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Probióticos y lactancia materna Juan Miguel Rodríguez Gómez Dpto. Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos Universidad Complutense de Madrid ¡Somos superorganismos! 2003 10-100 veces más células bacterianas que células humanas CUERPO HUMANO Nuestros genes bacterianos: MICROBIOMA 100 veces más genes funcionales en el microbioma que en el genoma humano • Metabolismo Glicanos Aminoácidos Lípidos Xenobióticos Metanogénesis Biosíntesis de vitaminas • Protección contra patógenos Exclusión competitiva Antimicrobianos • Maduración sistema inmunitario • Inmunomodulación • Neuromodulación •… - = + = Leche Humana Es una fuente continua de bacterias lácticas y bifidobacterias para el intestino del lactante (colonización del intestino del recién nacido) Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Enterococcus Weissella Pediococcus Bifidobacterium <103 ufc/ml Mamíferos Asociadas a lactancia Hábitat: mucosas Martín et al., 2003; 2004; 2005; 2006a; 2006b; 2007a; 2007b; 2009 diversidad bacteriana ¿cómo llegan a la glándula mamaria? ¿qué funciones biológicas tienen? ¿qué sucede en situaciones especiales? Diversidad bacteriana en leche humana >15.000 aislados 50 géneros 200 especies Nuevas especies Streptococcus lactarius Staphylococcus epidermidis Staphylococcus hominis Staphylococcus caprae Streptococcus salivarius Streptococcus mitis Streptococcus parasanguinis Lactobacillus gasseri Lactobacillus fermentum Lactobacillus salivarius Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus crispatus Lactobacillus reuteri Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc garlicum Leuconostoc citreum Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve Probióticos Concepto científico ≠ Concepto comercial Importancia del concepto “cepa” -coccus: MALOS Lactobacillus & Bifidobacterium: BUENOS Funciones de la microbiota mamaria Producción sustancias bioactivas (poliaminas, vitaminas, péptidos, CLA, AGCC, EPS,…) Maduración sistema inmunitario (Th0, TGF-β) Conexión inmunidad innata-adquirida Base de efectos probióticos Exclusión competitiva patógenos Consumo oxígeno (Condiciones adecuadas Para pmicrobiota intestinal tras destete) Inducción síntesis de mucinas Origen de las bacterias en la glándula mamaria Zonas de oclusión Lamina propia Enterocitos Mucus Luz Bacterias M cell Célula dendrítica Célula M Bacteria Célula dendrítica Migración GU R Placenta Circulación sanguínea Conducto torácico GS/GL PROSAFE Lactobacilos 125/485 sangre humana (16 especies Lactobacillus) GLM Ruta enteromamaria Jiménez et al. 2005. Curr Microbiol., 51: 270 GML PP Intestino ¿sucede en humanos? Administración oral lactobacilos conduce a su presencia en leche humana ¿Posible aplicación en mastitis? • Agudas (S. aureus) • Clínicas • Subagudas/crónicas (S. epidermidis; S. mitis…) • Subclínicas (S. epidermidis; S. mitis…) ¡Sucede en mujeres!: mastitis MRSA-MRSE Biofilms ¿Qué hacer? Alternativas • Probióticos • Nuevos antibióticos • Fagos • Citoquinas y afines Criterios selección bacterias probióticas (FAO/OMS, 2002) Identificación (cepa) Historia (GRAS, QPS) Seguridad DIANA: MASTITIS Supervivencia TGI Inhibición Staph/Strep Interacción CDs Translocación (CD/Mφ) Biomasa Estabilidad Vida útil Coste Ensayos in vitro Animales Estudios humanos Ensayos in vitro Animales ENSAYOS CLÍNICOS EFICACIA (Dosis, posología) DIANA: MASTITIS ¿probiótico eficaz para mastitis? Lactobacilos y bifidobacterias de la leche humana: ¿efectos probióticos? Lactobacillus fermentum Lactobacillus salivarius Lactobacillus gasseri Bifidobacterium breve • LOS EFECTOS PROBIÓTICOS SON ESPECÍFICOS DE CADA CEPA (diana, dosis, forma de administración, hospedador) Ensayo clínico “piloto” Lactobacilos de leche humana: Ensayo mastitis 20 mujeres Mastitis Estafilococos>104 ufc/ml Antibioterapia ineficaz Grupo A: Lb. gasseri CECT5714 Lb. salivarius CECT5713 ~1 × 1010 cfu 