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Urología Experimental e Investigación
Arch. Esp. Urol., 57, 7 (671-677), 2004
ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN vhl EN EL CARCINOMA DE CÉLULAS RENALES DE APARICIÓN ESPORÁDICA.
José Miguel Giménez Bachs, Antonio Salinas Sánchez, Juan Lorenzo Romero, Francisco
Sánchez Sánchez1, María José Donate Moreno, Dolores García Olmo2, Julio Escribano
Martínez1 y Julio Virseda Rodríguez.
Servicio de Urología. Complejo Hospitalario Universitario de Albacete. Albacete.
Área de Genética1. Facultad de Medicina de Albacete. Universidad de Castilla-La Mancha.
Unidad de Investigación2. Complejo Hospitalario Universitario de Albacete. España.
Resumen.- OBJETIVO: Determinar mutaciones en el
gen vhl y caracterizar las mismas en muestras de tejido
tumoral de 30 pacientes intervenidos por carcinoma
renal de células claras en nuestro servicio.
MÉTODO: Estudio descriptivo observacional y analítico sobre 30 pacientes intervenidos por CCR, que analiza la secuencia del gen vhl del tejido tumoral y se usa
como control tejido renal sano de los mismos pacientes.
Los tejidos fueron sometidos a procesos de extracción
de ADN, amplificación de los 3 exones que conforman
el gen mediante PCR y posterior secuenciación automática de los exones amplificados entre cebadores
intrónicos diseñados previamente. La secuencia se compara con la de los correspondientes exones incluidos
en GenBank. Las alteraciones fueron corroboradas
mediante secuenciación en dirección opuesta.
RESULTADOS: Se han encontrado un total de 9 mutaciones (30%) en las distintas muestras tumorales analizadas. 7 de ellas fueron puntuales, siendo una de ellas
intrónica; las otras dos mutaciones halladas consistieron
en deleciones. Las mutaciones se repartieron entre los
tres exones de la siguiente manera: 3 en exón 1, 4 en
exón 2, 1 en exón 3 y 1 intrónica. En una misma muestra se hallaron 2 mutaciones. El tejido control está libre
de alteraciones.
CONCLUSIÓN: El CCR esporádico presenta mutaciones en el gen vhl, que aparecen fundamentalmente en
el subtipo de células claras. Dichas alteraciones dan
lugar a graves perturbaciones en la proteína, alterando
su función supresora tumoral.
Correspondencia
Palabras clave: Carcinoma de células renales.
Gen vhl. Mutación.
José Miguel Giménez Bachs
C/ Salamanca, 4. 5º dcha.
02001 Albacete. (España)
e-mail: [email protected]
Trabajo recibido: 1 de marzo 2004
Summary.- OBJECTIVES: To assess and characterize
mutations in the vhl gene in tumor tissue samples from
30 patients undergoing surgery for renal cell carcinoma
in our department.
METHODS: Descriptive, observational and analytical
study of 30 patients undergoing surgery for RCC, analyzing the vhl gene sequence in tumor tissue, and using
healthy renal tissue from the same patients as controls.
Tissues were processed by DNA extraction, PCR amplification of the three exons that conform the gene, and
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J. M. Giménez Bachs, A. Salinas Sánchez, J. Lorenzo Romero y cols.
ulterior automatic sequence analysis of the amplified
exons between intronic primers previously designed.
The sequence is compared with the corresponding
exons included in the GeneBank. Alterations were
checked by backwards sequence analysis.
RESULTS: 9 mutations (30%) were found in the tumoral
samples analyzed. 7 of them were punctual (one of
them intronic); the other two were deletions. Mutations
were distributed among the three exons: 3 in exon 1, 4
in exon 2, 1 in exon 3 and 1 intronic. One of the
samples showed 2 mutations. Control tissue was free of
mutations.
CONCLUSIONS: Sporadic RCC shows mutations in
the vhl gene which mainly appear in the clear cell
subtype. Such alterations result in severe disturbances
in the protein, disturbing its tumor suppressing function.
