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Introducción a la terapia génica
Curso de Genética Molecular
Ciencias Biológicas
Universidad de Jaén
TERAPIA GÉNICA
Introducción de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en
células para alterar su expresión génica con fines terapéuticos.
No se incluye el transplante de médula ósea o de hígado.
Dos tipos principales de terapia génica:
Somática: Introducción de ADN en células no reproductivas,
puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia
del organismo tratado.
Germinal: Introducción de ADN en células reproductivas.
Modifica el patrimonio genético de la especie y puede ser
transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenientes
éticos aunque en animales (ratones) está muy desarrollada
(knock-outs y transgénicos).
TERAPIA GÉNICA
Tipos de terapia génica
Reemplazar
un
gen
defectuoso
(cirugía
genética),
enfermedades hereditarias monogénicas.
1. Manipulación para aumentar la expresión de genes
(citocinas, etc.)
2. Reducir la expresión de un gen potencialmente dañino
(oligonucleótidos antisentido)
3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales,
antibióticos, patógenos, etc.)
TERAPIA GÉNICA
Tipos de problemas tratables por terapia génica
1. Enfermedades heredables (fibrosis quística,
etc.)
2. Enfermedades adquiribles
Infecciosas (virus, bacterias, parásitos)
Cáncer
Arteriosclerosis
Etc.
TERAPIA GÉNICA
Métodos de introducción de ADN
Transfección:
Físicos: Biolística (genegun), electroporación
Químicos: Lipidos catiónicos, fosfato cálcico,
polímeros, etc.
Biológicos: ADN unido a ligandos de receptores
de membrana expresados en células diana
Transducción: dependientes de virus
Retrovirus
Adenovirus
Virus Adeno-Asociados (AAV)
Herpesvirus
TERAPIA GÉNICA
Tipos de reparto del ADN
EX VIVO:
Paciente no está directamente expuesto al sistema
de transferencia génica.
Posibilidad de monitorizar la expresión del transgen
Trabajo sobre poblaciones de células específicas
IN SITU:
ADN dirigido directamente a un órgano o tumor
IN VIVO:
ADN introducido directamente a través de la sangre
Protocolos de terapia génica aprobados
Crecimiento de la terapia génica
1988 - 2000
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Protocolos de terapia génica aprobados
Progresión de ensayos clínicos
sobre terapia génica
300
250
200
150
100
50
0
Phase I
Phase I-II
Phase II
Phase III
Esquema estructura de los retrovirus
Esquema ciclo de vida de los retrovirus
Producción de retrovirus defectivos para terapia génica
Problemas de los retrovirus en terapia génica
ƒSe ha observado la desconexión de los genes a las pocas
semanas de la introducción. Posiblemente por metilación. El
cambio de promotores puede aliviar este problema.
ƒPosibilidad de integración aleatoria que desrregule o inactive
genes celulares imprescindibles.
ƒDificultad para infectar células quiescentes (cerebro, hígado).
ƒBaja eficacia de transducción viral en tejidos vivos.
ƒLimitación a 7-7,5 Kb
Citocinas necesarias para la
hematopoyesis
IL-2,4,6,7,10,13,14,15
Línea linfoide
Linfocitos B
IL-2,4,6,7,9,12,15
Linfocitos T
IL-2,12,15
IL-3
célula
madre
Natural Killer
Células maduras
(TPO)/IL-11
Stem Cell
Factor(SCF),
IL-3
GM-CSF
G-CSF/GM-CSF
CFU-GEMM
Línea mieloide
EPO
CFUs
Plaquetas
Monocitos
Polimorfos
G.Rojos
Células maduras
Varios receptores de factores de
crecimiento contienen la cadena γ común
IL-2R
IL-2
IL-15R
IL-7R
IL-15
T
B
NK
IL-4
IL-7
γC
T
B
IL-9R
IL-9
γC
γC
T
B
NK
IL-4R
γC
γC
T
B
T
Terapia génica para X-SCID
Y vector retroviral
cadena
γ común
médula ósea
co-cultivo
inserción en el paciente
gen expresado en las
células precursoras
desarrollo correcto de
linfocitos B y NK
cocultivo
células madre
reconstitución
de un sistema inmune
funcional
Inmunodeficiencia combinadad severa ligada
al cromosoma X
1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes
oportunísticas. Los niños suelen tener infecciones típicas del
SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin
tratamiento es mortal en el 100% de los casos
2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutación en
la cadena γ común del los receptores de citocinas, el gen está
situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de
1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de
linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros
no funcionales.
3. La única terapia curativa es el transplante de médula. Este
sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idéntico.
4. La cirugía genética es potencialmente curativa
Resultados terapia génica para X-SCID : qué pasa con
los niveles de expresión del transgén?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
Detección del ARNm de la cadena γC mediante RT-PCR
Resultados terapia génica para X-SCID : qué pasa con los niveles
de linfocitos?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
Paciente 1
Paciente 2
Niveles cuantificados por citometría de flujo
Resultados terapia génica para X-SCID : beneficios clínicos
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
IL-2
IL-15
γC
IL-7
γC
IL-4
γC
IL-9
γC
γC
“As a likely consequence of development and sustained function of the immune
system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted
diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions
disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now
at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any
treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side
effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third
patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these
patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte
progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK
lymphocytes.”
Virus de ADN utilizados en terapia génica
Adenovirus:
Potencialmente patogénicos
Común en terapia génica in situ
Insertos de ADN grandes (35Kb)
Amplio espectro de células diana
Puede transducir células quiescentes
En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml)
Problemas: Inmunogénicos y expresión transitoria (3 semanas)
AAV:
Virus humanos no patogénicos
Sitio de integración preferente (Cromos. 19)
Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz
Sólo permite insertos de 5 Kb
No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente
Terapia génica 2003
Problemas
1. A los 10 años de la aprobación del primer estudio de terapia génica más de 4000
pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido
beneficios clínicos definitivos.
2. Hace un par de años murió un paciente después de un tratamiento de terapia
génica
3. Algunos ensayos clínicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte
de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA.
4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia
Promesas
1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia
génica
2. Avances en la biología molecular y los sistemas de transferencia génica
acelerarán el uso de la terapia génica.