4 semanas Grupo B (Placebo): excipiente 4 semanas Muestra de leche (0, 7, 14, 28) Estafilococos y lactobacilos Revisión médica Probióticos: Segundo ensayo (n=352) ClinicalTrials.gov NCT00716183 Comité Ética HCM Síntomas mastitis Recuento > 104 ufc mL-1 Sin otra patología 352 mujeres GRUPO A GRUPO B GRUPO C L. fermentum L. salivarius Antibiótico n = 101 (29%) CECT5716 ~2 × 109 ufc n = 124 (35%) CECT5713 ~2 × 109 ufc n = 127 Genomas (36%) secuenciaciados 3 semanas • Muestra de leche (días 0 y 21) • Cuestionario • Evolución sintomatología Efectividad de probióticos aislados de leche materna frente a antibióticos para el tratamiento de las mastitis lactacionales L. fermentum CECT5716, grupo A (n=124) L. salivarius CECT5713, grupo B (n=127) Antibiótico, grupo C (n=101) 1 Bacterias totales en leche (log10 ufc/mL) 5 2 1 0 4 2 100 80 60 40 20 (dolor muy intenso) (sin dolor) 10 4 3 6 8 6 4 2 (dolor muy intenso) 100 Lactobacilos en leche (% de mujeres) 2 Síntomas clínicos 3 8 Lactobacilos en leche (% de mujeres) 4 0 Después del tratamiento (3 semanas) (sin dolor) 10 Síntomas clínicos Antes de empezar el tratamiento Bacterias totales en leche (log10 ufc/mL) 5 80 60 40 20 Sonda Lb. gasseri (A) 3 Sonda Lb. salivarius (B) 1 2 4 5 1 6 3 7 PFGE 8 9 2 10 Lb. salivarius 4 5 6 8 9 10 Lb. gasseri 7 Complete genome sequence of Lactobacillus salivarius CECT 5713, a probiotic strain isolated from human milk and infant feces. Jiménez E, Martín R, Maldonado A, Martín V, Gómez de Segura A, Fernández L, Rodríguez JM. J Bacteriol. 2010 Oct;192(19):5266-7. Complete genome sequence of Lactobacillus fermentum CECT 5716, a probiotic strain isolated from human milk. Jiménez E, Langa S, Martín V, Arroyo R, Martín R, Fernández L, Rodríguez JM. J Bacteriol. 2010 Sep;192(18):4800. • Seguridad • Mecanismos de acción Estudio proyecto Consolíder FUN-C-FOOD 3 grupos: A) Mastitis + probiótico B) Sanas + probiótico C) Sanas sin probiótico n= 15 mujeres/grupo Duración: 21 días Muestras (días 0 y 21): Madres: Sangre Leche Orina Heces Lb. salivarius PS2 Hijos: Heces Muestras: sangre Sangre Bioquímica/ Hematología estándar (Laboratorio Análisis Clínicos) Aislamiento células mononucleares Aislamiento mRNA (concentración, pureza) Transcriptómica PCR - Microarrays (POLYPHEN, Parque Científico UCM) Suero Citoquinas Inmunoglobulinas Plasma RMN GR Perfil lipídico (BIOLIPID) Parámetros relacionados con actividad antioxidante: capacidad antioxidante total; grupos SH plasmáticos; malondialdehído; isoprostano; grupos carbonilo proteicos; óxido nítrico. (FUN-UVEG) Muestras: leche Leche Extracción manual (2 ml) DNA Recuento Análisis células microbiológico Medios de somáticas + cultivo composición Q-RT-PCR células (grupos somáticas bacterianos) Recuento Identificación Meta-gemómica (??) Extracción manual/bomba (20 ml) 4 ml 8 ml Citoquinas Inmunoglobulinas Aislamiento mRNA (concentración, pureza) Perfil minerales (K, Na, Cl…) Proteómica?? Parque Científico UCM Pirosecuenciación (Life Sequencing) Transcriptómica PCR - Microarrays (POLYPHEN, Parque Científico UCM) 6 ml Lactosa Grasa Proteínas 2 ml RMN Perfil lipídico (BIOLIPID) Oligosacáridos Muestras: orina y heces Orina Bioquímica estándar (Laboratorio Análisis Clínicos) Transcriptomics? RNA (HIT Chip)? Heces (madre + hijo) RMN Agua fecal Metabolitos (METABOLOMICS) RMN + SCFAs Análisis microbiológico Medios de cultivo DNA Q-RT-PCR (grupos bacterianos) Recuento + Identificación [Metagenómica?] PCR-DGGE? Valorar: Citoquinas Inmunoglobulinas Modulación microbiota infantil Transmisión por la leche PROBIÓTICO Vía vaginal Modulación microbiota infantil ¿Modulación microbiota “fetal”? Vía oral ¿Transmisión durante el parto? Modulación microbiota glándula mamaria ¿Transmisión por la placenta? Modulación microbiota aparato digestivo Modulación microbiota vaginal ... ProbiSearch CONCLUSIONES • Gran potencial • Oportunidades investigación (básica-clínica) ¡Muchas gracias!