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Introducción a la terapia génica Curso de Genética Molecular Ciencias Biológicas Universidad de Jaén TERAPIA GÉNICA Introducción de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en células para alterar su expresión génica con fines terapéuticos. No se incluye el transplante de médula ósea o de hígado. Dos tipos principales de terapia génica: Somática: Introducción de ADN en células no reproductivas, puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia del organismo tratado. Germinal: Introducción de ADN en células reproductivas. Modifica el patrimonio genético de la especie y puede ser transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenientes éticos aunque en animales (ratones) está muy desarrollada (knock-outs y transgénicos). TERAPIA GÉNICA Tipos de terapia génica Reemplazar un gen defectuoso (cirugía genética), enfermedades hereditarias monogénicas. 1. Manipulación para aumentar la expresión de genes (citocinas, etc.) 2. Reducir la expresión de un gen potencialmente dañino (oligonucleótidos antisentido) 3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales, antibióticos, patógenos, etc.) TERAPIA GÉNICA Tipos de problemas tratables por terapia génica 1. Enfermedades heredables (fibrosis quística, etc.) 2. Enfermedades adquiribles Infecciosas (virus, bacterias, parásitos) Cáncer Arteriosclerosis Etc. TERAPIA GÉNICA Métodos de introducción de ADN Transfección: Físicos: Biolística (genegun), electroporación Químicos: Lipidos catiónicos, fosfato cálcico, polímeros, etc. Biológicos: ADN unido a ligandos de receptores de membrana expresados en células diana Transducción: dependientes de virus Retrovirus Adenovirus Virus Adeno-Asociados (AAV) Herpesvirus TERAPIA GÉNICA Tipos de reparto del ADN EX VIVO: Paciente no está directamente expuesto al sistema de transferencia génica. Posibilidad de monitorizar la expresión del transgen Trabajo sobre poblaciones de células específicas IN SITU: ADN dirigido directamente a un órgano o tumor IN VIVO: ADN introducido directamente a través de la sangre Protocolos de terapia génica aprobados Crecimiento de la terapia génica 1988 - 2000 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Protocolos de terapia génica aprobados Progresión de ensayos clínicos sobre terapia génica 300 250 200 150 100 50 0 Phase I Phase I-II Phase II Phase III Esquema estructura de los retrovirus Esquema ciclo de vida de los retrovirus Producción de retrovirus defectivos para terapia génica Problemas de los retrovirus en terapia génica Se ha observado la desconexión de los genes a las pocas semanas de la introducción. Posiblemente por metilación. El cambio de promotores puede aliviar este problema. Posibilidad de integración aleatoria que desrregule o inactive genes celulares imprescindibles. Dificultad para infectar células quiescentes (cerebro, hígado). Baja eficacia de transducción viral en tejidos vivos. Limitación a 7-7,5 Kb Citocinas necesarias para la hematopoyesis IL-2,4,6,7,10,13,14,15 Línea linfoide Linfocitos B IL-2,4,6,7,9,12,15 Linfocitos T IL-2,12,15 IL-3 célula madre Natural Killer Células maduras (TPO)/IL-11 Stem Cell Factor(SCF), IL-3 GM-CSF G-CSF/GM-CSF CFU-GEMM Línea mieloide EPO CFUs Plaquetas Monocitos Polimorfos G.Rojos Células maduras Varios receptores de factores de crecimiento contienen la cadena γ común IL-2R IL-2 IL-15R IL-7R IL-15 T B NK IL-4 IL-7 γC T B IL-9R IL-9 γC γC T B NK IL-4R γC γC T B T Terapia génica para X-SCID Y vector retroviral cadena γ común médula ósea co-cultivo inserción en el paciente gen expresado en las células precursoras desarrollo correcto de linfocitos B y NK cocultivo células madre reconstitución de un sistema inmune funcional Inmunodeficiencia combinadad severa ligada al cromosoma X 1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes oportunísticas. Los niños suelen tener infecciones típicas del SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin tratamiento es mortal en el 100% de los casos 2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutación en la cadena γ común del los receptores de citocinas, el gen está situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de 1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros no funcionales. 3. La única terapia curativa es el transplante de médula. Este sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idéntico. 4. La cirugía genética es potencialmente curativa Resultados terapia génica para X-SCID : qué pasa con los niveles de expresión del transgén? M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71 Detección del ARNm de la cadena γC mediante RT-PCR Resultados terapia génica para X-SCID : qué pasa con los niveles de linfocitos? M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71 Paciente 1 Paciente 2 Niveles cuantificados por citometría de flujo Resultados terapia génica para X-SCID : beneficios clínicos M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71 IL-2 IL-15 γC IL-7 γC IL-4 γC IL-9 γC γC “As a likely consequence of development and sustained function of the immune system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK lymphocytes.” Virus de ADN utilizados en terapia génica Adenovirus: Potencialmente patogénicos Común en terapia génica in situ Insertos de ADN grandes (35Kb) Amplio espectro de células diana Puede transducir células quiescentes En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml) Problemas: Inmunogénicos y expresión transitoria (3 semanas) AAV: Virus humanos no patogénicos Sitio de integración preferente (Cromos. 19) Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz Sólo permite insertos de 5 Kb No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente Terapia génica 2003 Problemas 1. A los 10 años de la aprobación del primer estudio de terapia génica más de 4000 pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido beneficios clínicos definitivos. 2. Hace un par de años murió un paciente después de un tratamiento de terapia génica 3. Algunos ensayos clínicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA. 4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia Promesas 1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia génica 2. Avances en la biología molecular y los sistemas de transferencia génica acelerarán el uso de la terapia génica.