Keywords: Renal cell carcinoma. Vhl gene.
Mutation
INTRODUCCIÓN.
El carcinoma de células renales (CCR) constituye el tumor maligno más frecuente del riñón en el
adulto y supone aproximadamente un 3% de todos los
tumores. En España, el carcinoma renal representa el
2,9% de los tumores del varón y el 1,7% en la mujer.
Se diagnostican alrededor de 2.000 nuevos casos
anuales, con una incidencia de 4,1 a 4,5 cada
100.000 habitantes / año. La tasa de incidencia
estandarizada por edad es de 1,9-8,8 por 100.000
habitantes, para mujeres y hombres, respectivamente
(1, 2).
Al igual que se ha producido un incremento
de la incidencia de cáncer renal, también lo ha hecho
la mortalidad, de forma paulatina, en todos los grupos
étnicos y por sexos. Aunque la proporción de diagnóstico de tumores avanzados ha decrecido, la tasa de
mortalidad se ha visto afectada de forma negativa,
quizá debido a un cambio en los factores de riesgo
implicados, tales como el tabaco, dieta o exposición a
diferentes carcinógenos (3, 4, 5).
En España, una tasa de mortalidad según
sexo de 1,1-2,8 por 100.000 habitantes hace que el
carcinoma renal sea el responsable de más de 800
fallecimientos anuales (6).
A pesar de diversos factores descritos como
factores de riesgo de padecer CCR, la etiopatogenia
de este tipo de tumores está todavía por establecerse,
y en los últimos años se ha precisado de la ayuda de
estudios a nivel molecular para clasificar los subtipos
de CCR, así como su implicación pronóstica (7, 8).
En el estudio genético del CCR se ha visto que
el brazo corto del cromosoma 3 (3p) existen alteraciones con frecuencia. En esta localización se encuentra
el gen vhl o gen del enfermedad de von Hippel-Lindau
(síndrome hereditario caracterizado por la aparición
de tumores y quistes en diversos órganos como riñón,
páncreas, cerebro y retina) (9, 10). Dicho gen se estableció como gen supresor tumoral o antioncogen, al
ver que seguía el modelo de “los dos golpes” propuesto por Knudson (11).
Han sido descritas alteraciones genéticas del
gen vhl en la enfermedad de von Hippel-Lindau y estudios recientes encuentran alteraciones a este nivel en
los cánceres renales de aparición esporádica.
El presente estudio pretende analizar el estado
del gen vhl en tejido tumoral de pacientes sometidos a
nefrectomía (parcial o radical) por CCR, y describir las
mutaciones halladas en dicho gen, estimando la posible repercusión sobre la función de la proteína.
MATERIAL Y MÉTODO.
Estudio descriptivo, transversal y analítico
sobre 30 pacientes sometidos a nefrectomía (parcial o
radical) en nuestro Servicio por CCR. De los especímenes intraoperatorios, previo consentimiento informado, se obtuvo tejido tumoral en fresco para su procesamiento, así como tejido renal sano adyacente al
tumor, que se utilizó como control. Hasta su análisis
fueron congelados a –80ºC.
Se obtuvieron de las historias clínicas los
datos sociodemográficos y clínicos necesarios para
completar el estudio.
Extracción de ADN.- El ADN fue aislado de
las muestras siguiendo las instrucciones del
QIAmp®DNA MiniKit de QIAGEN® (Barcelona,
España), previa digestión con proteinasa K.
Amplificación mediante Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR).- El ADN extraído fue sometido a PCR para amplificar por separado cada uno de
los 3 exones (o regiones codificantes) que forman el
gen vhl. Para ello se utilizaron como cebadores unas
secuencias de oligonucleótidos contenidas en los intrones para obtener la totalidad del exón (Tabla I). En el
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ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN vhl EN EL CARCINOMA DE CÉLULAS RENALES DE APARICIÓN ESPORÁDICA.
