TC induce la expresión
de citocinas Th1/Th17. El mismo resultado se obtuvo al utilizar como adjuvante
la mezcla de Poli I:C/aCD40 sugiriendo que la inoculación i.d en oreja se
traduce en la inducción de una respuesta con citocinas tipo Th1/Th7 sobre Th2.
32
E. Determinación de citocinas Th1/Th2/Th17 en ratones Balb/c.
De acuerdo al perfil de citocinas obtenido en ratones B10BR transferidos
e immunizados con LG en combinación con TC, decidimos determinar las
citocinas secretadas en ratones Balb/c bajo el mismo esquema de
immunización, ya que este fondo genético ha sido reportado para establecer
perfiles Th1/Th2.
Al igual que el modelo murino de 3A9-B10BR, Los ratones Balb/c fueron
transferidos vía i.v. con 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones DO11.10 TCR
específicos para OVA. La pureza de los linfocitos T CD4+ fue del 95%. Al día
siguiente, se administraron vía i.d., PBS, OVA y OVA+TC y 72 horas después,
obtuvimos las células del ganglio drenante. Estas células se co-cultivaron con
CD de ratones Balb/c incubadas con OVA 18 horas antes. Después de 12
horas, se colectaron los sobrenadantes y se determinaron las citocinas en los
sobrenadantes de cultivo por CBAs.
Los linfocitos T de los ratones Balb/c transferidos con linfocitos T CD4+
específicos para ovoalbúmina, no secretan IL-2 e IFN-γ cuando se administra
PBS u OVA. En contraste y similar a lo obtenido con los ratones B10.BR los
ratones Balb/c transferidos e inmunizados con OVA en combinación con TC
expresan cantidades significativas de IL-2 e interesantemente de IFN-γ, (figura
12 b).
Se obtuvo expresión de TNF-α en todas las condiciones evaluadas
siendo significativamente mayor en los linfocitos T CD4+ de los ratones
inmunizados con OVA y TC. Sorprendentemente aunque se obtuvieron
diferencias significativas en la producción de IL-4 e IL-5 en los ratones
inmunizados con OVA y TC, los valores son inferiores a los niveles detectados
por el ensayo. AL igual que en los ratones B10.BR transferidos, se obtuvo una
expresión importante de IL-17 en los ratones Balb/c transferidos inmunizados
con OVA y TC (Figura 12f).
33
b)
IL-2
2000
400
pg/mL
O
C
T
PB
C
T
O
VA
PB
S
O
VA
PB
S
C
T
d)
TNF-α
VA
0
S
0
O
500
PB
100
C
T
1000
S
pg/mL
200
***
1500
***
300
c)
Sin reestimular
Re-estimulado
IFN-γ
VA
a)
IL-4
10
1500
8
***
pg/mL
pg/mL
1000
6
**
4
500
2
f)
IL-5
C
T
O
VA
PB
S
IL-17
250
***
200
T
PB
S
O
VA
T
C
O
VA
C
PB
S
0
T
0
O
VA
50
PB
S
2
T
100
C
***
VA
4
150
O
6
PB
S
pg/mL
8
C
10
pg/mL
C
T
PB
S
C
T
VA
O
PB
S
C
T
VA
O
PB
S
e)
O
VA
0
0
Figura 12. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de ratones Balb/c
transferidos. Linfocitos T CD4+ de ratones DO11 específicos para Ovoalbúmina, son
enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones Balb/c en 5x106 células/ratón.
Después de 24 horas se administra a diferentes grupos:PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC
1μg y 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes, los
cuales se cocultivan con células dendríticas CD11c+ de ratones Balb/c que fueron
cargadas o no con OVA 1μg en los pozos correspondientes, con una proporción de 3:1.
Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la
expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estandar se calcularon a
partir de 3 experimentos independientes n=3.
34
Con estos resultados, es posible establecer que la inmunización i.d. en
la oreja, de dos diferentes antígenos, en dos diferentes fondos genéticos en
combinación con TC, induce expresión de citocinas con un perfil Th1/Th17.
F. Expresión de citocinas después de la inmunización por diferentes
vías de inoculación.
Una vez establecido el perfil de citocinas expresado por los linfocitos T
CD4+ específicos provenientes de ratones inmunizados con LG u OVA en
combinación con TC y otros adyuvantes, fue importante determinar si la
respuesta inducida por la inmunización en piel (oreja) era similar a la inducida
por otras vías de inoculación.
Para esto, nuevamente se transfirieron linfocitos T CD4+ de ratones 3A9
y 24 horas después, se administró PBS, LG y LG+TC por 3 vías de inoculación:
vía intradérmica en la oreja del ratón, vía subcutánea en cojinete plantar y vía
intraperitoneal. La administración de LG se hizo inicialmente con 0.3μg de LG
con y sin TC (figura 13). Posteriormente se utilizó 1μg de LG (figura 14 y 15),
tres días después de la inoculación se obtuvieron los GLd al sitio de inocuación
y se purificaron linfocitos T CD4+, que fueron co-cultivados con CD
previamente incubadas con LG.