Exón
1
Dirección
Secuencia de nucleótidos
Tª hibridación
Tamaño del
(ºC)
exón (pb)
5’ ➝ 3’
CGTTCCATCCTCTACCGAGC
65,8
3’ ➝ 5’
CCTGCTATCGTGCCAGACTT
65,1
Intraexónico
CTTCAGGGCGCTACTCTTCG
65,4
5’ ➝ 3’
CACCGGTGTGGCTCTTTAAC
64,3
3’ ➝ 5’
CCAACAACACCATTCATGTCC
58,4
5’ ➝ 3’
GACCCTAGTCTGTCACTGAGG
60,3
3’ ➝ 5’
CCATGACTACTCAGAACTAG
53,2
340
3’ ➝ 5’
2
3
179
123
TABLA I. CEBADORES UTILIZADOS EN LA PCR.
exón 1 se diseñó un cebador intraexónico, ya que la
longitud de mismo no permitía la correcta secuenciación del exón completo. Una vez realizada la PCR y
testada en un gel de agarosa tras electroforesis (Figura
1), se procedió a purificación de la misma, mediante
un proceso de purificación por sales.
Secuenciación automática.- El producto de
PCR fue sometido a una reacción de secuenciación,
utilizando el kit de secuenciación BigDye® Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kit. Tras la reacción se procede a un proceso de precipitado, y, tras resuspensión en
formamida, se coloca en el secuenciador automático
FIGURA 1. Gel de agarosa donde se muestra el producto de PCR de cada uno de los exones del gen vhl.
Abi Prism®310 Genetic Analyzer de Applied
Byosistems®, realizándose la secuenciación según el
método de electroforesis capilar.
Tras el análisis de la muestra por el secuenciador, obtenemos un electroforetograma, es decir, la
secuencia del ADN problema según ha detectado el
secuenciador. Los electroforetogramas son analizados
y comparados con el de una muestra control y con la
secuencia original del gen obtenida en GenBank.
Las mutaciones encontradas fueron secuenciadas tanto en sentido 5’ como 3’ del exón para la
corroboración de su existencia. Para considerar una
alteración encontrada en un electroforetograma como
mutación debía estar presente en las dos direcciones.
RESULTADOS.
La edad media de los pacientes fue de 62,4
años (DE: 9,57, Rango: 34-79), de los cuales el 60%
(18/30) eran varones y el 40% mujeres. Todos ellos
fueron diagnosticados de tumor renal y sometidos a
cirugía exerética de la masa renal, bien realizándose
nefrectomía radical (56,7%), cirugía conservadora de
parénquima renal (40%) y en un caso (3,3%) laparotomía exploradora de una masa renal irresecable de
la que únicamente se tomó biopsia para caracterización histológica del tumor.
Las características anatomopatológicas de los
tumores se exponen en la Figura 2, siendo la mayoría
CCR subtipo de células claras, y el resto se repartió
entre CCR papilar (uno de ellos con patrón mixto con
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J. M. Giménez Bachs, A. Salinas Sánchez, J. Lorenzo Romero y cols.
presentaron ninguna alteración en la secuenciación
realizada como control. En la Figura 4 se muestra un
electroforetograma con una de las mutaciones encontradas y el electroforetograma de la muestra control.
FIGURA 2. Anatomía patológica de las muestras estudiadas.
En la Tabla II se muestran las mutaciones junto
con algunas de las características clínicas del tumor y
del paciente.
DISCUSIÓN.
células claras), cromófobo y con diferenciación sarcomatoide. El grado nuclear de los tumores fue clasificado siguiendo el sistema de graduación de Fuhrman
(12), encontrándose un 6,7% grado 1, un 56,7% de
tumores grado 2, un 23,3% grado 3, y un 13,3%
grado 4. El tamaño tumoral fue menor de 4cm. en el
30% de los casos, entre 4 y 7 cm. en el 40% y mayor
de 7 cm. en el 30% restante.
El estadio patológico según la clasificación
TNM (13) se especifica en la Figura 3.