Como se puede observar en la figura 13, la sola administración de 0.3 μg
de LG por vía intradérmica, es suficiente para inducir proliferación del 55% de
los lifocitos T específicos. No ocurre así, cuando el antígeno es inoculado por
vía subcutánea o intraperitoneal, en los que se obtienen porcentajes de
linfocitos T en proliferación de 18% y 16% respectivamente. A pesar de que la
inoculación de 0.3μg de antígeno con TC, incrementa la proliferación en todas
las vías, solo se observan las últimas rondas de proliferación cuando se inocula
por vía intradérmica. La administración de 3 μg de LG, induce una proliferación
similar en todas las vías de incolulación.
35
0 3 μg + TC
0.3 μg
a)
3 μg
16%
43%
94%
18%
39%
93%
55%
86%
94%
3%
3%
3%
i.p.
s.c.
i.d.
PBS
CFSE
Figura 13. Proliferación de linfocitos T CD4+ cuando se administra el antígeno en
diferentes vías de inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante
panning y transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se
administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes
vías. Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal.
72 horas después se obtienen linfocitos T CD4+ para determinar proliferación por
citometría de flujo con CD4+ Vβ8.2+. Los datos mostrados, son representativos de al
menos 3 experimentos independientes.
De acuerdo con lo anterior, decidimos administrar 1 μg de LG en las
distintas vías de inoculación en combinación con TC para determinar si hay
diferencias en la secreción de citocinas.
LG
TC
i.p.
s.c.
i.d.
PBS
Figura 14. Proliferación de linfocitos T CD4+ con 1 μg de LG en diferentes vías de
inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y
transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a
diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes vías.
Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal. 72
horas después se obtienen linfocitos T CD4+ de GLd y se determina proliferación
mediante dilución de CFSE. Los datos mostrados, son representativos de al menos 3
experimentos independientes.
36
En la figura 14, se puede observar la proliferación cuando se administra
1 μg de antígeno solo o mezclado con TC la cual es similar para la
inmunización i.d. en oreja e i.p. y ligeramente menor en el caso de la
inoculación subcutanea. El adyuvante incrementó en todos los casos el
porcentaje de células en los últimos ciclos de división.
Interesantemente, cuando determinamos, que citocinas se expresaban,
estas solamente fueron detectadas por la inoculación vía i.d. en la oreja, no así,
en vía subcutánea e intraperitoneal a pesar de la proliferación celular
observada.
IL-2
IFN
200
600
400
pg/mL
100
200
50
C
T
i.p
.
EL
C
T
H
i.p
.
s.
c.
EL
H
C
T
s.
c.
i.d
.
H
EL
i.p
.C
T
s.
c.
C
T
i.p
.H
EL
s.
c.
H
EL
0
i.d
.C
T
i.d
.H
EL
0
i.d
.
pg/mL
150
TNF
400
pg/mL
300
200
100
i.p
.C
T
s.
c.
C
T
i.p
.H
EL
s.
c.
H
EL
i.d
.C
T
i.d
.H
EL
0
Figura 15. Expresión de citocinas cuando se administra el antígeno en diferentes vías de
inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y
transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a
diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes vías.
Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal. 72
horas después se obtienen linfocitos T CD4+ de los GLd y se co-cultivan con células
dendríticas CD11c+ que fueron cargadas con LG 1μg, en una proporción de 3:1. Después
de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de
citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir de 3
experimentos independientes n=3.
37
La expresión de IL-2 e IFN-γ, fueron detectadas después de la
inmunización con LG+TC. Para el caso de TNF-a, encontramos nuevamente
concentraciones altas en todas las vías administradas aunque la mayor
expresión se determino después de la inoculación i.d. en la oreja.
Lo anterior sugiere, que la inoculación por vía intradérmica en la oreja
del ratón, es más eficiente para inducir respuesta inmune con bajas dosis de
antígeno, comparada con otras vías de inoculación.
G. Efecto adyuvante de Subunidad B de TC.
Debido a que la administración de TC induce una fuerte inflamación en
la oreja del ratón cuando se administra vía i.d., decidimos determinar si la
subunidad B de toxina de cólera (BTC) -que es la fracción no tóxica- produce
los mismos efectos adjuvantes que la toxina completa.
Para esta determinación se utilizo el modelo B10BR-3A9, transfiriendo
5x106 células/ratón. Después de 24 horas, se administro LG+TC y LG+ BTC al
grupo de ratones correspondientes, pasadas 6, 12 y 18 horas, se sacrificaron
los ratones y se obtuvieron las láminas epidérmicas de los sitios inoculados
para análisis de MHC-II y CD86 en células de Langerhans, mediante
inmunofluorescencia (figura 16).
Pasadas 72 horas obtuvimos linfocitos T
CD4+ del ganglio drenante y se colocaron en co-cultivo con CD previamente
incubadas con LG 18 horas antes. Después de 12 horas de re-estimulación se
tomaron los sobrenadantes para determinar citocinas por CBAs (figura 17).
38
TC
A)
BTC
6h
12h
18h
Figura 16. Cinética de distribución de MHC-II y CD86 en TC y BTC. Se transfieren 5 x106
linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, a ratones B10BR células/ratón. Después de 24 horas se
administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, o con BTC 1μg.
Después de 6 12 y 18 horas se obtienen las láminas epidérmicas y se determina la
expresión y distribución de MHC-II y CD86 por inmunofluorescencia. Los datos
mostrados son representativos de al menos 3 experimentos independientes.
En la figura 16, podemos observar las diferencias en inflamación del sitio
de inoculación en la oreja cuando se administra TC comparado con la BTC.
Cuando se evaluaron las células de Langerhans en las láminas
epidérmicas se observó a las 6 horas después de la inoculación, que no
existían diferencias importantes en la distribución de MHC-II en los ratones
administrados TC o BTC. La expresión de CD86 es baja. A las 12 horas la
distribución de MHC-II permanece sin cambios evidentes, pero la expresión de
CD86 aumenta en TC.
A las 18 horas de administrado el estímulo, la
39
distribución de MHC-II se incrementa con TC, localizándose particularmente en
el centro de las células y de manera importante no hay expresión de esta
molécula en las dendrítas, dando un aspecto esférico. Para BTC no hay
variaciones en la distribución de MHC-II, incluso a tiempos mayores. La
expresión de CD86 se incrementa ligeramente a 18 horas en ambas
condiciones.
Interesantemente, la inoculación del antígeno en combinación con BTC
induce tanto la proliferación de los linfocitos T específicos para LG, como la
expresión de citocinas.
La producción de TNF-α e IFN-γ
fue similar
comparada con la inmunización de LG y la TC completa. Importantemente, en
el caso de IL-17 se detectaron concentraciones mayores para BTC de 400
pg/ml, a diferencia de la toxina completa que dio valores de 150 pg/ml.
IL-2
TNF-α
600
400
***
Sin re- estímulo
***
Re estimulado
***
300
***
pg/mL
pg/mL
400
200
200
100
C
T
C
TB
PB
S
H
EL
PB
S
H
EL
C
T
C
TB
PB
S
H
EL
PB
S
H
EL
C
T
C
TB
IL-17
IFN-γ
800
PB
S
H
EL
C
T
C
TB
0
PB
S
H
EL
0
C
T
C
TB
200
PB
S
H
EL
1000
C
T
C
TB
400
PB
S
H
EL
pg/mL
2000
*
600
*** ***
3000
C
T
C
TB
4000
pg/mL
C
T
C
TB
0
0
Figura 17. Importancia de BTC en la inducción de respuesta inmune. Se transfieren 5 x106
linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, a ratones B10BR células/ratón. Después de 24 horas se
administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, o con BTC 1μg.
Después de 72 horas se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes y se
co-cultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas o no, con LG 1μg en una
proporción de 3:1. Pasadas 12 horas, se colecta el sobrenadante y se determina la
expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir
de 3 experimentos independientes n=3.
40
Estos resultados, sugieren que la BTC es capaz de inducir un efecto
adjuvante similar a la de la toxina completa al ser co-administrada con LG por
via i.d. en la oreja sin causar daño e inflamación al tejido.
H. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de la
respuesta inmune efectora después de la inmunización en piel.
Una vez determinado que la vía de inmunización i.d en la oreja del ratón
es más eficiente que el resto de las vías utilizadas, quisimos saber, la
importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de la respuesta
inmune efectora de tipo Th1/Th17.
Para esto, se enriquecieron linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, marcados
con CFSE y se transfirieron 5x106 células/ratón. Después de 24 horas, se
administro por vía i.d en la oreja del ratón PBS, LG, LG+TC y HEL+BTC, 2
horas después quitamos la oreja, y pasados 3 días obtuvimos los linfocitos T
CD4+ del GLd y se determinó en un principio proliferación, y después del cocultivo, producción de citocinas por CBAs y tinción intracelular.
Dejando el sitio
Quitando el sitio
91%
94 %
96 %
85 %
2.5 %
BTC
TC
LG
93%
61%
2.5 %
PBS
Figura 18. Las CD de la piel no son responsables de la proliferación de linfocitos T CD4+.
Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones
B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra PBS, LG
1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos después de administrado el
estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se quita, cauteriza la herida. 72 horas
después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes y se determina
proliferación mediante CD4+ y Vβ 8.2+. Los datos mostrados son representativos de al
menos 3 experimentos independientes.
41
En la figura 18 se puede observar, que la proliferación no se afectó al
quitar la oreja 2 horas después de administrado el antígeno con el adyuvante.
Ya que cuando se administro BTC o TC, el porcentaje de células en
proliferación se mantuvo equivalente, 94% con el sitio de inoculación y 91%
sin el sitio para BTC y de 96% a 93% para TC. En el caso de LG, la
proliferación se afectó considerablemente, ya que disminuyó de 85% a 61%,
por lo que no existen diferencias significativas.
. Interesantemente, cuando determinamos las citocinas expresadas
mediante CBAs y tinción intracelular el resultado fue inesperado, ya que todas
las citocinas se abaten casi por completo cuando se quita el sitio de
inoculación.
a)
250
pg/mL
100
Site intact
0
d)
Site excised
IL-17
***
***
400
60
pg/mL
pg/mL
Site intact
80
500
***
200
40
***
20
100
0
1000
Site excised
TNF-α
300
***
500
50
c)
CTB
CT
HEL
PBS
***
1500
150
0
IFN-γ
2000
*** ***
200
pg/mL
b)
IL-2
0
Site intact
Site excised
Site intact
Site excised
Figura 19. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de respuesta
inmune efectora. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y
transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas
se administra PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos después de
administrado el estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se quita, cauterizando
la herida. 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los GLd y se cocultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas con LG 1μg en una proporción de 3:1.
Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la
expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir
de 3 experimentos independientes n=3.