Se encontraron un total de 9 mutaciones
(30%) en las distintas muestras tumorales analizadas.
7 de ellas fueron puntuales, siendo una de ellas intrónica; las otras dos mutaciones halladas consistieron en
deleciones. Las mutaciones se repartieron entre los tres
exones de la siguiente manera: 3 en exón 1, 4 en exón
2 y 1 en exón 3. La mutación restante se halló en la
porción intrónica contenida en los fragmentos de
amplificación del exón 2. En una misma muestra se
hallaron 2 mutaciones. Se realizó secuenciación de los
exones en ambas direcciones para la comprobación
de la alteración encontrada. Las muestras control no
FIGURA 3. TNM.
Dentro de los genes implicados en la genética
del cáncer, el gen vhl está considerado como gen
supresor tumoral. (14). Se localiza en el brazo corto
del cromosoma 3, en el locus 3p25-26 del genoma
humano, contiene tres exones (o secuencias codificantes de ADN), y codifica una proteína de 213 aminoácidos con un peso molecular de 28-30 kDa (15, 16).
Entre las funciones que ejerce la proteína VHL,
reside el control de la elongación trancripcional al
unirse a otras proteínas conocidas como elonginas
(17); regulación de la producción de ciertos péptidos
relacionados con la neoangiogénesis (factor de crecimiento del endotelio vascular y eritropoyetina) (18);
formación de matriz extracelular adecuada para
diversas funciones celulares, para lo que se une a la
fibronectina; y, regulación de otros factores de crecimiento tumoral (19).
La aparición de alteraciones del gen vhl en la
enfermedad de von Hippel-Lindau es un hecho descri-
FIGURA 4. Electroforetogramas de una muestra mutada y de su control donde se muestra el cambio de
aminoácido producido.
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ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN vhl EN EL CARCINOMA DE CÉLULAS RENALES DE APARICIÓN ESPORÁDICA.
to y que acontece en prácticamente el 100% de las
familias afectadas por esta enfermedad (20). En los
últimos años, y con el objeto de llegar a una aproximación de las características moleculares del CCR, se
ha estudiado la aparición de alteraciones genéticas
del gen vhl a nivel de los tumores renales de aparición
esporádica. Así se han encontrado con frecuencia
alteraciones tales como la pérdida de heterocigosidad
y la hipermetilación de dicho gen en los CCR esporádicos (21).
La presencia de mutaciones en el gen vhl en
los tumores renales esporádicos es otra de las posibilidades patogénicas a nivel molecular. Las alteraciones
a nivel del gen van a traducirse en una proteina defectuosa, de manera que las funciones alteradas de la
proteina VHL permiten, entre otras cosas, la neoangiogénesis, aun en condiciones subóptimas de oxígeno, lo
que da lugar al crecimiento de masas tumorales ricas
en vascularización, característica frecuente en el cáncer renal (17, 18, 19).
En el presente estudio encontramos 9 mutaciones del gen vhl, todas ellas sobre CCR de células
claras, excepto en un caso con histología mixta (células claras y papilar). Parece demostrado que la aparición de eventos mutacionales del gen vhl es exclusivo
de los subtipos histológicos no papilares (22), sin
embargo, algunos tumores tienen morfología papilar
pero con un componente celular de células claras (23),
por lo que se puede comprender la aparición de mutaciones en estos tumores.
Las mutaciones se suelen agrupar en los exones 2 y 3 y en la última porción del exón 1 (24). En
nuestro estudio ocurre algo similar, las alteraciones
halladas se han localizado en exon 2 prioritariamente
y de las 3 encontradas en el exón 1, 2 se localizaron
al final de dicho exón, excepto una que se presentó en
la parte media del mismo. La mutación intrónica constituye un hallazgo casual, al tener los fragmentos de
PCR pequeñas porciones intrónicas. Probablemente se
trate de un polimorfismo, aunque en cualquier caso no
genera cambios funcionales en el producto proteico.