42
Para IL-2, las concentraciones disminuyeron significativamente de 200
a menos de 50 pg/ml para TC y BTC. Importantemente IFN-γ disminuyo
dramáticamente de 1800 a menos de 50 pg/ml. TNF-α, también sigue el mismo
comportamiento, disminuyendo en ambas condiciones, hasta valores menores
a 20 pg/ml. Finalmente, IL-17 también se abate, pasando de 50 a menos de 10
pg/ml en TC y de 70 a 10 pg/ml en BTC.
PBS
a)
CT
CTB
IFN-γ
Site intact
HEL
Site
exciced
90’
IL-17
D)
Site intact
Site excised
90’
Site excised
24 h
CTB
IL-17
Figura 20. Citocinas intracelulares en linfocitos T después de quitar el sitio de
inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y
transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas
se administra PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos y 24 horas
después de administrado el estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se escinde,
cauterizando la herida. 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de GLd y se
co-cultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas con HEL 1μg en una proporción de
3:1 con Brefeldin-A. Después de 12 horas de estimulación se colectan las células, y se
determina la expresión de citocinas por tinción intracelular. Los datos mostrados son
representativos de al menos 3 experimentos independientes.
43
En cuanto a la expresión de IFN-γ e IL-17 dentro de la propia célula,
corroboramos los datos de obtenidos por CBAs, ya que las células productoras
de IFN-γ pasan de 1.4% a 0.2% disminuyendo casi en su totalidad. Como
puede observarse en la figura 20, los linfocitos T CD4+ a pesar de proliferar no
son capaces de diferenciarse a células productoras de citocinas.
Estos datos indican de manera importante, que las células dendríticas de
la piel son indispensables en la inducción de respuesta inmune efectora
después de la inoculación en piel.
44
Discusión
Las DC tienen una función central en la respuesta inmune, ya que
además de ser consideradas como células vinculantes entre el sistema inmune
innato y el sistema inmune adaptativo, con base en la función de captura,
procesamiento y presentación de antígeno que realizan; también se les ha
considerado la capacidad de polarizar la respuesta de las células T hacia un
fenotipo Th1, Th2 o Th17, de acuerdo a la producción de citocinas, como son
IFN-γ y IL-12, IL-4 y 5 o IL-17 y IL-6 respectivamente (Demangel C, 2004,
Geginat J, 2008).
En esta década, además se le han reconocido otras funciones como la
participación en el control de autoinmunidad y tolerancia, de acuerdo a su
estado
de
maduración,
en
ausencia
de
expresión
de
moléculas
coestimuladoras o por la expresión de moléculas co-inhibidoras en las CD
como lo es B7-H1 o B7-DC que interactúan con la molécula PD-1 en linfocitos
T (Turley S. 2002; Steinman. 2003). Finalmente, también se les ha catalogado
como células con capacidades inmunorreguladoras, cuando se encuentran en
presencia de IL-10 (Yang AS, 2003), o por secreción de TGF-β (Tada Y, 2004).
Importante también es el número de subtipos de CD que se han determinado
así como la distribución particular que tienen en el organismo.
Su localización en la piel, así como ser una de las primeras barreras con
las que se encuentran los patógenos, hace de las CD de la piel, candidatas
importantes en el inicio de una respuesta inmune. Estas células y
particularmente las CL desarrolladas in vitro, son las mejores en inducir
proliferación de linfocitos T (Romani N,1989; Schuler G; 1985).
Por estas
razones, la inmunización en piel, representa una excelente opción para
determinar las características de la respuesta inmune, que puedan ser clave en
el tratamiento y prevención de una multitud de afectaciones que aquejan al ser
humano asi como en el desarrollo de nuevas vacunas.
45
En este trabajo se utilizó el modelo de inoculación intradérmica en la
oreja, en ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+ específicos para
HEL. El hecho de que en este modelo podamos determinar una proliferación
de casi el 80% de células al tercer día de administrado el Ag, con solo 0.3 μg
por vía i.d. es un resultado que hay que destacar, ya que corrobora
primeramente la sensibilidad de la piel a la administración de antígenos,
presumiblemente debido a las CD que la conforman, y la importancia que
tienen en la presentación de antígeno y subsecuente proliferación de linfocitos
T. La administración intradérmica que realizamos en este modelo, utiliza una
cantidad de antígeno menor, comparada con la administración por vía
epicutánea en donde se quita el estrato corneo, en donde se utilizan hasta 100
μg de proteína para inducir dicho estímulo (Strid J, 2004). Esto indica, que la
vía i.d. en la oreja del ratón al parecer, evita la difusión del Ag, concentrándolo
y haciendo más eficiente la captura por las CD de la piel para su posterior
transporte a los glanglios que drenan al sitio de inoculación donde se llevara la
presentación de antígeno, la proliferación de células T y el inicio de una
respuesta inmunológica.
Un dato interesante fue que al utilizar dosis altas de antígeno (1-10 μg)
se observo proliferación sistémica en los diferentes ganglios analizados a
diferencia de dosis bajas, en la que la proliferación es principalmente local.
Este efecto se hace más evidente cuando administramos bajas dosis de
antígeno en conjunto con TC en donde la proliferación se observa
prácticamente solo en los ganglios drenantes al sitio de inyección.
En nuestro estudio, utilizamos adyuvantes que actúan en inmunidad
innata a través de la interacción con TLRs estimulando la producción de
citocinas Th1 como lo es Poli I:C, también utilizamos adyuvantes que se han
establecido como inductores de respuesta Th2 como toxina de cólera, y
anticuerpos que simulan la interacción CD40-CD40L entre los linfocitos T
activados y las CD, como lo es el αCD40 que se ha determinado rompe
tolerancia inmunológica cuando es co-inyectado con el Ag acoplado a DEC205 (Bonifaz L, 2004).
46
Los datos de microscopía confocal nos muestra la distribución que tiene
la molécula MHC clase II en láminas epidérmicas, después de administrado el
antígeno vía i.d en la oreja con los distintos adyuvantes así como la expresión
de CD86 y CD40. Los datos nos muestran que la sola administración de
antígeno no activa las CL, ya que la expresión de MHC-II es equivalente a la
administración de PBS, y la expresión de CD80 y CD40 es prácticamente nula
en esta condición. De manera interesante, las CL modifican por completo el
patrón de expresión de MHC-II, ubicándose solo en el cuerpo de la célula y no
en las dendritas, lo que da un aspecto esférico, también hay expresión de
CD86 y CD40 e importantemente estas dos moléculas colocalizan con MHC-II.
Esta particular expresión de MHC-II con TC, podría ser debida al efecto tóxico
que tiene esta toxina en las células por la trasformación de ATP a AMPc
(Holmgren J. 1981). La mezcla poli I:C/αCD40, también activa las CL. Pero el
patrón de expresión de MHC-II se observa de manera contraria a TC,
localizándose en toda la célula, dando un aspecto de mayor dimensión a la
célula. Al igual que la TC, la expresión de CD86 y CD40 se hacen evidentes,
pero en menor intensidad, y colocalizan también con la molécula de MHC-II en
ciertas regiones de la célula (Figura 2c) esta combinación de adyuvantes al
parecer no es tóxica y estimula importantemente al sistema inmune.
Cuando determinamos, si estas diferencias en la distribución de MHC
clase II y en la expresión de CD80 y CD86 tenían alguna repercusión en la
producción de citocinas por los linfocitos T previamente transferidos,
encontramos que todos los adyuvantes administrados, inducen la expresión de
citocinas con un perfil TH1, pero en diferentes concentraciones. Primeramente
es importante observar que la producción de citocinas es detectada solamente
cuando se aplica un re-estímulo antígeno específico a la célula, es decir, no
existe un basal de estas citocinas en las células cuando se extraen del ganglio.
47
De los adyuvantes administrados, la TC y la mezcla Poli I:C/αCD40
inducen una mayor producción de citocinas, encontrándose IL-2 y TNF-α, IFNγ, este último, en mayor concentración. Tanto IL-4 e IL-5 se encontraron en
valores por debajo del límite de detección. Interesantemente, también se
observo la producción de IL-17, aunque a tiempos más tardíos (24hr) y en
menor concentración que IFN-γ, este dato correlaciona con reportes publicados
en los que se detecta producción de IL-17 con TC dependiente de IL-6 (Lee J,
2009). Sin embargo, también ha sido reportado que TGF-β es importante para
la diferenciación a células T productoras de IL-17 (Mangan, P, 2006) Estos
resultados son diferentes a lo establecido para TC por otras vías de
administración, en donde se ha reportado que induce polarización Th2 o una
mezcla Th1/Th2 (Yamamoto S, 1997; Xu-Amano J, 1993; Simecka JW, 2000;
Marinaro M, 1995). Estos experimentos concuerdan con reportes en los que se
establece respuesta Th1 después de la inmunización en piel. (King, I. 2007;
Hervouet, C.2008).
Aunque la mayoría de estudios que reportan una respuesta inmune Th2
cuando se administra TC por vía nasal u oral, han sido realizados en ratones
Balb/c (I-Ad) (Yamamoto S, 1997; Xu-Amano J, 1993; Simecka JW, 2000;
Marinaro M, 1995), la expresión de citocinas producidas en el modelo
transgénico para OVA DO11-BAlb/c, son equivalentes al modelo 3A9-B10BR
es decir, este tipo de RI tipo Th1 con TC y poli I:C/αCD40 es independiente del
antígeno y del fondo genético utilizado.
Interesantemente, cuando comparamos la vía de inoculación i.d. en la
oreja con las vías subcutánea en cojinete plantar y la vía intraperitoneal, solo la
administración de LG 0.3 μg por vía i.d. pudo inducir proliferación de linfocitos T
en el ganglio de drenaje. A pesar de que la administración de 1 μg de LG +
TC, logró inducir y equiparar las rondas de proliferación en todas las vías de
inoculación, solo la vía intradérmica pudo producir la diferenciación de linfocitos
T a producir citocinas después de la re-estimulación anatígeno específica. Este
proceso puede deberse a la baja cantidad de antígeno administrado, el cual al
inocularse en tejido adiposo o subcutáneo, es suficiente para inducir
48
proliferación, pero no la diferenciación de los linfocitos T. Otra explicación
posible, es que en la oreja la captura del antígeno por las células dendríticas
que migran al nodulo linfatico tiempo después pudo hacer posible una segunda
oleada del antígeno en el ganglio drenante y esto ser determinante en la
diferenciación y producción de citocinas por los linfocitos T. (Sen. D, 2010)
Se ha reportado que existe diferencias en el tipo de respuesta immune
inducida por TC, cuando se administra la subunidad B o A de toxina de cólera,
en donde se afirma que la ATC dirige principalmente una respuesta Th2 a
diferencia de BTC que induce una respuesta Th1(Anjuere F, 2003.) y que esta
respuesta puede ser protectora. (Areas, A. P., 2005). Nuestros resultados
muestran, tipos de respuesta equivalentes cuando se administra CT o la
fracción BTC, en ambos casos se expresaron las citocinas IFN-γ e IL-17. De
manera importante, los efectos de TC y BTC son diferentes. La administración
de TC realiza redistribución de MHC-II que se hace evidente a partir de las 18
horas de aplicado el estímulo, hasta las 48 horas. En el caso de BTC esta
distribución no es evidente en ningún tiempo, y la expresión de CD86, no varía
de una a otra condición. Estos hallazgos son importantes ya que se podría en
un futuro utilizar a BTC no toxica en la inducción de respuesta inmune en piel.