La frecuencia de aparición de mutaciones en
el gen vhl ronda el 50% en la literatura consultada (21,
22, 25). En el presente estudio no encontramos con un
porcentaje algo menor (30%), y quizá el hecho de confirmar las mutaciones encontradas mediante secuenciación en el sentido opuesto, hace que, los posibles
errores del secuenciador sean detectados al examinar
la secuencia complementaria, rechazando lo que en
un principio podían parecernos mutaciones. Además
sólo se ha hecho análisis mutacional, ya que la aparición de otras alteraciones genéticas parecen ser más
frecuentes y avalar la implicación de este gen en la
carcinogénesis renal.
TABLA II. CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES.
Muestra
Sexo
Mutaciones
Edad
Exón
Tipo
Codón
Cambio
A.P
Estadio
Fuhrman
1
/
61
1
del 16 nts.
90
Trunc.
CC
I
2
3
?
49
2
CxA
119
Phe x Leu
Mixto
I
2
4
?
69
1
del 8 nts.
111
Trunc.
2
GxC
120
Arg x Thr
CC
III
4
6
?
60
3
CxA
179
Asp x Glu
CC
I
2
8
?
71
2
GxA
117
Trp x STOP
CC
IV
3
12
/
66
1
CxG
65
Ser x Trp
CC
I
1
16
?
70
2
GxT
137
Val x Gly
CC
I
2
20
/
59
Intrón
GxC
nt 5355
-
CC
I
2
nts: nucleótidos; Trunc: proteina truncada; CC: células claras.
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J. M. Giménez Bachs, A. Salinas Sánchez, J. Lorenzo Romero y cols.
Las mutaciones que aparecen en el gen vhl en
casos de carcinoma renal familiar (enfermedad VHL)
son, habitualmente, puntuales (20). Sin embargo, en
las alteraciones que aparecen en los tumores esporádicos, encontramos eventos más complejos, como
deleciones e inserciones, además de mutaciones puntuales que pueden dar lugar a un codón de parada,
con la consecuente aparición de una proteína truncada, es decir, sin funcionalismo. De igual forma, las
deleciones cambian la pauta normal de lectura del gen
en su codificación, dando lugar también a la formación de proteínas truncadas. En nuestro estudio hemos
hallado dos deleciones y un cambio puntual que da
lugar a un codón de parada, lo que supone que un tercio de las mutaciones encontradas dan lugar a una
“catástrofe” molecular a nivel de la proteína.
En el presente trabajo nos encontramos ante
dos casos de mutaciones en tumores con alto grado
nuclear y/o estadio patológico; además, en estos dos
casos el resultado fue de proteina truncada, presentaron uno de ellos dos mutaciones. No obstante, no
parece haber una relación directa entre la presencia
de mutaciones y un estadio o grado nuclear más avanzado (26). Esto parece ser así también en nuestro estudio, ya que encontramos mutaciones tanto en tumores
con estadios precoces y grado nuclear bajo como en
otros tumores en fases avanzadas. Teniendo en cuenta
esto, y sin pasar por alto que, en los últimos años, el
diagnóstico de los tumores renales se produce de
manera precoz y la mayoría de las veces incidentalmente (27), podemos considerar que las mutaciones
que se producen en el gen vhl son un evento que se
produce de manera precoz en la patogénesis del CCR,
es decir, un primer paso en la transformación tisular de
los tejidos normales en tumorales (26).
En conclusión, la aparición de mutaciones en
el gen vhl en el carcinoma de células renales de aparición esporádica es un hecho cada vez más comprobado, aunque no existen estudios concluyentes acerca
del papel que estas mutaciones juegan en la génesis
de este tipo de tumores. Sin embargo, se puede afirmar que son alteraciones que aparecen exclusivamente en el subtipo histológico no papilar, fundamentalmente en carcinomas de células claras, que no guardan relación con las características clínico-patológicas
del tumor y que en ocasiones, la traducción de estas
mutaciones generan cambios muy importantes en la
proteína, alterando gravemente su función.
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