Finalmente como se observa en la figura 8, la inducción de linfocitos T
CD4+ productores de IFN-γ e IL-17, fue dependiente de las CD migrantes de la
piel que llegan en los primeros 90 minutos después de la inmunización. No así,
la proliferación, la cual no se afectó de manera importante. Esto sugiere, que
aunque una parte del antígeno pudo difundir de manera libre a través de los
vasos linfáticos hasta el ganglio drenante de manera independiente del
transporte de las CD de la piel (Sixt M, 2005), esto no fue suficiente para la
inducción de una respuesta inmune eficiente.
La coadministración de TC y BTC, a pesar de incrementar las rondas de
proliferación cuando se administraba con HEL hasta ciclos de diferenciación,
no es suficiente para producir IL-2, TNF-α, IFN-γ e IL-17, las cuales se abaten
prácticamente en su totalidad al quitar el sitio de inoculación a los 90 minutos.
49
Cuando el sitio es retirado 24 horas después de administrar el antígeno,
las citocinas producidas son equivalentes a los ratones en los que no se quitó
el sitio de inoculación, esto puede implicar, que las CD dermales las cuales
migran en los primeros 90 minutos después del estímulo, al ganglio linfático
sean las células encargadas de llevar el antígeno de la piel en una segunda
oleada y que esto permita la diferenciación y subsecuente polarización de los
linfocitos T CD4+ (Sen D PNAS 2010).
Estos resultados sugieren que la eficiente respuesta de células T CD4+
después de la inmunización en piel, requiere la presentación inicial del antígeno
por las CD del ganglio linfático de drenaje y posteriormente una segunda
presentacióo de células que lleguen en la primera hora después de
inmunización.
50
Conclusión
„
La inmunización intradérmica en la oreja del ratón, es más
eficiente que otras vías de inoculación.
„
La subunidad B de TC es capaz de inducir una respuesta
inmune eficiente, sin causar daño en el tejido que se administra y con
efectos superiores a otros adyuvantes utilizados.
„
La migración de las células dendríticas de la piel (dermales)
es fundamental para llevar a cabo la diferenciación a células T
productoras de citocinas y la consecuente respuesta inmune.
51
[1-49]BIBLIOGRAFIA
1
Agrawal, S., Agrawal, A., Doughty, B., Gerwitz, A., Blenis, J., Van
Dyke, T. and Pulendran, B., Cutting edge: different Toll-like receptor
agonists instruct dendritic cells to induce distinct Th responses via
differential modulation of extracellular signal-regulated kinase-mitogenactivated protein kinase and c-Fos. J Immunol 2003. 171: 4984-4989.
2
Allan, R. S., Smith, C. M., Belz, G. T., van Lint, A. L., Wakim, L. M.,
Heath, W. R. and Carbone, F. R., Epidermal viral immunity induced by
CD8alpha+ dendritic cells but not by Langerhans cells. Science 2003.
301: 1925-1928.
3
Bedoui, S., Whitney, P. G., Waithman, J., Eidsmo, L., Wakim, L.,
Caminschi, I., Allan, R. S., Wojtasiak, M., Shortman, K., Carbone, F.
R., Brooks, A. G. and Heath, W. R., Cross-presentation of viral and self
antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol 2009. 10:
488-495.
4
Bennett, C. L., van Rijn, E., Jung, S., Inaba, K., Steinman, R. M.,
Kapsenberg, M. L. and Clausen, B. E., Inducible ablation of mouse
Langerhans cells diminishes but fails to abrogate contact
hypersensitivity. J Cell Biol 2005. 169: 569-576.
5
Bosnjak, L., Miranda-Saksena, M., Koelle, D. M., Boadle, R. A.,
Jones, C. A. and Cunningham, A. L., Herpes simplex virus infection of
human dendritic cells induces apoptosis and allows cross-presentation
via uninfected dendritic cells. J Immunol 2005. 174: 2220-2227.
6
Bousso, P. and Robey, E., Dynamics of CD8+ T cell priming by
dendritic cells in intact lymph nodes. Nat Immunol 2003. 4: 579-585.
7
Braun, M. C., He, J., Wu, C. Y. and Kelsall, B. L., Cholera toxin
suppresses interleukin (IL)-12 production and IL-12 receptor beta1 and
beta2 chain expression. J Exp Med 1999. 189: 541-552.
8
Bursch, L. S., Wang, L., Igyarto, B., Kissenpfennig, A., Malissen, B.,
Kaplan, D. H. and Hogquist, K. A., Identification of a novel population
of Langerin+ dendritic cells. J Exp Med 2007. 204: 3147-3156.
9
Bynoe, M. S., Evans, J. T., Viret, C. and Janeway, C. A., Jr.,
Epicutaneous immunization with autoantigenic peptides induces T
suppressor cells that prevent experimental allergic encephalomyelitis.
Immunity 2003. 19: 317-328.
52
10
Cunningham, A. J. and Lafferty, K. J., A simple conservative
explanation of the H-2 restriction of interactions between lymphocytes.
Scand J Immunol 1977. 6: 1-6.
11
Elson, C. O. and Ealding, W., Cholera toxin feeding did not induce oral
tolerance in mice and abrogated oral tolerance to an unrelated protein
antigen. J Immunol 1984. 133: 2892-2897.
12
Ginhoux, F., Collin, M. P., Bogunovic, M., Abel, M., Leboeuf, M.,
Helft, J., Ochando, J., Kissenpfennig, A., Malissen, B., Grisotto, M.,
Snoeck, H., Randolph, G. and Merad, M., Blood-derived dermal
langerin+ dendritic cells survey the skin in the steady state. J Exp Med
2007. 204: 3133-3146.
13
Glenn, G. M., Scharton-Kersten, T., Vassell, R., Mallett, C. P., Hale, T.
L. and Alving, C. R., Transcutaneous immunization with cholera toxin
protects mice against lethal mucosal toxin challenge. J Immunol 1998.
161: 3211-3214.
14
Grouard, G., Rissoan, M. C., Filgueira, L., Durand, I., Banchereau, J.
and Liu, Y. J., The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic
cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. J Exp Med 1997. 185:
1101-1111.
15
Holmgren, J., Actions of cholera toxin and the prevention and treatment
of cholera. Nature 1981. 292: 413-417.
16
Holmgren, J., Lycke, N. and Czerkinsky, C., Cholera toxin and cholera
B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine
1993. 11: 1179-1184.
17
Kalinski, P., Hilkens, C. M., Wierenga, E. A. and Kapsenberg, M. L.,
T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept
of a third signal. Immunol Today 1999. 20: 561-567.
18
Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D. and
Shlomchik, M. J., Epidermal langerhans cell-deficient mice develop
enhanced contact hypersensitivity. Immunity 2005. 23: 611-620.
19
Kaplan, D. H., Kissenpfennig, A. and Clausen, B. E., Insights into
Langerhans cell function from Langerhans cell ablation models. Eur J
Immunol 2008. 38: 2369-2376.
20
Kissenpfennig, A., Henri, S., Dubois, B., Laplace-Builhe, C., Perrin,
P., Romani, N., Tripp, C. H., Douillard, P., Leserman, L., Kaiserlian,
D., Saeland, S., Davoust, J. and Malissen, B., Dynamics and function
of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node
53
areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity 2005.
22: 643-654.
21
Lavelle, E. C., McNeela, E., Armstrong, M. E., Leavy, O., Higgins, S.
C. and Mills, K. H., Cholera toxin promotes the induction of regulatory T
cells specific for bystander antigens by modulating dendritic cell
activation. J Immunol 2003. 171: 2384-2392.
22
Lee, J. B., Jang, J. E., Song, M. K. and Chang, J., Intranasal delivery
of cholera toxin induces th17-dominated T-cell response to bystander
antigens. PLoS One 2009. 4: e5190.
23
Lundie, R. J., de Koning-Ward, T. F., Davey, G. M., Nie, C. Q.,
Hansen, D. S., Lau, L. S., Mintern, J. D., Belz, G. T., Schofield, L.,
Carbone, F. R., Villadangos, J. A., Crabb, B. S. and Heath, W. R.,
Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to
parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic
cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2008. 105: 14509-14514.
24
Lycke, N. and Holmgren, J., Strong adjuvant properties of cholera toxin
on gut mucosal immune responses to orally presented antigens.
Immunology 1986. 59: 301-308.
25
Marinaro, M., Staats, H. F., Hiroi, T., Jackson, R. J., Coste, M.,
Boyaka, P. N., Okahashi, N., Yamamoto, M., Kiyono, H., Bluethmann,
H., Fujihashi, K. and McGhee, J. R., Mucosal adjuvant effect of cholera
toxin in mice results from induction of T helper 2 (Th2) cells and IL-4. J
Immunol 1995. 155: 4621-4629.
26
Mayerova, D., Parke, E. A., Bursch, L. S., Odumade, O. A. and
Hogquist, K. A., Langerhans cells activate naive self-antigen-specific
CD8 T cells in the steady state. Immunity 2004. 21: 391-400.
27
Mempel, T. R., Henrickson, S. E. and Von Andrian, U. H., T-cell
priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.
Nature 2004. 427: 154-159.
28
Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D. and Parker, I., T
cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior
and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A
2004. 101: 998-1003.
29
Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I. and Cahalan, M. D., Imaging the
single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph
nodes. J Exp Med 2004. 200: 847-856.
54
30
Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z. and Nickoloff, B. J., Skin
immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol 2009. 9: 679691.
31
Noordegraaf, M., Flacher, V., Stoitzner, P. and Clausen, B. E.,
Functional redundancy of Langerhans cells and Langerin+ dermal
dendritic cells in contact hypersensitivity. J Invest Dermatol. 130: 27522759.
32
Poulin, L. F., Henri, S., de Bovis, B., Devilard, E., Kissenpfennig, A.
and Malissen, B., The dermis contains langerin+ dendritic cells that
develop and function independently of epidermal Langerhans cells. J Exp
Med 2007. 204: 3119-3131.
33
Proietto, A. I., O'Keeffe, M., Gartlan, K., Wright, M. D., Shortman, K.,
Wu, L. and Lahoud, M. H., Differential production of inflammatory
chemokines by murine dendritic cell subsets. Immunobiology 2004. 209:
163-172.
34
Proksch, E., Brandner, J. M. and Jensen, J. M., The skin: an
indispensable barrier. Exp Dermatol 2008. 17: 1063-1072.
35
Pulendran, B. and Ahmed, R., Translating innate immunity into
immunological memory: implications for vaccine development. Cell 2006.
124: 849-863.
36
Ryan, E. J., McNeela, E., Pizza, M., Rappuoli, R., O'Neill, L. and Mills,
K. H., Modulation of innate and acquired immune responses by
Escherichia coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflammatory
effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J Immunol
2000. 165: 5750-5759.
37
Schaffeler, M. P., Brokenshire, J. S. and Snider, D. P., Detection of
precursor Th cells in mesenteric lymph nodes after oral immunization
with protein antigen and cholera toxin. Int Immunol 1997. 9: 1555-1562.
38
Schuler, G., Schuler-Thurner, B. and Steinman, R. M., The use of
dendritic cells in cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol 2003. 15:
138-147.
39
Schuler-Thurner, B., Schultz, E. S., Berger, T. G., Weinlich, G.,
Ebner, S., Woerl, P., Bender, A., Feuerstein, B., Fritsch, P. O.,
Romani, N. and Schuler, G., Rapid induction of tumor-specific type 1 T
helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature,
cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J Exp
Med 2002. 195: 1279-1288.
55
40
Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I. and Cahalan, M. D.,
Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and
Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proc Natl Acad
Sci U S A. 107: 8334-8339.
41
Simecka, J. W., Jackson, R. J., Kiyono, H. and McGhee, J. R.,
Mucosally induced immunoglobulin E-associated inflammation in the
respiratory tract. Infect Immun 2000. 68: 672-679.
42
Stoitzner, P., Green, L. K., Jung, J. Y., Price, K. M., Tripp, C. H.,
Malissen, B., Kissenpfennig, A., Hermans, I. F. and Ronchese, F.,
Tumor immunotherapy by epicutaneous immunization requires
langerhans cells. J Immunol 2008. 180: 1991-1998.
43
Stoitzner, P., Tripp, C. H., Eberhart, A., Price, K. M., Jung, J. Y.,
Bursch, L., Ronchese, F. and Romani, N., Langerhans cells crosspresent antigen derived from skin. Proc Natl Acad Sci U S A 2006. 103:
7783-7788.
44
Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R. and Strobel, S.,
Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous
immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2
response. Eur J Immunol 2004. 34: 2100-2109.
45
Vogt, A., Mahe, B., Costagliola, D., Bonduelle, O., Hadam, S.,
Schaefer, G., Schaefer, H., Katlama, C., Sterry, W., Autran, B.,
Blume-Peytavi, U. and Combadiere, B., Transcutaneous anti-influenza
vaccination promotes both CD4 and CD8 T cell immune responses in
humans. J Immunol 2008. 180: 1482-1489.
46
Vremec, D., Pooley, J., Hochrein, H., Wu, L. and Shortman, K., CD4
and CD8 expression by dendritic cell subtypes in mouse thymus and
spleen. J Immunol 2000. 164: 2978-2986.
47
Wang, L., Bursch, L. S., Kissenpfennig, A., Malissen, B., Jameson,
S. C. and Hogquist, K. A., Langerin expressing cells promote skin
immune responses under defined conditions. J Immunol 2008. 180:
4722-4727.
48
Xu-Amano, J., Kiyono, H., Jackson, R. J., Staats, H. F., Fujihashi, K.,
Burrows, P. D., Elson, C. O., Pillai, S. and McGhee, J. R., Helper T
cell subsets for immunoglobulin A responses: oral immunization with
tetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells
in mucosa associated tissues. J Exp Med 1993. 178: 1309-1320.
56
49
Yamamoto, S., Kiyono, H., Yamamoto, M., Imaoka, K., Fujihashi, K.,
Van Ginkel, F. W., Noda, M., Takeda, Y. and McGhee, J. R., A
nontoxic mutant of cholera toxin elicits Th2-type responses for enhanced
mucosal immunity. Proc Natl Acad Sci U S A 1997. 94: 5267-5272.
50
Yanagita, M., Hiroi, T., Kitagaki, N., Hamada, S., Ito, H. O.,
Shimauchi, H., Murakami, S., Okada, H. and Kiyono, H.,
Nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (NALT) immunity:
fimbriae-specific Th1 and Th2 cell-regulated IgA responses for the
inhibition of bacterial attachment to epithelial cells and subsequent
inflammatory cytokine production. J Immunol 1999. 162: 3559-3565.
57